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1、实验基本技术第1页，共80页，编辑于2022年，星期五细胞培养基本技术细胞培养基本技术第2页，共80页，编辑于2022年，星期五无菌操作技术消毒消毒(disinfection)和消毒剂和消毒剂(disinfectant)灭菌灭菌(sterilization)防腐防腐(antisepsis)和防腐剂和防腐剂抑菌抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂和抑菌剂(bacteriostatic)无菌无菌(asepsis)无菌技术无菌技术/无菌操作无菌操作(antiseptic technique)第3页，共80页，编辑于2022年，星期五【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数
2、据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。第4页，共80页，编辑于2022年，
3、星期五【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰
4、烧灼消毒或取备品更换。第5页，共80页，编辑于2022年，星期五培养细胞的观察培养细胞的观察肉眼观察培养物颜色及混浊度肉眼观察培养物颜色及混浊度倒置显微镜观察细胞生长状态倒置显微镜观察细胞生长状态第6页，共80页，编辑于2022年，星期五第7页，共80页，编辑于2022年，星期五细胞计数细胞计数1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml4大格细胞总数/410000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应
5、按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。第8页，共80页，编辑于2022年，星期五第9页，共80页，编辑于2022年，星期五v根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：v1悬浮生长细胞传代v 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。v 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。v2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）v 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹v打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。v3贴壁生长细胞传代v 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶
6、液。细胞传代方法细胞传代方法第10页，共80页，编辑于2022年，星期五贴壁生长细胞传代方法v1 吸光培养瓶中的培养液v2 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）v静置2-10 min（显微镜下动态监测）。v3 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。v4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。v5 离心，细胞沉淀用培养液制成悬液。v5 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。v6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。v7 将后者放入培养箱中培养。第11页，共80页，编辑于2022年，星期五v任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从
7、形态上区任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。别死、活细胞是困难的。v在在细细胞胞群群体体中中总总有有一一些些因因各各种种原原因因而而死死亡亡的的细细胞胞，总总细细胞胞中中活活细细胞胞所所占占的的百百分分比比叫叫做做细细胞胞活活力力，由由组组织织中中分分离离细细胞胞一一般般也也要要检检查查活活力力，以以了了解解分分离离的的过过程程对对细细胞胞是是否否有有损损伤伤作作用用。复复苏苏后后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。培养细胞活力测定第12页，共80页，编辑于2022年，星期五v1台盼蓝法v活细胞不被染色，
