《L_谷氨酰胺产生菌的选育和代谢流量分析.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《L_谷氨酰胺产生菌的选育和代谢流量分析.pdf（5页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、的提取工艺条件下测得核桃仁内隔膜中总黄酮含量为 6.430%。3.2 该方法较简单、快速、稳定,并且实验结果为核桃仁内隔膜的综合利用提供了实验依据。因此,可作为测定核桃仁内隔膜总黄酮含量的一种方法。核桃仁内隔膜中黄酮类物质含量丰富,具有较大的开发利用价值。参考文献:1 陈勤,李磊珂,吴耀.核桃仁的成分与药理研究进展 J.安徽大学学报:自然科学版,2005,29(1):86-89.2 谢宗万.全国中草药汇编(上册)M.3 版.北京:人民卫生出版社,1996:667-668.3 买合布白#阿不都热依木,艾克白尔,库尔班尼莎,等.心草中总黄酮含量的测定及其提取工艺研究 J.生物技术,2007,17(
2、4):67-69.4 郑春英,李宏涛,陆欣媛,等.五味子叶中总黄酮最佳提取工艺的研究 J.食品科学,2007,28(5):139-141.5 刘森.中草药成分提取分离与制剂加工新技术新工艺新标准实用手册M.北京:中国教育出版社,2004:69-184.L-谷氨酰胺产生菌的选育和代谢流量分析刘春辉,张伟国*(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡 214122)摘要:目的:建立并完善嗜乙酰乙酸棒杆菌 YL012 及其突变株 LCHA0082 合成 L-谷氨酰胺的中心代谢网络。方法:分别测定了它们在特定培养时段(48h 50h)L-谷氨酰胺等代谢物的胞外浓度,由此计算这一时段这些代谢物
3、在发酵液中积累(或消耗)的速率,分别作出这两株菌在拟稳态下的代谢流量分布图,进而研究诱变育种过程中不同诱变标记对代谢网络中 L-谷氨酰胺合成流量分布的影响。结果:育种操作使流量分配朝着有利于 L-谷氨酰胺合成的方向改变,流入谷氨酸节点的流量由291198mmol P L#h上升到 44.854mmolP L#h,提高到原来的 1.5 倍左右,合成 L-谷氨酰胺的流量由 18.138mmolP L#h 上升 至311065mmol P L#h,效果明显。结论:从代谢流量分析角度上,证明诱变育种对代谢流量的改变起到明显的作用,代谢流量分析也为新的设计育种提供了思路。关键词:嗜乙酰乙酸棒杆菌;L-谷
4、氨酰胺;诱变育种;发酵;代谢流分析中图分类号:TQ922+.9 文献标识码:A 文章编号:1004-311X(2009)04-0063-05Breeding of L-Glutamine Producer and Its Metabolic Flux AnalysisLIU Chun-hui,ZHANG Wei-guo*(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)Abstract:Objective:Inthis paper,
5、the center metabolic networks of Corynebacterium acetoacidophilum YL012 and its mutant LCHA0082were es-tablished and modified.Method:The concentrations of extra-cellular metaboliteswere determined under sub-steady-state(48 h-50 h)in thebatch culture.The metabolic flux distributionmaps of the two str
6、ains were obtained and compared after the accumulation(or consumption)rates ofthese metabolites were measured in the broth inthe specific time.Result:These results indicate that the breeding process skew the metabolic fluxtowards the formation of L-glutamine obviously,The flow to node of glutamate i
