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1、第卷第期年月中国预防兽医学报,群猪轮状病毒株基因序列分析高秀春,时洪艳,体有恩,吴波 平,孙东波,白兴华,陈建飞,冯力”中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨东北农业大学生命科学院黑龙江哈尔滨摘要根据已发表的猪轮状病毒毒株回基因核普酸序列两端保守区序列,设计一时特异引物,以猪轮状病毒毒株反转录为模板,通过方 法扩增出长约目的片段。将其进行一克隆、序列测 定和分析。结果表明,叨基因全长,含有一个的 开放 阅读框,编码个氮基酸与已知 的巧个毒株甲全长基因的核普酸及推导的氛基酸序列比较,同源性分别为和,核普酸系统发育进化树结果表明,毒株与轮状病毒型参考
2、毒株、一亲缘关系较近,分为一个群,表明毒株血清型为型。目前,我国尚未见猪及其它动物轮状病毒型流行株的报道。关健词猪轮状病毒咖基因序列分析中图分类号文献标识码文章编号一一一一,雌一,一,一,一,一,一龟,加,盯甲代饰一一甲,甲一一叮娜甲轮状病毒,属于呼肠孤病毒科基因组由个 不连续双链片段组成,总长度轮状病毒属,是各种幼龄。目前已鉴定出种蛋白,分别由个基因片动物发生腹泻 的 主要病原之一川。粒子略呈 圆段编码,分属于内衣、外衣壳蛋白和非结构蛋白。形,无囊膜,具双层衣壳,直径为一。中病毒粒子表面有种抗原,即群抗原、中央为一 电子致密的六角型核心,直径一。和抗原及血凝素抗原。根据群抗原的差异收稿时间一
3、一作者简介高秀春,女,辽宁朝阳人,硕士研究生,主要从事动物病原微生物的研究通 讯作者一少中 国 预 防 兽医学 报年及病毒末端指纹图分析,可将其分为个群。群是最早发现具有共 同群抗原的典型轮状病毒,其它为非典型轮状病毒,其中可感染猪的有、和共个群,但以群为主。钟是的外衣壳蛋白,也是一种糖基化蛋白,由个组成,因不同毒株而 异,分别由或、基因编码,为病毒外膜主要中和抗原,决定病毒的血清型,与病毒的毒力及免疫保护性相关,也是划分血清型的主要标志。疫苗的研究证明,不同血清型之间的交叉保护作用甚微。因此,基因及其编码的蛋白一直是轮状病毒研究中的热点,同时,钾也是一种钙调蛋白,与病毒粒子形态形成和稳定性有
4、关。目前,对的研究比较多,但由于其空间构象性复杂,排列规律不是很明显,因此,对于疫苗的研制带来较多困难,在很大程度上阻碍了的预防和治疗。本研究对猪轮状病毒毒株蛋白基因进行扩增、序列测定,并对测定结果进行分析,借以了解毒株咖基因的分子特性以及蛋 白的功能,为进一步开展疫苗、诊断预防等研究奠定生物学基础。材料和方法病毒猪轮状病毒从江苏分离获得,简称株由南京农业大学张海彬教授惠赠,病毒经细胞培养传至代毒用于本研究。试剂一购 自购自天为时代购 自、形曲、和一载体购自宝生物工程大连有限公司。叨基因的扩增引物根据发表的毒株甲基因组序列盯两端保守区,设计一对用于扩增叫基因引物,序列如下叨一,甲,一一。由上海
5、生物工程技术有限公司合成。一按常规方法提取病毒,完成逆转录程序,进行扩增。反应参数预变性,变性、,退火一、延伸、个循环,延伸,保存。扩增产物电泳取产物琼脂糖凝胶电泳,紫外光下分析目的片段。产物克 隆及鉴 定产 物克隆到一载体,具体操作程序见参考文献。进行、酶切鉴定,筛选阳性重组质粒送上海生物工程有限公 司进行序列测定。甲基因序列的同源性比较用软件方法对其中株咖全基因序列进行同源性比较,并绘制基因系统发育进化树。裹同源序列比较所采用的参考毒株序列来源随山奴此曲即口毒株登陆号分离年代分离国家爪型毒株登陆号分离年代分离国家爪型扭如朗一一一旧一沁翻尹一一一沁了一一一沁即朋一一沁翻一一一沁邵七一一一一一