8、死细胞染成蓝色；v用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；v方法：1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中；2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟；3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。第13页，共80页，编辑于2022年，星期五v2四唑盐（MTT）比色法v四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝；vMTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（forma
9、zan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值；vMTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。第14页，共80页，编辑于2022年，星期五v操作步骤：（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5vCO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）；（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时；（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150
10、微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解；（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制细胞生长曲线。第15页，共80页，编辑于2022年，星期五第16页，共80页，编辑于2022年，星期五细胞冻存和复苏细胞冻存和复苏v细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。少污染，减少细胞生物学特性变化。第17页，共80页，编辑于2022年，星期五冻存和复苏的原则：慢冻快融冻存和复苏的原则：慢冻快融v当细胞冷到
11、零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。v如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。第18页，共80页，编辑于2022年，星期五慢冻程序慢冻程序v标准程序：
12、v 当温度在-25以上时，12/minv 当温度达-25以下时，510/minv 当温度达-100时，可迅速放入液氮中v简易程序：v 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投入液氮中。第19页，共80页，编辑于2022年，星期五低温保护剂的应用低温保护剂的应用v在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。v常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高
13、胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。第20页，共80页，编辑于2022年，星期五细胞冻存方法细胞冻存方法v1预先配制冻存液：含预先配制冻存液：含20%血清培养基，血清培养基，10%DMSO，DMSO液液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；v2取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液取对数生长期细胞，经
14、胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹用吸管吹打制成细胞悬液（打制成细胞悬液（1106 5 106细胞细胞/ml)；v3 3加入加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。第21页，共80页，编辑于2022年，星期五细胞复苏方法细胞复苏方法 （1 1）从从液液氮氮中中取取出出冷冷冻冻管管，迅迅速速投投入入373738 38 水水浴浴中中，使使其其融融化化（1 1分钟左右）；分钟左右）；（2 2）5 5分钟内用培养液稀释至原体积的分钟内用培养液稀释至原体积的1010倍以上；倍以上；（3 3）低速离心）低速离心1010分钟；分钟；（4
15、 4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。第22页，共80页，编辑于2022年，星期五免疫组化基本技术免疫组化基本技术第23页，共80页，编辑于2022年，星期五1、标本的取材、标本的取材2、组织的固定、组织的固定 3、脱水、透明和包埋、脱水、透明和包埋4、切片、切片一、组织与细胞材料的制备一、组织与细胞材料的制备第24页，共80页，编辑于2022年，星期五 手术切除标本，各种活检穿刺标本、尸体解剖标本和手术切除标本，各种活检穿刺标本、尸体解剖标本和动物组织标本。动物组织标本。原则上，应尽快取材，但比较大的手术原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃
