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1、第卷，第期 光谱学与光谱分析Vol畅，No畅，pp 年 月 Spectroscopy and Spectral AnalysisNovember，仿生技术在转基因大豆中镍形态分析和生物可给性评价中的应用陈丽惠，李顺兴，倡，牟 洋，郑凤英，李艳彩，王 慧，郑娜燕，谢和芳畅 闽南师范大学化学与环境科学系，福建 漳州 畅 福建省现代分离分析科学与技术重点实验室，福建 漳州 摘 要 转基因的食品安全问题一直是科学家和公众关注的焦点，其微量元素的生物可给性研究可为转基因食品的安全评价提供参考。以“胃肠仿生消化、肠道微生物代谢、脂质体仿生物膜亲合吸附”构建胃肠功能模型，用于大豆（转基因大豆和普通大豆）的样
2、品前处理，以脂质体亲合态、水溶态界定消化食糜中镍化合物的形态，以人体可吸收部分的脂质体亲合态评价大豆中镍的生物可给性。经胃肠消化和微生物代谢，大豆食糜中镍配合物以水溶态为主；胃肠消化、肠道微生物代谢均对镍配合物的生物可给性起促进作用；转基因大豆和普通大豆中镍的生物可给性分别为 畅 和 畅，即大豆转基因后镍生物可给性提高 ；但转基因大豆中脂质体结合态镍含量 畅 ng g，仅为普通大豆的 。关键词 仿生消化；转基因大豆；镍；生物可给性；形态分析中图分类号：O畅 文献标识码：A DOI：畅j畅issn畅（）收稿日期：，修订日期：基金项目：国家自然科学基金项目（，），教育部新世纪优秀人才支持计划项目（
3、NCET），福建省杰出青年基金项目（J）和福建省科技计划重点项目（Y）资助 作者简介：李顺兴，年生，闽南师范大学化学与环境科学系教授 倡 通讯联系人 email：lishunxing mnnu畅 edu畅cn引 言 转基因食品的安全问题是科学家和公众关注的焦点。转基因食品的安全评价主要是基于实质等同原则的化学成份和营养价值变化研究，而对转基因食品中人体必需微量元素的形态分析及生物可给性评价的研究未见报道。人体必需微量元素镍与多种酶蛋白合成、细胞激素及色素代谢有关，可促进铁吸收和红细胞增长，过量的摄入可能引发癌症发生和肾脏衰竭。本工作首次研究转基因大豆中镍的生物可给性。元素配合物在人体的消化和吸
4、收与其存在形态有关，而原有“形态研究”把微量元素形态界定为分子量分布，无机态、有机态、悬浮态和可溶态，等，无法为微量元素作用机制的阐述和生物可给性评价提供背景资料，忽视人体消化系统对形态和生物可给性的影响。鉴于肠道微生物对人体营养物质代谢的重要作用，将肠道微生物代谢与化学仿生（人工胃、人工肠）与医学仿生（酶的作用）方法，相结合，模拟人体胃肠消化。本研究采用体外仿生消化对转基因大豆和普通大豆进行预处理，以脂质体亲合态、水溶态界定消化食糜中镍化合物的形态，即以胃肠仿生消化、肠道微生物代谢和脂质体仿生生物物膜亲合吸附构建仿生胃肠消化吸收功能模型，以 ICPMS 分别测定大豆食糜中脂质体亲合态、水溶态
5、镍含量。探讨胃消化、肠消化、肠道微生物代谢对转基因及普通大豆中镍形态和生物可给性的影响，比较分析转基因大豆与普通大豆中人体必需元素镍的生物可给性。与动物模型相比，胃肠仿生消化和肠道微生物代谢、脂质体仿生生物膜亲合吸附联用技术评价食物中微量金属的形态和生物可给性，更可靠、简便、易行。实验部分1畅1 仪器与试剂ICPMS（cx Series，美国安捷伦公司）；超低温冰箱（CULT，Thermo Electron 公司）；旋转蒸发器（RE，上海亚荣生化仪器厂）；水浴恒温振荡器（SHAB，常州国华电器有限公司）；微波炉（WDB，顺德市格兰仕电器有限公司）；低温高速离心机（ROTINAR，德国 Hett
6、ich 公司）；净水器（MilliQ，美国 Millipore公司）。转基因大豆（抗草甘膦型）由漳州市检验检疫局提供，普通大豆购于漳州市。标准物质（大豆，GBW）购于中国标准物质网；浓 HNO（分析纯，德国默克公司）；淀粉酶、尿酸、粘液素、牛血清蛋白、胃蛋白酶、胰液素、脂肪酶和胆汁（分析纯，Sigma 公司）；HO（），卵磷脂（分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司）；所有消化液由超纯水配制。1畅2 转基因大豆与普通大豆的仿生消化过程根据参照文献取一定量的无机盐，有机物和生物酶配制仿生的唾液、胃液、肠液和胆汁。根据参照文献配制肠道微生物培养液 TYG，于实验当天收集三个健康志愿者的排泄物，马上混