7、ncreased from 29.198 mmol PL#h to 44.854mmolP L#h,about 115times of the original;The flow to L-glutamine synthesis changed from 18.138mmolP L#hto 31.065 mmol P L#h,the effect was significant.Conclu-sion:This study revealed the usefulness of breeding process towards existing productionstrains after t
8、he metabolic flux analysis as a tool.The analy-sis may play an important role in helping us to rationally re-design metabolism for further improvement of fermentation process.Key words:Corynebacterium acetoacidophilum;L-glutamine;breeding;fermentation;metabolic flux analysis收稿日期:2009-02-01;修回日期:2009
9、-02-27作者简介:刘春辉(1984-),男,东营市人,硕士生,研究方向:氨基酸菌种选育;*通讯作者:张伟国(1963-),男,博士生导师,教授,研究方向:工 业微 生 物菌 种 选 育、生物 能 源和 生 物 新材 料,Email:liuchunhui-lang 。L-谷氨酰胺(L-Glutamine)是 L-谷氨酸C-羧基酰胺化的一种氨基酸,作为 20 种构成蛋白质的基本氨基酸之一,在生物体代谢中起着举足轻重的作用,具有许多特殊的功能,被归类为条件必需氨基酸 1-3。目前国外临床上主要将它应用于治疗精神萎靡、酒精中毒及胃和十二指肠溃疡等疾病。另外它还具有增进神经机能,改善脑出血后的记忆障
10、碍,促进智力不佳儿童的智力发展,防止癫痫发作等功能,是一种极有发展前途的新药4-6。代谢流量分析(metabolic flux analysis,MFA)7代谢工程中用以指导遗传操作和代谢网络分析的基本方法。这种分析方法根据胞内主要反应的化学计量模型和胞内代谢产物的质量平衡来计算胞内的代谢流量。它的基础是拟稳态假设8假设在产物形成速率最快的阶段各种中间代谢物的胞内浓度变化速率为 0。根据质量平衡由 n 个中间代谢物即可得到 n 个关于速率的方程,通过测定胞外代谢产物的浓度,计算未知途径的流量9-11得到胞内代谢流的分布模式。本文通过NTG 诱变的方法,由出发菌株嗜乙酰乙酸棒杆菌YL012(MS
11、OR)得到其带有遗 传标记的突变株 LCHA0082(MSOR,SGR,(NH4)2SO4R,SucG,NaFR)。而后建立并比较两株菌的代谢网络,研究了遗传标记对代谢流量的影响。并根据流量分布为以后的设计代谢提供了参考。嗜乙酰乙酸棒杆菌进行谷氨酰胺发酵代谢流分析方面尚未见相关报道。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料嗜乙 酰 乙 酸 棒 杆 菌(Corynebacterium acetoacidophilum)YL012,本实验室保藏。1.1.2 试剂葡萄糖(食品级):蚌埠柠檬酸厂;玉米浆(工业级):无锡酶制剂厂;(NH4)2SO4(工业级):鹰潭生物化学制品厂;丙酮、甲醇(分析纯
12、),L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸(生化试剂):中国医药集团上海化学试剂公司。1.1.3 仪器电子天平,Mettle 公司;超净工作台,苏净集团安泰公司;往复式摇床,无锡查桥轻机厂;电热恒温培养箱、电热鼓风干燥箱,上海跃进医疗器械厂;GSP-77-03 磁力搅拌器,江苏泰县姜埝无线电厂;立式圆形压力蒸汽灭菌器,上海医用核子仪器厂;TGL-16G 高速台式离心机,上海医用仪器分析厂;高效液相色谱仪 HP1100,惠普公司。1.1.4 培养基(1)完全培养基:葡萄糖 5g P L,蛋白胨 10