16、、肺、肠等器官，最好先固定后取材。细胞大量标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（培养后，经消化将细胞制成悬液（106106）涂在涂有切片粘合）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。剂的载玻片上，凉干后固定。1、标本的取材、标本的取材第25页，共80页，编辑于2022年，星期五 防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转的固有形态。使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。变成
17、不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。常用固定液有：甲醛、常用固定液有：甲醛、4 4多聚甲醛、多聚甲醛、Bouin SBouin S液等。固定时间液等。固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。组织固定后必须彻底冲洗。反比。组织固定后必须彻底冲洗。2、组织标本的固定、组织标本的固定第26页，共80页，编辑于2022年，星期五脱水：脱水：7575、8585乙醇，乙醇，9595、乙醇，无水乙
18、醇乙醇，无水乙醇 、。透明：二甲苯透明：二甲苯、二甲苯、二甲苯、二甲苯、二甲苯浸蜡：石蜡浸蜡：石蜡、石蜡、石蜡、石蜡、石蜡石蜡包埋：修蜡块，标号石蜡包埋：修蜡块，标号3、组织脱水、浸蜡及包埋、组织脱水、浸蜡及包埋 第27页，共80页，编辑于2022年，星期五 切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，IHCIHC切切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。求。4、组织切片、组织切片第28页，共80页，编辑于2022年，星期五1 1、石蜡切片的脱蜡至水、石蜡切片的脱蜡至水2 2、内源性酶的消除方
19、法、内源性酶的消除方法3 3、热诱导的抗原修复、热诱导的抗原修复 4 4、显示系统的选择和配制、显示系统的选择和配制 5 5、衬染剂的选择和配制、衬染剂的选择和配制二、二、IHC的一些基本技术的一些基本技术第29页，共80页，编辑于2022年，星期五 冰冻切片从冰冻切片从-80-80取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做IHCIHC。二甲苯二甲苯10min10min，二甲苯，二甲苯10min10min，二甲苯，二甲苯10min10min，无水，无水乙醇乙醇2min2min，9595乙醇
20、乙醇2min2min，8585乙醇乙醇2min2min，7575乙醇乙醇2min2min，流水冲洗。流水冲洗。1、石蜡切片脱蜡至水、石蜡切片脱蜡至水第30页，共80页，编辑于2022年，星期五1.1.内源性过氧化物酶的消除方法：内源性过氧化物酶的消除方法：0.3%0.3%3%H2O23%H2O2甲醇液甲醇液20min20min；1 1 H2O2 20min H2O2 20min；3 3苯肼溶液苯肼溶液371h371h；0.075%0.075%盐酸甲醇液盐酸甲醇液 30min30min等。等。2.2.内源性碱性磷酸酶的消除方法：内源性碱性磷酸酶的消除方法：1010醋酸醋酸 10min 10min
21、；0.5mol/L0.5mol/L碳酸氢钠（碳酸氢钠（pH9.0pH9.0）20min 20min；1mol/L1mol/L左旋咪唑左旋咪唑 20min 20min。3.3.内源性生物素的消除方法：内源性生物素的消除方法：2-2-甲基甲基-D-D苷露糖饱和生物素；先苷露糖饱和生物素；先用用25g/ml25g/ml卵白素孵育卵白素孵育15min15min，PBSPBS洗洗10min10min，移至生物素饱和液，移至生物素饱和液中处理中处理15min15min，PBSPBS洗洗15min15min。2、内源性酶的消除方法、内源性酶的消除方法第31页，共80页，编辑于2022年，星期五 1.1.抗原
22、修复抗原修复(Antigen Retrieval;AR)(Antigen Retrieval;AR)是以高温、高压对常规固定的是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。性检测的一种方法和技术手段。2.2.修复方式：修复方式：微波微波9610min29610min2；直接加温直接加温100100，15min15min；水浴锅水浴锅100100，15min15min；高压锅高压锅/消毒锅消毒锅120120，5min5min；真空加热真空加热10min10min；直接烤
23、片法。直接烤片法。3、热诱导的抗原修复、热诱导的抗原修复第32页，共80页，编辑于2022年，星期五3.3.修复介质：修复介质：0.01M pH6.0 0.01M pH6.0柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液(CB)(CB)；0.05mTris-HCL(pH1-120.05mTris-HCL(pH1-12系列系列);0.01M pH7.0 PBS;2%);0.01M pH7.0 PBS;2%硫酸硫酸铝；铝；22硝酸铝；硝酸铝；生理盐水；生理盐水；蒸馏水。认为修复介质种蒸馏水。认为修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而pHpH值则影响较大。值则影响较大。