7、合三个样品，按 的比例用 畅mol L，pH 畅 的磷酸盐缓冲液溶解，静置 min，取 mL 的上清液稀释至 mL，然后取 L 的稀释液接种至肠道微生物培养液中，在 无氧条件下培养 h 后于高速离心机离心分离出肠道微生物菌落。所有实验仪器和试剂均经过高压灭菌锅 灭菌 min，整个接种过程均在超净台上完成。将大豆颗粒置于电热恒温鼓风干燥箱中，条件下干燥 h 后以玛瑙研钵研磨成粉，粉末过 目筛子。准确称取转基因大豆粉末和普通大豆粉末各 畅 g，加 mL 超纯水，煮沸 min。待大豆溶液冷却至室温进行胃肠仿生消化、胃肠仿生消化微生物代谢、脂质体仿生物膜亲合吸附，具体流程如图 所示，分别得到胃仿生消化
8、食糜、胃肠仿生Fig畅1 Schematic diagram of gastrointestinal digestion and gastrointestinal digestion&metabolism of gut microbiota消化食糜和胃肠仿生消化与微生物代谢食糜。将大豆消化食糜以 畅m 滤膜过滤。1畅3 镍在食糜中的形态分布实验取 畅 g 蛋黄卵磷脂，溶于 mL 氯仿，将溶液移入具塞圆底烧瓶，于旋转蒸发器上蒸发旋转 min，形成均匀的膜，分别量取食糜溶液 mL，加入到卵磷脂膜层中，轻轻摇动至脂质体膜层融入食糜中，于 的超低温冰箱中冻融 次，促进消化食糜在脂质体水体系中的分配。冻
9、融后以低温高速离心机离心，分离出脂质体和上清液，脂质体亲合态镍被萃取至脂质体中。1畅4 大豆中镍含量，亲脂态镍和水溶态镍浓度的测定准确称取普通大豆粉末和转基因大豆粉末各 畅 g 于消化罐中，加 畅 mL 浓硝酸和 畅 mL 过氧化氢，在 下恒温水浴加热 min，待黄烟散尽补加 畅 mL 浓硝酸和畅 mL 过氧化氢，微波消解 min，冷却后定容。将 畅 分离得到的全部脂质体和上清液（mL）分别转移至消解罐中，加 畅 mL 浓硝酸和 畅 mL 过氧化氢，微波消解 min，冷却后定容至 mL。以 ICPMS 测定大豆中镍总含量、脂质体亲合态镍、水溶态镍的浓度。大豆中脂质体亲合态镍占镍总量的百分比即为
10、镍生物可给性。结果与讨论2畅1 转基因大豆与普通大豆中镍含量以微 波 消 解ICPMS 法 测 定 标 准 物 质（大 豆，GBW）、转基因大豆、普通大豆等粉末中镍含量，同时进行回收率实验，结果如表 所示。实验测定值与标准值相吻合，回收率分别为 畅 和 畅，说明样品预处理及测定方法准确、可靠。普通大豆含镍 畅g g，而转基因大豆镍含量只有 畅g g，即大豆转基因后镍含量降低了 。对转基因大豆与普通大豆的镍含量做统计分析，结果 P 畅 畅 由于 P值远小于 畅，说明转基因大豆的镍含量发生显著性变化。这说明外源基因片段的导入可能影响到大豆、大米等农作物基因的表达，从而降低农作物在生长过程中对金属镍
11、的吸收和累积。Table 1 Analytical result for nickel in soybeans and their recoveries（g g 1，n 3）元素大豆（GBW）Certified valuesAverage resultsRSD转基因大豆FoundAddedRecovery普通大豆FoundAddedRecoveryNi灋敂畅 a畅乙 热畅 晻畅v l畅蝌畅X N畅Y O畅倐x畅哌照畅怂亮畅2畅2 转基因和普通大豆胃肠仿生消化和肠道微生物代谢食糜中镍的溶出量、生物可接受率食物经胃肠消化转化为食糜，只有进入食糜中的微量金属配合物才能接触肠道细胞膜，因此微量金属在食
12、糜与食物中的含量比例、食糜中微量金属与食物的质量比分别称为微量金属的生物可接受率、溶出量。胃肠消化和肠道微生物代谢对转基因和普通大豆中镍溶出量及生物可接受率的影响见表 。Table 2 Influence of gastrointestinal digestion and gut microbiota on nickel solubility and bioaccessibility in transgenic and general soybean镍溶出量（ng g）转基因大豆 普通大豆镍生物可接受率转基因大豆 普通大豆胃消化 畅 n e畅铑邋畅V M畅胃肠消化 畅 n e畅铑邋畅V M畅胃
13、肠消化与肠道微生物代谢 畅 n e畅铑邋畅V M畅光谱学与光谱分析 第 卷 转基因大豆和普通大豆中镍生物可接受率分别为畅 畅 和 畅 畅，这表明大豆中 以上的镍配合物经胃肠消化和微生物代谢后溶出，进入食糜。肠消化及微生物代谢对普通大豆的镍配合物生物可接受率没明显影响，说明普通大豆镍配合物在胃被消化，镍溶出量约g g。转基因大豆中镍的溶出量远低于普通大豆，只有畅 畅g g，生物可接受率经胃消化、肠消化、微生物代谢后均有明显提高。转基因大豆中镍配合物生物可接受率较普通大豆减少 ，说明镍配合物更难被胃肠消化。转基因大豆与普通大豆中镍配合物在胃肠消化的差异可能由于外源基因的导入引起镍配合物配体的变化，