13、g PL,牛肉膏 10g PL,NaCl 5gP L,琼脂 25g PL,pH 7.0。(2)基本培养基:葡萄糖 20g PL,(NH4)2SO41.5g PL,KH2PO41g P L,K2HPO43g P L,MgSO4#7H2O 0.1g P L,MnSO4#4H2O 0.01g PL,FeSO4#7H2O 0.01g P L,尿素 1.5gP L,生物素 30Lg PL,硫胺素#HCl100LgP L,琼脂 20g PL,pH 7.0。(3)摇 瓶种 子培 养基:葡萄 糖 20g PL,(NH4)2SO45g PL,632009 年 19(4)生 物 技 术 KH2PO41g PL,M
14、gSO4#7H2O 0.5gP L,玉米浆3g P L,CaCO310g P L,pH7.0。(4)摇瓶发酵培养基:葡萄糖 130g PL,(NH4)2SO455g P L,KH2PO41.2,MgSO4#7H2O 0.6,MnSO4#4H2O 0.003,FeSO4#7H2O0.005,ZnSO4#7H2O 0.006,CaCO325g P L pH 7.5。基本培养基、完全培养基和种子培养基均在 0.1MPa 压力下灭菌 20min,发酵培养基在 0.07MPa 压力下灭菌 8min。1.2 方法1.2.1 L-谷氨酰胺测定:纸层析、茚三酮显色比色定量法及氨基酸自动分析仪。1.2.2 L-
15、谷氨酸测定:SBA-40 型生物传感器(山东省科学院生物研究所)。1.2.3 菌体浓度测定121.2.4 还原糖测定:菲林试剂法 13。1.2.5 有机酸测定81.2.6 氨基酸测定:氨基酸自动分析仪。2 结果与讨论2.1 L-谷氨酰胺代谢网络的相关说明分析L-谷氨酰胺的生物合成途径可知,首先,L-谷氨酰胺的合成需要碳源,碳源由葡萄糖(Glc)提供,然后葡萄糖经EMP 途径降解为 L-谷氨酰胺合成所需的前体碳单位丙酮酸(PYR);部分葡萄糖经磷酸戊糖(HMP)途径氧化以提供还原力。葡萄糖(Glc)的运输和消耗是在磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)磷酸转移酶系统(PEP-linked phosphotr
16、ansferase system,简称 PTS)催化下的集团运输14,15。Glc+PEPy PYR+G6P(1)以葡萄糖为氮源时乙醛酸支路活性很低,故可以不考虑乙醛酸途径;谷氨酰胺(GLN)的的合成:GLU+NH4+ATPy GLN(2)菌体生长过程中,铵根离子主要由谷氨酸脱氢酶固定,所以铵根例子由前体 A-酮戊二酸(A-KG)、谷氨酸(Glu)和NADPH 代替:A-KG+NH4+H2O+NADPHy GLU+NADP(3)谷氨酸(GLU)合成:在NH4+浓度极低的情况下(4)占优势,但由于摇瓶谷氨酰胺发酵 NH4+充足,所以直接按照(2)反应,不按(4)反应。A-KG+GLN+NADPH
17、y 2GLU+NADP(4)还原力NADPH 的补给:对于包括 L-谷氨酰胺在内的一般代谢产物的合成,如果胞内存在转氢酶,由于转氢酶可逆催化NAD H 和NADPH 之间氢的转移反应,可将 L-谷氨酰胺合成总反应所净得的 NADH 转化为还原力 NADPH 用以供应NADPH。如(5)所示。NADPH+NADy NADP+NADH(5)如果胞内不存在转氢酶,即便是反应过程中能够额外生成NADH,它还是无法转化为还原力 NADPH,那么就需要由额外的葡萄糖经磷酸戊糖(HMP)途径氧化以提供更多的还原力,HMP 途径总化学计量关系:G6Py 6CO2+12NADPH(6)根据以上原则建立了 L-谷
18、氨酰胺合成的代谢网络模型,如图 2A 所示2.2 L-谷氨酰胺形成阶段各菌株的胞外代谢产物浓度的测定从L-谷氨酰胺的生物合成的代谢网络分析可知,L-谷氨酰胺的碳架物质、能量及还原力主要由葡萄糖经中心代谢途径后提供。所以,本研究主要考虑了与 L-谷氨酰胺合成的中心代谢途径:EMP 途径和 TCA 循环以及 HMP 途径(主要用来提供还原力NADPH);又由氨基酸分析数据得到,L-谷氨酰胺发酵过程中同时产生了多种氨基酸,所以还要考虑包括甘氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸及赖氨酸的合成途径;同时,考虑了有机酸的合成途径,丙酮酸(PYR)是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化而来的,