24、缓冲液以缓冲液以CBCB和和Tris-HCLTris-HCL较常见。较常见。4.4.温度与修复时间的关系：许多的实验结果表明，温度高修温度与修复时间的关系：许多的实验结果表明，温度高修复时间短，呈正相关。例如，复时间短，呈正相关。例如，Ki-67Ki-67、P-gpP-gp的检测，利用同一的检测，利用同一切片，达到相同的染色结果如下步骤：切片，达到相同的染色结果如下步骤：100 20min100 20min；90 40min90 40min；80 60min80 60min；70 20h70 20h。3、热诱导的抗原修复、热诱导的抗原修复第33页，共80页，编辑于2022年，星期五 目前用于目
25、前用于IHCIHC的标记酶主要有辣根过氧化物酶的标记酶主要有辣根过氧化物酶 （HRPHRP）和碱性磷）和碱性磷酸酶（酸酶（AKPAKP）。）。HRP HRP显示系统为：显示系统为：3 3、3 3-二氨基联苯胺盐酸盐二氨基联苯胺盐酸盐(3(3、3 3-diaminbezidine;DAB)-diaminbezidine;DAB)、3-3-氨基氨基-9-9-乙基卡吧唑乙基卡吧唑(3-amino-9-ethlylcarbazde;AEC)(3-amino-9-ethlylcarbazde;AEC)、四甲基联苯胺、盐酸对、四甲基联苯胺、盐酸对苯二胺、苯二胺、4-4-氯氯-1-1-萘酚、高香草酸、萘酚、
26、高香草酸、萘酚派若宁萘酚派若宁 HRP HRP显示系统为：显示系统为：BCIPBCIP（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚基磷酸吲哚基磷酸)NBT(NBT(硝硝基四氮唑蓝基四氮唑蓝)、萘酚萘酚AS-BIAS-BI磷酸盐快红或快蓝。磷酸盐快红或快蓝。4、显示系统的选择、显示系统的选择第34页，共80页，编辑于2022年，星期五5、衬染剂的选择和配制、衬染剂的选择和配制1.Mayer1.Mayer氏苏木素：取氏苏木素：取1g Mayer1g Mayer氏苏木素加温溶于氏苏木素加温溶于100ml100ml蒸馏水中，蒸馏水中，再加入再加入50g50g碘酸钠和碘酸钠和50g50g钾明矾，溶解后加入
27、枸橼酸和水合氯醛，钾明矾，溶解后加入枸橼酸和水合氯醛，溶解后过滤。溶解后过滤。2.Harris 2.Harris氏苏木素：取氏苏木素：取2.5g Harris2.5g Harris氏苏木素溶于氏苏木素溶于25ml25ml无水乙醇无水乙醇中，另将钾明矾加温溶于中，另将钾明矾加温溶于500ml500ml蒸馏水中，待钾明矾全部溶解，蒸馏水中，待钾明矾全部溶解，再将二液混合在一起，加入氧化汞，溶解再将二液混合在一起，加入氧化汞，溶解30min30min，冷却后过滤，冷却后过滤，使用时加醋酸使用时加醋酸4ml4ml，可增加染色强度。，可增加染色强度。第35页，共80页，编辑于2022年，星期五3.3.甲
28、基绿：取甲基绿：取2 2甲基绿水溶液甲基绿水溶液20ml20ml倾入洁净的分液漏斗，加入三氯甲倾入洁净的分液漏斗，加入三氯甲烷充分摇荡混合，使甲基绿中的甲基紫溶于氯仿中而呈紫红色。旋动烷充分摇荡混合，使甲基绿中的甲基紫溶于氯仿中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，移去紫红色的三氯甲烷，如此反复更换氯仿，分液漏斗下部的砂塞，移去紫红色的三氯甲烷，如此反复更换氯仿，直到氯仿为无色。直到氯仿为无色。4.4.核固红：取核固红：取0.1g0.1g核固红溶于核固红溶于100ml 15100ml 15硫酸铝水溶液，加热溶解，硫酸铝水溶液，加热溶解，冷却后过滤。冷却后过滤。5、衬染剂的选择和配制、衬染剂的选择
29、和配制第36页，共80页，编辑于2022年，星期五第37页，共80页，编辑于2022年，星期五第38页，共80页，编辑于2022年，星期五第39页，共80页，编辑于2022年，星期五第40页，共80页，编辑于2022年，星期五第41页，共80页，编辑于2022年，星期五第42页，共80页，编辑于2022年，星期五第43页，共80页，编辑于2022年，星期五第44页，共80页，编辑于2022年，星期五第45页，共80页，编辑于2022年，星期五第46页，共80页，编辑于2022年，星期五第47页，共80页，编辑于2022年，星期五第48页，共80页，编辑于2022年，星期五第49页，共80页，编
30、辑于2022年，星期五第50页，共80页，编辑于2022年，星期五第51页，共80页，编辑于2022年，星期五RT-PCR基本技术基本技术第52页，共80页，编辑于2022年，星期五TrizolTrizol提取提取RNARNA原理原理 Trizol Trizol法提取细胞总法提取细胞总RNARNA是目前常用的提取方法。细胞是目前常用的提取方法。细胞内大部分的内大部分的RNARNA与蛋白质结合在一起，以核蛋白形式存在。与蛋白质结合在一起，以核蛋白形式存在。TrizolTrizol内含异硫氰酸胍和苯酚等物质。异硫氢酸胍内含异硫氰酸胍和苯酚等物质。异硫氢酸胍(GuSCN)(GuSCN)是一种强的蛋白
