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1、实验十一淋巴细胞玫瑰花结实验第1页，共17页，编辑于2022年，星期五一、实验目的一、实验目的1.1.掌握人淋巴细胞的制备原理和方法及绵掌握人淋巴细胞的制备原理和方法及绵羊红细胞悬液的制备。羊红细胞悬液的制备。2.2.掌握淋巴细胞玫瑰花结制备方法并了解掌握淋巴细胞玫瑰花结制备方法并了解该技术在实际工作中的用途。该技术在实际工作中的用途。第2页，共17页，编辑于2022年，星期五 人外周血人外周血T T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体,在体外一定条件在体外一定条件下将人淋巴细胞与绵羊红细胞两者混合下将人淋巴细胞与绵羊红细胞两者混合,可以形成以可以形成以T T细胞为中心
2、细胞为中心,周围黏附着多个绵羊红细胞的花环周围黏附着多个绵羊红细胞的花环,为为E E花环试验花环试验(erythrocyte(erythrocyte rosette test)rosette test)。应用最广的有总。应用最广的有总E E花环试验花环试验(Et,t(Et,t为为totaltotal的缩写的缩写)和和活性活性E E花环试验花环试验(Ea,a(Ea,a为为active active 的缩写的缩写)。EtEt代表被检标本代表被检标本中中T T淋巴细胞的总数淋巴细胞的总数,Ea,Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的的T T细胞数细胞数,这部分这部分T
3、 T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化。功能和动态变化。E E花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能。广泛应用花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能。广泛应用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究,为某些疾病为某些疾病诊断和防治提供免疫学方面的重要参考。诊断和防治提供免疫学方面的重要参考。二、实验原理二、实验原理第3页，共17页，编辑于2022年，星期五n nE E玫瑰花环实验玫瑰花环实验判断细胞免疫功能判断细胞免疫功能TBTT T淋巴细胞玫瑰花结淋巴细胞玫瑰花结电镜照片电镜照片T T淋巴细胞玫瑰淋巴细胞玫瑰
4、花结示意图花结示意图第4页，共17页，编辑于2022年，星期五三、实验仪器、材料和试剂三、实验仪器、材料和试剂1 1、材料、材料无菌抽取的人静脉血无菌抽取的人静脉血,加入事先有适量肝素加入事先有适量肝素液的试管内液的试管内,混匀抗凝。混匀抗凝。健康绵羊红细胞健康绵羊红细胞小牛血清（经小牛血清（经5630min5630min灭活）。按灭活）。按1010：1 1加加入洗过的压积兔红细胞，混匀。于入洗过的压积兔红细胞，混匀。于3737吸收吸收30min30min，44冰箱过夜。然后以冰箱过夜。然后以2000r/min2000r/min离离心心10min10min。取上清液经蔡氏滤器过滤后，无。取上清
5、液经蔡氏滤器过滤后，无菌条件下分装于小瓶。低温保存。菌条件下分装于小瓶。低温保存。第5页，共17页，编辑于2022年，星期五三、实验仪器、材料和试剂三、实验仪器、材料和试剂2、试剂试剂抗凝剂：抗凝剂：1%的肝素钠生理盐水溶液。的肝素钠生理盐水溶液。0.90%0.90%的生理盐水。的生理盐水。AlsverAlsvers s溶液。溶液。HankHank溶液。溶液。细胞分层液：上海试剂二厂产品。细胞分层液：上海试剂二厂产品。0.8%0.8%戊二醛溶液：使用前戊二醛溶液：使用前15min15min用生理盐水或用生理盐水或HankHank液配制。液配制。染色液：瑞氏或染色液：瑞氏或GiemsaGiems