19、为了考察葡萄糖经 EMP 途径降解后,PEP 和 PYR 在代谢过程中的流量分配,所以考虑丙酮酸的代谢途径;乳酸和乙酸在有机酸合成网络中与丙酮酸直接相关,所以也被考查。由 YL012 及其突变株 LCHA0082 的发酵过程曲线可以看出,菌体生长在 48h 56h 生长缓慢,56h 左右细胞生长已进入非生长期,48h 50h 内 L-谷氨酰胺生成速度达到最大,可以认为 48h 50h时间内,细胞内处于拟稳态即各种代谢物的胞内积累为 0;因此,分别测定发酵进行到 48h 和50h的出发菌株及其突变株的胞外代谢产物浓度,研究它们在 L-谷氨酰胺形成阶段的代谢流分布。图 1A 出发菌株 YL012
20、的发酵过程曲线Fig.1A The fermentation course curve of strain YL012图 1B YL012 突变株的发酵过程曲线Fig.1B The fermentation course curve of mutant strain LCHA0082表 1 列出了出发菌株 YL012 及其突变株 LCHA0082 分别发酵到 48h 和 50h 发酵液中的还原糖、氨基酸和有机酸等的胞外浓度。根据表 1 所示数据,按下式计算代谢产物积累速率,结果见表 2。V=(C50h-C48h)1000 P2MW其中,V 为底物消耗速率或代谢产物积累速率,单位为mmol PL
21、#h;C48h、C50h分别为发酵进行到 48h 和 50h 时代谢产物的胞外浓度;MW 为对应代谢产物的分子量。2.3 L-谷氨酰胺形成阶段各菌株的代谢流量分配的计算设 V1、V2、V3,V14分别为图 2A 所示途径的代谢流量,64 生 物 技 术 2009年 19(4)假定L-谷氨酰胺形成阶段代谢处于拟稳态,此时各种中间代谢产物的累积速率为 0,由质量平衡得:表 1 YL012 菌株及其突变株 LCHA0082发酵到 48h 和 50h 时各代谢产物浓度Table 1 The various metabolites concentration of YL012 and its mutan
22、t strainLCHA0082 during 48h and 50h代谢物(metabolite)time(h)YL012(gP L)LCHA0082(gP L)葡萄糖(Glc)4839.00943.646(180.0)5037.01040.503谷氨酰胺(Gln)4820.69124.100(146.2)5020.98624.766酪氨酸(Tyr)486.4436.374(181.2)506.4536.388甘氨酸(Gly)486.4866.531(75.1)506.5316.541异亮氨酸(Ile)4815.23612.389(131.2)5015.30612.587缬氨酸(Val)48
23、3.0113.803(117.1)503.0913.900丙氨酸(Ala)488.9108.903(89.1)508.9218.919苯丙氨酸(Phe)4813.07513.057(165.2)5013.14713.075亮氨酸(Leu)4816.50614.746(131.2)5016.61714.887赖氨酸(Lys)4818.67116.019(146.2)5018.86216.276丙酮酸(Pyr)480.2090.052(88.1)500.2120.053脯氨酸(Pro)4812.06514.067(115.1)5012.17714.277精氨酸(Arg)488.6048.552(1
24、74.2)508.6488.617乳酸(Lac)485.9809.683(90.1)506.0409.810乙酸(Ac)480.2550.152(60.1)500.2750.188注:括号内数字表示代谢产物的分子量。Note:The moleculerweight of compounds mark in bracket.表 2 YL012 菌株及其突变株 LCHA0082发酵到 48h 和 50h 时各代谢产物的速率Table 2 AccumulatingP Consuming velocity of YL012 and its mutant strainLCHA0082 during 48
25、h and 50h代谢物(metabolite)YL012YL012*LCHA0082LC HA0082*葡萄糖(Glc)5.556100.0008.731100.000谷氨酰胺(Gln)1.00818.1382.27626.065酪氨酸(Tyr)0.0280.5040.0390.447甘氨酸(Gly)0.3155.6700.0670.767异亮氨酸(Ile)0.5329.5690.5748.639缬氨酸(Val)0.3416.1430.4144.742丙氨酸(Ala)0.0621.1160.0911.042苯丙氨酸(Phe)0.2193.9400.0540.618亮氨酸(Leu)0.4237