31、质变性剂，不仅能使细胞裂解，同时还能是一种强的蛋白质变性剂，不仅能使细胞裂解，同时还能有效地抑制细胞内源性有效地抑制细胞内源性RNARNA酶的活性。通过有机溶剂的分步酶的活性。通过有机溶剂的分步抽提，最终可获得纯度较高的细胞总抽提，最终可获得纯度较高的细胞总RNARNA。第53页，共80页，编辑于2022年，星期五RNARNA提取注意事项提取注意事项 vTrizolTrizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。如皮试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。如皮肤接触肤接触TrizolTrizol，请立即用大量水冲洗。，请立即用大量水冲洗。vRNaseRNase污染的主要来源是操作过程中
32、手和空气中的浮沉，注意污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注意随时勤换手套，样品尽可能盖严；尽量不要对着随时勤换手套，样品尽可能盖严；尽量不要对着RNARNA样品呼气样品呼气或说话。用或说话。用0.01%0.01%的的DEPCDEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用需用DEPCDEPC水配制。水配制。v细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分因为一部分RNARNA会残留在未裂解的细胞中。在清洗和裂解细胞时会残留在未裂解的细胞中。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作
33、过程中释放的内源最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNaseRNase降解了降解了RNARNA。第54页，共80页，编辑于2022年，星期五逆转录逆转录(Reverse Transcription)逆转录指遗传信息从逆转录指遗传信息从RNA流向流向DNA，是是RNA指导下的指导下的DNA合成过程，即以合成过程，即以RNA为为模板，四种模板，四种dNTP为原料，合成与为原料，合成与RNA互补的互补的DNA单链，单链，称为互补称为互补DNA(complementary DNA,cDNA)逆转录酶逆转录酶第55页，共80页，编辑于2022年，星期五逆转录原理逆转录原理vcDNA合成有两个关
34、键因素，一是病毒RNA的质量，二是逆转录酶。v逆转录酶是一种多功能酶，它能在一定的条件下，以单链RNA为模板合成第一条cDNA链。v通过RNaseH活性水解RNA-DNA杂合分子中的RNA链。第56页，共80页，编辑于2022年，星期五逆转录酶逆转录酶 催化逆转录过程的酶称逆转录酶，催化逆转录过程的酶称逆转录酶，RNA病毒中都含有此酶。病毒中都含有此酶。具有三种酶活性：具有三种酶活性：v RNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶v RNA水解酶活性水解酶活性 v DNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶第57页，共80页，编辑于2022年，星期五逆转录体系逆转录体系RNARNA模板模板 3UUAGGC
35、CUGGAUAAGCGCCUGGA 5引物引物 5ATCCGGAC 逆转录酶逆转录酶dATPdATPdGTPdGTPdCTPdCTPdTTPdTTPMn2+Mn2+酶活性依赖金属离子酶活性依赖金属离子底物底物第58页，共80页，编辑于2022年，星期五逆转录过程中逆转录过程中cDNA的合成的合成依赖依赖RNA的的DNA聚合酶聚合酶核糖核酸酶核糖核酸酶H活力活力依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶第59页，共80页，编辑于2022年，星期五逆转录引物的选择逆转录引物的选择vOligo(dT)(12-18个核苷酸组成），只有mRNA被逆转录v随机六聚寡核苷酸，所有RNA均被逆转录v基因特异性引物，
36、仅产生需要的DNA第60页，共80页，编辑于2022年，星期五以DNA为模板，利用DNA聚合酶的特性体外扩增特定的基因片断，这种方法被称为DNA聚合酶链式反应。PCR 基因放大连琐反应PCR反应反应第61页，共80页，编辑于2022年，星期五PCR基本原理基本原理v利用高温可使DNA变性和低温可使DNA复性的特性，根据体内细胞分裂中DNA半保留复制机理，以特异性寡核苷酸为引物，DNA分子为模板，在DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸存在的条件下体外合成新DNA分子的过程。v这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。第62页，共80页，编辑于2022年，
37、星期五第63页，共80页，编辑于2022年，星期五PCR基本成分基本成分vtemplatetemplatevprimersprimersvTaq polymeraseTaq polymerasev10PCR buffer10PCR buffervdNTPsdNTPsvMgMg+第64页，共80页，编辑于2022年，星期五PCR Primerswww.ncbi.nlm.nih.gov第65页，共80页，编辑于2022年，星期五PCR Primersv序列发现的时间和发现者v序列的生物体来源v序列的组织来源第66页，共80页，编辑于2022年，星期五第67页，共80页，编辑于2022年，星期五引物
