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1、吐鲁番黑羊吐鲁番黑羊MC1RMC1R 基因序列分析研究基因序列分析研究 於建国1，陈 童1，刘明军2 （1.新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830000；2.新疆畜牧科学院绵羊研究中心，乌鲁木齐 830000）摘摘 要：要：为研究黑皮质素受体1（MC1R）基因对吐鲁番黑山羊毛色的影响，实验采用PCR扩增和测序技术，对吐鲁番黑羊MC1R基因编码区核苷酸序列及其与毛色的相关性进行了研究。研究结果表明：MC1R基因编码区核苷酸序列954bp，编码317个氨基酸，编码区存在2个错义突变(c.218 TA,p.73 MetLys；c.361 GA,p.121 AspAsn)和3个同义突变(c.429
2、 CT,p.143 TyrTyr；c.600 TG,p.200 LeuLeu；c.735 CT,p.245 IleIle)。SNPs分析单倍型AATGT数量占62%，初步认为MC1R基因可以作为吐鲁番黑羊黑色被毛调控的候选基因。关键词：关键词：吐鲁番黑羊；MC1R；SNPs；候选基因 中图分类号：中图分类号：S826.2 S826.2 文献标志码：文献标志码：A 文章编号：文章编号：2095-3887（2014）00-0000-00 吐鲁番黑羊也称托克逊大尾黑羊，是由当地农牧民通过引进巴音布鲁克羊和哈萨克羊、卡拉库尔羊进行杂交，长期选育而培育出的肉用型地方品种。托克逊县为其主产区，目前存栏在2
3、O余万只，占吐鲁番黑羊的9O%。周岁种公羊体重44.06kg，成年种公羊体重46.38kg，周岁与成年公羊体重相差很小。吐鲁番黑羊被腰平直，十字部高于耆甲部，头稍长，鼻梁微隆起，耳下垂，少数有不发达的角。四肢粗壮，尾肥大，被毛黑色。具有生长迅速、四肢粗壮、早熟、肉味鲜美等特点。其遗传特征基本稳定，深受当地群众喜爱1。哺乳动物的毛色类型很多，已有的研究结果表明，真黑色素和褐黑色素两种基本黑色素的合成受E(extension)和A(agouti)基因座位控制。E座位编码的黑素皮质素受体1(MC1R)是G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor)家族中最小的受体，只有一个编
4、码区，其编码的蛋白质有7个跨膜结构域，主要表达于动物的黑色素细胞。它与a-促黑色素细胞激素(a-MSH)作用，对酪氨酸酶进行调控，进而调控黑色素的形成。黑素皮质素受体1(melanocortin 1 receptor，MC1R)基因研究起步较早，但在绵羊上开展的研究相对较少，国内在绵羊毛色方面开展MC1R基因的相关研究报道也不多2-7。本研究以吐鲁番黑羊为研究材料，分析黑素皮质素受体1(MC1R)基因与吐鲁番黑羊毛色性状的相关，为更好地开发利用吐鲁番黑羊这一特 收稿日期：2014-04-26 基金项目：新疆自治区科研院所基本科研业务费项目任务“青年人才基础性研究培育项目”作者简介：於建国（19
5、77-），男，助理研究员，硕士。通讯作者：刘明军（1964-），男，研究员，博士。研究方向：分子生物学。殊的毛色绵羊遗传资源提供理论依据。1 1 材料与方法材料与方法 1.1 样本采集及DNA的提取 在托克逊县吐鲁番黑羊原产地用真空采血管采集纯种吐鲁番黑羊血液样品60份，每个样品采集2mL，肝素钠抗凝，低温带回实验室-20保存。采用全血DNA提取试剂盒提取基因组DNA。1.2 PCR扩增 MClR基因扩增引物根据GenBank中收录的绵羊序列Y13965，用Primer 5.0软件进行引物设计。引物序列：F:GAGAGCAAGCACCCTTTCCT,R:GAGAGTCCTGTGATTCCCCT
6、，由上海生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应总体积25 L，其中：Buffer 3 L，dDNTP 2 L，上下游引物各1 L，Taq酶 1U，DNA模板1 L,灭菌去离子水补足到25 L。PCR反应扩增条件：94，3min；94 30s，6230s，7245s（35个循环），7210min，4保存。采用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，选择目的条带清晰的PCR样品送博迈德生物公司进行测序。应用Chromas、Dnaman等软件进行序列拼接、同源性分析以及进化树的建立。2 2 结果与分析结果与分析 2.1 MClR2.1 MClR基因序列基因序列PCRPCR扩增结果扩增结果 对吐鲁番黑羊MClR
7、基因进行PCR扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明MClR基因扩增产物在1000bp近上方有一条特异性条带，与预期结果相同。见图1。注：M，DL2000 marker；1-6:MClR基因PCR产物 图1 MClR基因序列PCR产物电泳结果 2.2 MClR基因核苷酸序列基因核苷酸序列 吐鲁番黑羊MClR基因PCR扩增产物经测序获得1124bp核苷酸序列，开放阅读框（ORF）长954bp，编码317个氨基酸。在编码区存在2个错义突变(c.218 TA,p.73 MetLys；c.361 GA,p.121 AspAsn)和3个同义突变(c.429 CT,p.143 TyrTyr；c.60
8、0 TG,p.200 LeuLeu；c.735 CT,p.245 IleIle)。见图2。图2 吐鲁番黑羊MClR基因单碱基突变位点 2.3 吐鲁番黑羊吐鲁番黑羊MClR基因基因SNPs 测序结果显示吐鲁番黑羊毛色基因MC1R在编码区核苷酸存在218 TA,361 GA,429 CT,600 TG,735 CT颠换与转换。由表1可知，吐鲁番黑羊MClR基因存在3种单倍型，其中TGCTC型有5只，占8%；TGTGT型有18只，占30%；AATGT型有37只，占62%。表1 吐鲁番黑羊MClR基因单倍型频率 3 3 讨论讨论 哺乳动物的MC1R基因与皮肤色素沉积、被毛颜色密切相关，该基因主要在毛囊