26、.6210.4274.891赖氨酸(Lys)0.65411.7960.87810.056丙酮酸(Pyr)1.03 10-20.1865.70 10-30.065脯氨酸(Pro)0.4878.7740.91212.941精氨酸(Arg)0.1272.2860.2222.543乳酸(Lac)0.3335.9910.7068.085乙酸(AC)0.1662.9940.2993.425注:表中所有代谢物的速率为 mmolP L#h,葡萄糖代谢速率为消耗速率;*为将葡萄糖的消耗速率计为 100。Note:Unit of velocity of the exocelluar metabolites ism
27、mol P L#h.*:Assuming thatconsuming velocity of the glucose is 100mmolP L#h.V1=V2+V3+V4+V5+V6+V7+V8+V9+V10+V11+V12+V13+V14+VPYR根据图 2A 中的数量关系可以计算出嗜乙酰乙酸棒杆菌YL012 菌株及其突变株 LCHA0082的代谢流量分布图,将葡萄糖的消耗速率计为 100(表 2 所示),从而得到各菌株的流量分布图,如图 2B和图 2C所示。图 2A 代谢流量的计算网络图Fig.2A Calculation of metabolic flux map图 2B 出发菌株YL
28、012 代谢流量分布图Fig.2B Metabolic flux distribution map of YL0122.4 出发菌株 YL012 与其突变株 LCHA0082 代谢流分析结果比较在代谢网络中,将两个或多个不同途径的分支汇合点称为节点。由图 2可知,两株菌相比,L-谷氨酰胺合成网络多个节点处的流量进行了重新分配。产物的最终产量是各种中间代谢物分支点处流量分配和合成酶系酶活调节的综合结果,所以流量的的改变也会直接影响产物产量的改变。本文根据图 2 中YL012 与LCHA0082 各途径的代谢流量,652009 年 19(4)生 物 技 术 着重对影响L-谷氨酰胺合成的三个主要节点
29、丙酮酸(PYR)、谷氨酸(GLU)、天冬氨酸(ASP)处的流量分配变化进行分析和比较。图 2C YL012突变株 LCHA0082 的代谢流量分布图Fig.2C Metabolic flux distribution map of LCHA00822.4.1 丙酮酸(PYR)节点处的流量分析丙酮酸除了流入 TCA 循环,还参与丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、乳酸和乙酸等杂酸的合成,所以丙酮酸节点处的流量分布比较复杂,它的流向比较多。从两株菌的流量分布图可看到流入丙酮酸的流量分别是 74.614 和 85.799,流量有了很大的变化,LCHA0082带有 SGR的标记,SG 抗性可以增强能量代谢,使细
30、胞内的 ATP 含量增高,从而使得EMP 途径的中心代谢途径的流量都有所增加;还有可能诱变后 LCHA0082的耐高糖能力较YL012有所上升,但也有文献报道 SG 抗性对糖的耐受性影响不大。从图 2B 和图 2C 可以看出,有丙酮酸向丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的流量有所下降;进入TCA 循环的流量由 50.563 升至63.549,这与 SGR、SucG都有关:前者增强能量代谢,后者能通过增加草酰乙酸的供应强化了三羧酸循环。但是厌氧有机酸产物乳酸 和乙酸却都有上升,分别由 5.991、2.994 变为81085和 3.425,因此在发酵过程中必须严格控制溶氧水平,调节TCA 循环和厌氧产物的代
31、谢流量。2.4.2 谷氨酸(GLU)节点处的流量分析谷氨酸是谷氨酰胺合成的前体物质,它的流量分配直接关系到积累谷氨酰胺的量,所以谷氨酸节点是谷氨酰胺合成代谢分析中最重要的节点。由图 2 可以看出流入谷氨酸节点的流量由 29.198 上升到 44.854,提高到原来的 1.5 倍左右。这和 Suc 为惟一碳源的筛选有关,也由于 LCHA0082 带有氟化钠(NaF)抗性标记强化了三羧酸循环中从柠檬酸到A-酮戊二酸的代谢,对于快速合成谷氨酸比较有利。谷氨酸流量增加,直接引起谷氨酰胺、脯氨酸以及精氨酸的流量也相应提高,其中目的产物谷氨酰胺由 18.138上升至 31.065 最为明显,原因有二:一是