38、设计引物设计v引物长度（length）:2030bpv引物中四种碱基的分布应该是随机的v两引物间不能有互补序列，尤其是3端v引物的碱基顺序不应与非扩增区域由同源性v引物的3末端碱基一定要与模板DNA配对v可以在5末端加上限制性内切酶位点或起始密码v解链温度(Tm)：两引物间相差不大于5v引物内部不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在第68页，共80页，编辑于2022年，星期五PCR基本程序基本程序v预变性（Pre-denaturation)v变性(Denaturation)v退火(Annealing)v延伸(Elongation)v25-30 cycles第69页，共80页，编辑于2
39、022年，星期五PCR反应反应v取无菌02ml PCR管一支，加入：v10PCR缓冲液 5lv氯化镁 4lv4种NTP混合液(10mmol/L)05lv3端引物(10mol/L)1lv5端引物(10mol/L)1lvTaq DNA多聚酶(5u/l)025lv三蒸水 3325lv模板cDNA 5lv盖紧盖子，离心数秒后置PCR仪上进行扩增。PCR循环为：95预变性2 min，95变性30 s、55复性30 s、72延伸1 min，30个循环，最后72C延伸7 min。第70页，共80页，编辑于2022年，星期五细细胞胞裂裂解解RNARNA释放释放释放释放cDNAcDNAPCRPCR扩增扩增扩增扩
40、增逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶耐热耐热耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶RT-PCRRT-PCR扩增扩增扩增扩增引物引物dNTPs二价金属离子二价金属离子DNA聚合酶聚合酶引物引物dNTPs二价金属离子二价金属离子逆转录酶逆转录酶RT-PCR过程过程逆转录酶逆转录酶/耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶第71页，共80页，编辑于2022年，星期五琼脂糖凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳技术第72页，共80页，编辑于2022年，星期五琼脂糖凝胶电泳基本原理琼脂糖凝胶电泳基本原理v琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖作为固体支持物的一种电泳方法。v因为各种核酸分子的电荷及质量之比是相近的，在没有支持物的电场
41、中，它们以相同的速度前进。v琼脂糖凝胶电泳具有分子筛效应，所以在适当浓度的琼脂糖凝胶中电泳，线性DNA分子在电场中的迁移率与其分子量的对数成反比，从而达到分离的目的。第73页，共80页，编辑于2022年，星期五琼脂糖凝胶电泳分离的原理琼脂糖凝胶电泳分离的原理v使 TAE浸过凝胶表面v在阴极的加样孔加样（红正黑负）v分子筛作用v分子量越小，迁移速度越快第74页，共80页，编辑于2022年，星期五琼脂糖凝胶的浓度与琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围分离范围Separation Range Vs.%Agarose第75页，共80页，编辑于2022年，星期五琼脂糖凝胶浓度与分离效率琼脂糖凝胶浓度与分离效
42、率大片段在大片段在 0.7%0.7%琼脂糖琼脂糖凝胶中分离效果好凝胶中分离效果好小小片段在片段在 1.5%1.5%琼脂糖琼脂糖凝胶中分离效果好凝胶中分离效果好第76页，共80页，编辑于2022年，星期五上样上样v上样缓冲液v甘油可增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内v在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置v使样品呈色，使加样操作更方便vEDTA,SDS 可灭活限制性内切酶第77页，共80页，编辑于2022年，星期五溴化乙锭溴化乙锭(EB)染色染色EBEB堆砌在堆砌在堆砌在堆砌在DNADNA双螺旋的双螺旋的碱基对之间碱基对之间DNADNA 分子越小分子越小,
43、结合的结合的EBEB 越少越少,染色越淡染色越淡溴化乙锭是一种荧光染料溴化乙锭是一种荧光染料溴化乙锭是一种荧光染料溴化乙锭是一种荧光染料,可嵌入核酸双链的碱基对可嵌入核酸双链的碱基对可嵌入核酸双链的碱基对可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，之间，在紫外线激发下，之间，在紫外线激发下，之间，在紫外线激发下，发出红色荧光，常用发出红色荧光，常用发出红色荧光，常用发出红色荧光，常用 0.5mg/ml0.5mg/ml+第78页，共80页，编辑于2022年，星期五注意事项注意事项v一定要等凝胶冷却至60时再入加溴化乙锭v切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负)v加完样品后最好先观察一段时间v插电极或拔电极时必须将仪器电源关掉v不要使样品跑出凝胶第79页，共80页，编辑于2022年，星期五谢 谢！第80页，共80页，编辑于2022年，星期五