6、一七一叉李,一“,一侧一一【劝一一一创峨七备注“一”代表未知。“一”,第期高秀春,等群猪轮状病毒株甲基因序列分析结果甲基因 的一扩增结果以株反转录为模板,进行扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,可见左右特异的目的条带,大小与预期结果一致图。图甲甚 因产物凝胶 电泳分析结果冲尚详叮肪石甲泊,重组质杜叻鉴定结果取重组质粒进行、酶切鉴定,均为阳性,与预期结果相符。叨基因的核替酸序列 浏 定以及与其它毒株的同源性分析对重组质粒进行序列测定,经比较分析证明获得了蛋白的全长基因,共,包括夕端非编码区,端非编码区,中间 为一个完整 的,编码个氨基酸。有两个起始密码子,分别为一、一处的,前者为一弱起始序列,后者为
7、一强起始序列,终止密码子为。选取上具有代表性毒株的猪,全基 因序列进行同源性比较。结果显示,毒株与其它毒株核昔酸的 同源性在一之 间,其中与同源性最高为,与一同源性最低为。氨基酸同源性在之间,但与毒株氨基酸同源性最高为,与科一毒株同源性最低为,与各毒株氨基酸的同源性整体高于核昔酸的同源性表,氨基酸突变主要发生在高变区图。在氨基酸 系统发育进化树中,根据氨基酸序列进化关系可以划分为个群图,毒株与、一属于群,一毒株为群,但这两个群血清型 同为型,由此推测毒株血清型为型。讨论引起的腹泻是一种世 界性的疾病,在养猪生产上,是引起仔猪腹泻的主要病原体之一。感中 国 预 防 兽医学报年染后,使仔猪机体免疫
8、力急剧下降,从而诱发多种腹泻病原体混合感染,导致仔猪死亡率上升,或生长缓慢、停滞。本研究选用标准毒株对甲全基因序列进行核昔酸和氨基酸同源性比较,证明毒株与其它毒株核昔酸的同源性在一之间,氨基酸同源性在之间,发现毒株与其它毒株氨基酸的同源性比核昔酸的同源性整体要高一,说明在收集的咖核昔酸序列中都存在一定数目碱基的无意义突变。根据绘制的咖基因系统发育进化树,可以分为个群图,毒 株 与典型的型毒 株、一等为一个群,说明毒株血清型也为型。但与、一、一等型毒株亲缘关系较远,属于不同的分支。以往的资料表明,我国猪场感染主要以型为主,型流行株在国内还未见相关报道,但泰国、日本等东南亚国家型毒株感染明显增多,
9、我国近几年婴幼儿感染型也有增多趋势,而本试验检测猪的血清型也为型,这与东南亚国家猪感染流行情况是相符的。在年间,中国、泰国、日本等东南亚国家仍以、为主,、也见流行表,但最近两年东南亚国家型毒株流行明显增多,特别是日本、泰国的疫情报道居多,而本试验也检测出型,说明我国型毒株也有流行欧洲的西班牙、意大利又出现了一型毒株的流行。据报道在不同区域其它血清型具有一定的地域性。资料表明,控制钾合成的基因片段是由保守区和高变区共同组成。等经序列分析比较,序列中存在个高变区,而等通过的序列分析,确定了序列中个高变区的存在。单克隆抗体表明,高变区涉及中和抗原位点形成,但主要 中和决定簇为一、幼三个区域,这 也是
10、无交叉保护或交叉保护性低的主要原因。毒株与其它毒株氨基酸同源性比较也分为个高变区图,与报道一致。除个别位点外,绝大部分氨基酸突变都发生在高变区。最新的流行株可能是两个不同血清型毒株混合感染宿主细胞时,基因片段之 间相互作用,在转录复制过程中发生交换、交叉或重排,基 因组内部突变产生基因重配株和突变株。也有学者认为变异还可能与时间因素有关。糖蛋 白是的主要免疫保护性抗原,刺激机体产生中和抗体,在消除感染中起着重要作用。因此,有关咖基因的研究对以后钾蛋白表达、诊断抗原、预防和控制引起的疾病都具有重要意义。参考文献殷展,刘景华动物病毒学【】第版,北京科学出版社,一,币,而,加萨姆布鲁克,拉塞尔分子克隆实验指南【】第三版,黄培堂,等译 北京科学出版社,李国华,钱渊,熊朝晖,等北京地区型人轮状病毒 地方株编码 墓 因 的序 列分析病毒 学报,一金辉,王蓓汪宁组轮状病毒的分子流行病学研究进展江苏预防医学,一,儿恤川习姆,代兑,别行曰叨拐如歇叼助,一倪艳秀,林继煌,何孔旺,等组轮状病毒研究动态中国兽医学报【,印创,即阴即刃兄阴坦,一责任编辑陈立群