14、且胃肠消化酶对此配合物的消化能力不同。2畅3 转基因和普通大豆胃肠仿生消化和肠道微生物代谢食糜中镍的形态及生物可给性经胃肠仿生消化、肠道微生物代谢，食糜更接近食物在胃肠消化道内达到平衡后的有效成分群，镍配合物分别转化为脂质体亲合态进入膜相或水溶态留在水相。鉴于肠道消化管和血管间的生物膜是类脂质膜，脂质体亲合态镍含量可用于衡量食糜中镍的生物可给性，即可被肠道吸收的性能。转基因大豆与普通大豆经胃仿生消化、胃肠仿生消化、胃肠仿生消化与肠道微生物代谢后镍的生物可给性如图 所示。转基因大豆和普通大豆中镍的生物可给性分别为 畅和 畅，即大豆转基因后镍生物可给性提高 ；普通大豆中脂质体结合态镍含量为 畅 n
15、g g，而转基因大豆仅是普通大豆的 ，即 畅 ng g；镍配合物均以水溶态为主存在于食糜中。经肠消化，普通大豆与转基因大豆Fig畅2 Influence of gastric digestion（GD），gastrointestinal digestion（GID）and gastrointestinal digestion&metabolism of gut microbiota（GID&GM）on nickel bioavailabiliry中镍配合物的生物可给性较胃消化时，分别提高 畅 和畅，在胃肠消化的基础上，肠道微生物代谢可影响人体消化过程，有助于提升镍的生物可给性，普通大豆与转基因
16、大豆分别提高 畅 和 畅，因此将肠道微生物代谢引入胃肠功能模型，才可更有效评价微量金属的生物可给性、分析微量金属的形态。肠消化和微生物代谢可促使镍配合物发生转化，提高镍配合物与脂质体的亲合力，从而增强生物可给姓。外源基因导入影响到大豆基因的表达，导致大豆组成成分差异，影响镍的配位体组成，从而导致转基因大豆与普通大豆镍配合物生物可给性的差异。References Herrero M，Ibanez E，MartnAlvarez J P，et al Anal Chem，：Harrigan G G，Ridley P W，Riordan G S，et al J Agric Food Chem，：Denk
17、haus E，Salnikow K Crit Rev in Oncol Hemat ，：Lu H T，Shi X L，Costa M，et al Mol Cell Biochem，：Vyskocil A，Senft V，Viau C，et al Hum Exp Toxicol，：WANG Zheng，JING Miao，Lee F S C，et al（王 征，荆 淼，黎先春，等）Chem J Chinese Universities（高等学校化学学报），（）：TIE Mei，FANG Yuzhi，SUN Tiebiao，et al（铁 梅，方禹之，孙铁彪，等）Chem J Chinese Un
18、iversities（高等学校化学学报），（）：Oomen A G，Rompelberg C J，Bruil M A，et al Arch Environ Con Tox，：Montalto M，DOnofrio F，Gallo A，et al Digest Liver Dis，（Suppl ）：LIN Luxiu，LI Shunxing，ZHENG Fengying（林路秀，李顺兴，郑凤英）Chinese J of Anal Chem （分析化学），（）：Li S X，Lin L X，Zheng F Y J Agric Food Chem，（）：Goodman L A，McNulty P N
19、，Zhao Y，et al J Cell Host Microbe，：Gill S R，Pop M，Deboy R T，et al Science，：第 期 光谱学与光谱分析Application of Bionic Technology to Speciation Analysis andBioavailability Assessment of Nickel in Transgenic SoybeanCHEN Lihui，LI Shunxing，倡，MOU Yang，ZHENG Fengying，LI Yancai，WANG Hui，ZHENG Nayan，XIE Hefang Depar
20、tment of Chemistry，Minnan Normal University，Zhangzhou ，China Fujian Province Key Laboratory of Modern Analytical Science and Separation Technology，Minnan Normal University，Zhangzhou ，ChinaAbstract The safety of transgenic food has been paid the most attention to by the public and scientists Trace me