32、前提物质谷氨酸流量增加,势必引起 L-谷氨酰胺的流量增加;二是因为选育(NH4)2SO4R 突变株能遗传性地解除NH+4对谷氨酰胺合成酶(GS)合成的阻遏,酶活的提高直接使谷氨酸向谷氨酰胺的转化率提高。2.4.3 天冬氨酸(ASP)节点的流量分析天冬氨酸族氨基酸虽处于谷氨酰胺合成途径下游和谷氨酰胺合成不直接相关,但由于天冬氨酸族氨基酸产量相当高,TCA 循环中的流量大量流向天冬氨酸节点,不但分担了流向谷氨酸节点的流量,还消弱了TCA 循环,对谷氨酰胺合成非常不利,所以下一步设计代谢也应该把天冬氨酸节点考虑进来。3 讨论国外应用代谢流分析的方法十分广泛,多使用电脑模拟代谢网络模型。Joungmi
33、n Lee16等采用电脑模拟的丁醇梭菌ATCC 824 代谢网络模型进行全基因组代谢流分析,检验单基因敲除对丁醇产生的影响,利用代谢流分析的方法指导基因操作;R.Montanez17等使用电脑模型进行精氨酸分解的代谢通量控制分析,通过模拟改变精氨酸浓度和其它控制参数,用以分析转运载体和相关酶系在不同参数条件下对精氨酸分解产生 NO 和多胺产生中的作用变化。国内代谢流分析主要还是应用于氨基酸代谢调控分析和有机酸代谢的分析中。杨艳等18利用代谢流分析的方法分析氮饥饿对谷氨酰胺产生菌NS611的影响,证实氮饥饿对谷氨酰胺合成酶活性提高有作用;天津科技大学的杜军等 19利用代谢流分析的方法进行过程优化
34、,显著提高了谷氨酸的产率;黄佳良等 20基于 Petri 网理论构建生物代谢网络模型,提出一种新的采用不等式的代谢流分析方法,新分析方法在前提假设和分析性能两方面均比采用方程式的传统方法明显优越:允许数据有一定误差,还可以进行代谢流分裂比分析、敏感性分析,使代谢流分析应用更为深入;此外,代谢流分析的方法在柠檬酸、乳酸、酒精以及核苷酸发酵分析中也多有应用。本文建立并完善了嗜乙酰乙酸棒杆菌 YL012 及其突变株LCHA0082 合成L-谷氨酰胺的中心代谢网。证明育种对改变代谢流量分配有很好的效果。但从代谢谱图也可以发现突变株 LCHA0082 流量分布仍有些分散,可以对该菌下一步选育高产菌提出如
35、下育种策略:(1)有机杂酸和其它杂氨基酸占代谢流量的比例非常大,对于突变株 LCHA0082 占总流量的 65%左右。占比例较大的主要有有机杂酸即乳酸和乙酸,天冬氨酸族氨基酸(主要是赖氨酸和异亮氨酸)以及谷氨酸族中的精氨酸和脯氨酸。有机杂酸的消除主要在于溶氧水平的调节;其它非目的氨基酸的减弱可以采取筛选营养缺陷型或适当添加相应氨基酸的方法。(2)谷氨酸向谷氨酰胺的转化也是关键。调节谷氨酰胺合成酶(GS)是最有效的方法,可以通过以下几个方法:一、添加酶的诱导剂;二、对氮源进行补料发酵,减少 NH+4对谷氨酰胺合成酶合成的的阻遏作用;三、进一步筛选 L-谷氨酰胺的结构类似物 6-重氮-5-氧代-正
36、亮氨酸抗性(DON),8-氮鸟嘌呤(8-AG)的抗性菌株,提高酶活。(3)进一步加强 EMP 途径和 TCA 循环中丙酮酸到A-酮戊二酸的途径。进一步提高 EMP 途径的通量,如抑制 6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性从而达到削弱 HMP 途径的目的;加强丙酮酸到A-酮戊二酸的流量,选育耐高糖浓度的能力菌株,也可继续选育以琥珀酸(Suc)为惟一碳源的突变株提高菌株对CO2的固定能力,同时削弱 A-酮戊二酸向琥珀酸进一步代谢,可考虑添加某些表面活性剂等达到削弱此途径不影响A-酮戊二酸生成的目的。参考文献:1 汤亚杰,张伟,李红梅,等.发酵法生产 L-谷氨酰胺研究进展 J.食品科学,2008,29(3):4
37、99-503.2 丁邦琴,邱鑫,周烽.L-谷氨酰胺生化性质、用途及生产方法概述 J.氨基酸和生物资源,2008,30(4):42-45.3Shu-liang Li,Chun Li,Yuan-shuai Liu.Separation of L-glutamine fromfermentation broth by nanofiltration J.Journal of Membrane Science,2003,222:191-201.4 Yan-ling Yang.Study on L-Glutamine Fermentation J.Food Science,2005,26(7):122-1
