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1、实验植物组织中过氧化实验植物组织中过氧化氢酶的活力测定氢酶的活力测定第1页，共10页，编辑于2022年，星期五一、实验目的一、实验目的l1.掌握酶活力测定的方法l2.了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理第2页，共10页，编辑于2022年，星期五二、实验原理二、实验原理l过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。lR(Fe2+)+H2O2=R(Fe3+OH)lR(Fe3+OH)2+H2O2=R(Fe2+)2+2H2O+O2第3页，共10页，编辑于2022年，星期五l据此，可根据据此，可根据H2O2的消耗
2、量或的消耗量或O2的生成量测的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的的H2O2，即可求出消耗的，即可求出消耗的H2O2的量。的量。l5 H2O2+2KMnO4+4H2SO4=5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4第4页，共10页，编辑于2022年，星期五三、材料、试剂与器具三、材料、试剂与器具 1.材料：材料：小麦叶片2.试剂试剂（1）10%H2SO4；（2）0.2mol/L磷酸缓冲
3、液pH7.8；（3）0.02mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；（4）0.1mol/L H2O2：市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；（5）0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4 2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。第5页，共10页，编辑于2022年，星期五3.器具器具（1）恒温水浴；（2）研钵；三角瓶50ml4；酸式滴定管（10ml）；容量瓶25ml
4、1等第6页，共10页，编辑于2022年，星期五四、实验步骤四、实验步骤1.酶液提取酶液提取l取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将缓冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。第7页，共10页，编辑于2022年，星期五2.反应反应l取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO4 2.5ml。3.滴定滴定
5、l用0.02mol/L KMn4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30S内不消失）为终点。第8页，共10页，编辑于2022年，星期五五、计算五、计算l酶活力用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示l酶活(mgH2O2/gmin)=l式中：A对照KMnO4滴定毫升数；B酶反应后KMnO4滴定毫升数；VT酶液总量（ml）；V1反应所用酶液量（ml）；F W样品鲜重（g）；1.71ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2第9页，共10页，编辑于2022年，星期五六、研讨题六、研讨题l1.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?l2.过氧化
6、氢酶与哪些生化过程有关过氧化氢酶与哪些生化过程有关?l3.过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收法，过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收法，原理是原理是H2O2在在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。请你查阅资量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。请你查阅资料设计一个应用该方法测定过氧化氢酶活力的实验。料设计一个应用该方法测定过氧化氢酶活力的实验。第10页，共10页，编辑于2022年，星期五