9、和皮肤黑素细胞中表达，MC1R基因通过控制真黑色素数量来决定动物的毛色。当MC1R受到-促黑色素细胞激素（a-MSH）的刺激时就会通过激活酪氨酸酶产生真黑色素,使动物毛色表现为黑色。在MC1R功能丧失或MC1R受到与其拮抗的Agouti蛋白抑制时，酪氨酸酶不能被激活而保持较低活性，造成真黑色素被稀释，出现棕色或红色等较浅的毛色性状。绵羊的MC1R基因位于14号染色体，由单一外显子基因，相比ASIP等其他毛色基因研究的较多。MC1R基因主要有3个等位基因（E+、ED和e）在编码区发生碱基突变导致被毛颜色发生变化。本研究发现218bp（TA）和361bp（GA）两处碱基突变导致M73K和D121N
10、氨基酸变化，这两处突变在黑色美利奴、卡拉库尔羊等绵羊品种中也有发现，M73K和D121N单独或共同作用于绵羊黑色被毛性状，即等位基因ED引起绵羊被毛出现黑色性状。李洪涛等8（2013）的研究结果发现MClR基因PM73K项目 单倍型 TGCTC TGTGT AATGT 数量/只 5 18 37 比例/%8 30 62 位点变化与哈萨克羊被毛的颜色变化相关，MC1R基因是控制哈萨克绵羊被毛颜色的主效基因。本研究结果显示：MC1R基因在编码区核苷酸存在218 TA,361 GA,429 CT,600 TG,735 CT颠换与转换，其中218bp（TA）和361bp（GA）2处发生颠换转换数量最多，
11、AATGT单倍型比例占达62%。由218bp（TA）和361bp（GA）2处位点突变引起氨基酸73（MetLys）和121（AspAsn）发生错义突变，此结果与李洪涛等研究绵羊毛色基因MC1R在黑色被毛基因调控的机理相吻合。MC1R基因核苷酸序列中单倍型TGCTC、TGTGT、AATGT分别占8%、30%、62%，结果与Guang-Li Yang等在研究岷县黑羊的研究结果相一致。4 结论 MC1R基因编码区核苷酸序列长954bp，编码317个氨基酸，编码区存在2个错义突变(c.218 TA,p.73 MetLys.c.361 GA,p.121 AspAsn)和3个同义突变(c.429 CT,p
12、.143 TyrTyr;c.600 TG,p.200 LeuLeu.c.735 CT,p.245 IleIle)。SNPs分析单倍型AATGT数量占62%，初步认为MC1R基因可以作为吐鲁番黑羊黑色被毛调控的候选基因。参考文献参考文献 1阿斯娅买买提,买买提伊明巴拉提孙,努尔比亚木萨吾提,等.吐鲁番黑羊种公羊体质量、体尺参数的研究J.河南农业科学,2013,42(1):125-128.2Guang-Li Yang,Dong-Li Fu,Xia Lang,et a1.Mutations in MC1R Gene Determine Black Coat Color Phenotype in Ch
13、inese SheepJ.The Scientific World Journal，2013（1）：675382-675389.3D Hepp,G L，Gonalves G R P.Identification of the e allele at the extension locus(MC1R)in Brazilian Creole sheep and its role in wool color variationJ.Genetics and Molecular Research,2012,11(3):2997-3006.4李鹏飞,董常生,杜海燕,等.黑色素皮质素受体1(MC1R)基因与
14、哺乳动物毛色J.畜牧兽医杂志,2006，25(1):21-22.5甘海云,李建斌,王红梅,等.黑素皮质激素受体1基因与牛的毛色J.家畜生态学报,2007,28(3):99-102.6于云柱,何奕多,刘丽,等.黑素皮质素受体1(MC1R)基因的研究进展J.中国畜牧兽医 2010,37(6):232-233.7唐懿挺,钟红梅,姬秋梅,等.牦牛MClR基因的克隆测序及其分析研究J.生物技术通报,2011,6:88-93.8李洪涛,曾献存,张文祥,等.哈萨克绵羊MClR和ASIP基因多态性及表达量与被毛颜色表型相关性的研究J.畜牧兽医学报,2013,44(3):366-375.AnalysisAnal
15、ysis of of Turpan black sheepTurpan black sheep using using MC1MC1R R SequencesSequences Yu Jian-guo1，Chen Tong1，Liu Ming-jun2（1.Xinjiang Academy of Animal Sciences,Urumqi 830000,China;2.Xinjiang Academy of Biotechnological Center,Urumqi 830000,China）Abstract:Abstract:To study the effects of melanoc
16、ortin receptor 1(MC1R)on the wool colour in Turpan black sheep,used PCR amplification and sequencing techniques to study the coding region nucleotide sequence of MC1R gene of Turpan black sheep and its correlation with the wool colour.The results showed that:The coding region nucleotide sequence of
17、MC1R gene was 954bp,encoding 317 amino acids,there were two missense mutations(c.218 TA,p.73 MetLys;c.361 GA,p.121 AspAsn)and three silent mutations(c.429 CT,p.143 TyrTyr;c.600 TG,p.200 LeuLeu;c.735 CT,p.245 IleIle)in the coding region.Analysis of SNPs haplotype of AATGT accounted for 62%,suggested that the MC1R gene can be used as the candidate gene in regulating the black wool of Turpan black sheep.Key wordsKey words：Turpan black sheep;MC1R;SNPs;Candidate genes