38、24.5 贾秀红,韩琳.谷氨酰胺的临床应用 J.滨州医学院学报,2008,31(5):368-370.66 生 物 技 术 2009年 19(4)6 邓丽静,周琰.复方谷氨酰胺在危重患者肠内营养中的作用 J.四川医学,2008,29(9):1124-1125.7 Bonarius HPJ,Schmid G,Tramper J.Flux analysis of underdeterminedmetabolic networks:the quest for the missing constrains J.Trends Biotechn-ol,1997,15:308-314.8 朱进伟,青山,张伟
39、国.L-精氨酸生物合成的代谢流量分析 J.微生物学通报,2008,35(3):395-401.9 Wolfgang W.13C Metabolic Flux Analysis J.Metabolic Engineering,2001,3:195-206.10Lee K,Berthiaume F,Stephanopoulos GN,et al.Metabolic flux analysis:a powerful tool for monitoring tissue functionJ.Tissue Eng,1999,5(4):347-368.11 Stephanopoulos GN,Aristi
40、dou A A,Nielsen J.Metabolic Engineering M.New York:Academic Press,1998:105-132.12 左爱连,张伟国.L-丝氨酸高产菌的选育及其发酵条件 J.化工进展,2008,27(9):1408-1411.13 无锡轻工业学院,大连轻工业学院,天津轻工业学院,等.工业发酵分析 M.北京:中国轻工业出版社,1980:6-22.14 Serpil Takac,Giizide Calik.Metabolic flux distribution for the optimizedproduction of L-giutamate J.E
41、nzyme and Microbial Technology,1998,23:286-300.15 Gregory N Stephanopoulos,Aristos A Aristidou,Jens Nielsen.Metabolicengineering:principles and methodologiesM.San Diego:Acadeemic Press,1998.16 Joungmin Lee,Hongseok Yun,Adam M.Feist.Genome-scale reconstruc-tion and in silico analysis of the Clostridi
42、um acetobutylicum ATCC824metabolicnetwork J.Appl Microbiol Biotechnol,2008,80:849-862.17 R.Montanez,C.Rodr uez-Caso,F.Sanchez-Jimenez,et al.In silicoanalysis of arginine catabolism as a source of nitric oxide or polyamines in endo-thelial cells J.Amino Acids,2008,34:223-229.18 杨艳,陈奎发,李春.谷氨酰胺产生菌 NS61
43、1 的代谢流分析 J.无锡轻工业大学学报,2003,22(2):38-43.19 杜军,陈宁,刘辉.基于代谢流量分析的 L-谷氨酸发酵过程优化 J.中国食品学报,2008,8(2):30-35.20 黄佳良,孟春,郭红.一种基于Petri 网的代谢流分析方法 J.计算机与应用化学,2008,25(1):77-80.交联壳聚糖微球固定化 B-葡萄糖苷酶工艺研究王秀征1,徐清2,倪邦庆1*(1.江南大学化学与材料工程学院,江苏 无锡 214122;2.诺维信中国投资有限公司,北京 100085)摘要:目的:以戊二醛交联壳聚糖微球为载体,通过共价连接反应固定化 B-葡萄糖苷酶。方法:以固定化酶比活和
44、酶活回收率为目标,采用单因素方法优化固定化工艺、微球制备条件。结果:微球最佳制备条件:2.5%壳聚糖,2%乙酸,7.5%氢氧化钠,氢氧化钠:乙醇(vPv)=1B1。最佳固定化工艺为:0.1g 壳聚糖微球在 20mL 3%戊二醛溶液中 50e 交联 2h。加酶量为7 388mU Pg干球,25e 吸附 24h。固定化酶比活为6 188mUP g干球,酶活回收率为 95.4%。结论:交联壳聚糖微球共价连接法可有效固定化 B-葡萄糖苷酶。关键词:交联;壳聚糖;固定化;B-葡萄糖苷酶中图分类号:Q814.2 文献标识码:A 文章编号:1004-311X(2009)04-0067-04Study of