21、tal bioavailability could provide information for safety assessment of transgenic food The critical functional digestion and absorption in thegastrointestinal tract were simulated by bionic gastrointestinal digestion，metabolism of gut microbiota，and bionic biomembraneadsorption with liposome and the
22、n used for the pretreatment of transgenic and general soybeans Ni speciation in the chyme wasdefined as affinityliposome and water soluble Ni Nickel bioavailability was assessed by the content of affinityliposome Ni Water soluble Ni was the main species of nickel complex in the chyme Nickel bioavail
23、ability was 畅 for transgenic soybeanand 畅 for general soybean，which could be enhanced by gastrointestinal digestion and metabolism of gut microbiota Aftertransgene，nickel bioavailability was increased but the content of affinityliposome Ni was 畅 ng g for transgenicsoybean，just as as that of general
24、soybean Keywords Bionic digestion；Transgenic soybean；Nickel；Bioavailability；Speciation analysis（Received Mar ，；accepted May ，）倡 Corresponding author光谱学与光谱分析 第 卷仿生技术在转基因大豆中镍形态分析和生物可给性评价中的应仿生技术在转基因大豆中镍形态分析和生物可给性评价中的应用用作者：陈丽惠，李顺兴，牟洋，郑凤英，李艳彩，王慧，郑娜燕，谢和芳，CHEN Lihui，LI Shunxing，MOU Yang，ZHENG Fengying，LI Y
25、ancai，WANG Hui，ZHENG Nayan，XIE Hefang作者单位：陈丽惠,牟洋,王慧,郑娜燕,谢和芳,CHEN Lihui,MOU Yang,WANG Hui,ZHENG Nayan,XIEHefang(闽南师范大学化学与环境科学系,福建 漳州,363000)，李顺兴,郑凤英,李艳彩,LIShunxing,ZHENG Fengying,LI Yancai(闽南师范大学化学与环境科学系，福建 漳州 363000;福建省现代分离分析科学与技术重点实验室，福建 漳州 363000)刊名：光谱学与光谱分析 英文刊名：Spectroscopy and Spectral Analysis
26、 年，卷(期)：2013(11)参考文献(13条)参考文献(13条)1.Herrero M;Ibanez E;Martn-Alvarez J P 查看详情 20072.Harrigan G G;Ridley P W;Riordan G S 查看详情 20073.Denkhaus E;Salnikow K 查看详情 20024.Lu H T;Shi X L;Costa M 查看详情 20055.Vyskocil A;Senft V;Viau C 查看详情 19946.王征;荆淼;黎先春 查看详情 2006(06)7.铁梅;方禹之;孙铁彪 查看详情 2007(04)8.Oomen A G;Rompelberg C J;Bruil M A 查看详情 20039.Montalto M;DOnofrio F;Gallo A 查看详情 2009(Suppl)10.林路秀;李顺兴;郑凤英 查看详情 2008(06)11.Li S X;Lin L X;Zheng F Y 查看详情 2011(03)12.Goodman L A;McNulty P N;Zhao Y 查看详情 200913.Gill S R;Pop M;Deboy R T 查看详情 2006 本文链接：http:/