45、the Immobilization of B-Glucosidase ontoCross-linked Chitosan MicrosphereWANG Xiu-zheng1,XV Qing2,NI Bang-qing1*(1.School of Chemical and Material Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Novozymes(China)Inveslment Co.Ltd,China Headquarters,Beijing 100085,China)Abstract:Objective:To optim
46、ize the immobilization of B-Glucosidase onto chitosan microsphere with glutaraldehyde.Method:Using activity ofimmobilized enzyme and activity recovery as response value,the effects of immobilization conditions and preparation conditions of cross-linkedchitosan microsphere on immobilizationwere studi
47、ed.Result:The optimal preparation conditions of chitosan microsphere were:2.5%chitosan,2%acetic acid,7.5%NaOH,the ratio of NaOH and ethonal(v Pv)=1B1.The optimal immobilization conditionswere as following:0.1g wet ch-itosan microspheres was treatedwith 20mL 3%glutaraldehyde at 50efor 2h,then glucosi
48、dase was incubated with the microspheres for 24h at25e with an enzyme loading of 7 388mUP g dry microspheres,giving the activity and activity recovery of the immobilized glucosidase 6188mUP gdry carrier and 95.4%,respectively.Conclusion:B-Glucosidase was immobilized by covalent bonding andthe enzyme
49、 exhibited a considerableaffinity to chitosan,giving high activity recovery while maintaining an optimum level of activity.Key words:cross-link;chitosan;immobilization;B-glucosidase收稿日期:2008-12-19;修回日期:2009-02-26基金项目:国家 863 计划项目(/微波耦联非水相酶催化合成食品添加剂的集成技术0,No.2006AA10Z310)资助作者简介:王秀征(1984-),男,天津,硕士生,从事固
50、定化酶及其在合成糖苷中应用研究,Email:wangxiuzheng2046 ;*通讯作者:倪邦庆(1967-),男,浙江兰溪市人,硕士,副教授,硕导,Email:byron-ni 。B-葡萄糖苷酶可水解糖苷键,亦能够在微水环境下催化逆水解反应合成糖苷类化合物1-3。酶的分离纯化成本较高,产物提取分离困难等限制了酶法合成糖苷4-6。应用固定化酶技术能够实现酶的重复利用和连续操作,可有效解决上述问题7-9。目前,葡萄糖苷酶固定化的问题主要表现在固定化酶比活较低,催化合成反应效率不高10-12,很难应用于糖苷合成,有必要进一步寻求实用、有效的载体及固定化方法。壳聚糖分子中含有大量游离氨基,戊二醛与