6、a染液。染液。1%1%醋酸溶液醋酸溶液 。第6页，共17页，编辑于2022年，星期五三、实验仪器、材料和试剂三、实验仪器、材料和试剂3 3、仪器、仪器光学显微镜、离心机、水浴锅、血细胞计数光学显微镜、离心机、水浴锅、血细胞计数板、板、50UL微量加样器、医用剪刀及眼科镊微量加样器、医用剪刀及眼科镊子、蔡氏滤器、刻度离心管（子、蔡氏滤器、刻度离心管（10ml）、滴管）、滴管及吸管、载玻片和盖玻片。及吸管、载玻片和盖玻片。第7页，共17页，编辑于2022年，星期五四、方法与步骤四、方法与步骤1.1.绵羊红细胞悬液的制备绵羊红细胞悬液的制备依无菌手续从从绵羊颈静脉取血，放置依无菌手续从从绵羊颈静脉取
7、血，放置4 4倍体积倍体积的的AlsverAlsvers s 液中，摇匀（放置液中，摇匀（放置44冰箱保存，限冰箱保存，限7 71010天内用）。天内用）。临用前用临用前用HankHank液洗涤液洗涤3 3次，每次次，每次1000r1000r，离心，离心5min5min。取压积的绵羊红细胞。取压积的绵羊红细胞用用Hank液配成液配成1%的细胞悬液（的细胞悬液（约约2107 个个/ml）第8页，共17页，编辑于2022年，星期五四、方法与步骤四、方法与步骤洗涤后悬浮的红血球洗涤后悬浮的红血球红血球在血球计数板上的密度红血球在血球计数板上的密度第9页，共17页，编辑于2022年，星期五密度梯度离心
8、分离纯化密度梯度离心分离纯化淋巴细胞示意图淋巴细胞示意图四、方法与步骤四、方法与步骤2.2.淋巴细胞的分离和制备淋巴细胞的分离和制备取取1 1支洁净、干燥的离心管加入人抗支洁净、干燥的离心管加入人抗凝血凝血1ml1ml，再加入，再加入1mlHanks1mlHanks液稀释血液稀释血液；液；取取1 1支洁净、干燥的离心管，加支洁净、干燥的离心管，加入入1ml1ml细胞分层液；细胞分层液；用吸管吸取上述稀释血液，沿离用吸管吸取上述稀释血液，沿离心管管壁加于细胞分层液的表面心管管壁加于细胞分层液的表面（不能冲乱液面）。以（不能冲乱液面）。以3000r/min3000r/min离心离心20min20m
9、in，可出现分层，详见图，可出现分层，详见图。第10页，共17页，编辑于2022年，星期五经离心分离纯化后的经离心分离纯化后的血浆和分层液之间的血浆和分层液之间的灰白色淋巴细胞照片灰白色淋巴细胞照片 第11页，共17页，编辑于2022年，星期五四、方法与步骤四、方法与步骤用吸管将血浆和分层液之间的乳白色淋巴细胞层用吸管将血浆和分层液之间的乳白色淋巴细胞层吸至含吸至含1.5mlHank1.5mlHank液的离心管中，混合后后液的离心管中，混合后后2000r/min2000r/min离心离心5min5min。弃上清，沉淀用。弃上清，沉淀用HankHank液重液重复洗一次，于沉积细胞中加复洗一次，于
10、沉积细胞中加0.5mlHank0.5mlHank液混匀液混匀,取取2 20ul淋巴细胞悬液，加淋巴细胞悬液，加0.78ml1%0.78ml1%的醋酸混匀，的醋酸混匀，将淋巴细胞配成将淋巴细胞配成5x105x106 6个个/ml/ml。第12页，共17页，编辑于2022年，星期五3.3.反应：取淋巴细胞悬液（反应：取淋巴细胞悬液（5105106 6个个/ml/ml）0.1ml0.1ml；加；加入灭活吸收的小牛血清入灭活吸收的小牛血清0.1ml0.1ml，再加入，再加入2102107 7 个个/mlml绵羊红细胞悬液绵羊红细胞悬液0.2ml0.2ml混匀；使淋巴细胞与绵羊混匀；使淋巴细胞与绵羊红细
11、胞的比例分别为红细胞的比例分别为1 1：8 8（活性玫瑰花结）。置（活性玫瑰花结）。置3737孵育孵育5min5min，其间轻轻摇动，其间轻轻摇动2323次。次。取出离心管，以取出离心管，以500 r/min500 r/min离心离心5min5min，将离，将离心管置心管置4 40 0冰箱放置冰箱放置5min5min。取出后轻轻旋转混匀（切不可甩动试管，以免花取出后轻轻旋转混匀（切不可甩动试管，以免花环脱落）。沿管壁加入环脱落）。沿管壁加入0.8%0.8%戊二醛溶液戊二醛溶液3 3滴，再轻滴，再轻旋转混匀。置旋转混匀。置44，5min5min。自冰箱取出后，以自冰箱取出后，以500 r/min
12、500 r/min离心离心5min5min，弃，弃上清，沉淀混匀制片。上清，沉淀混匀制片。四、方法与步骤四、方法与步骤第13页，共17页，编辑于2022年，星期五4、制片、制片 取取1滴标本悬液滴于载玻片上（载玻片事先浸在蒸馏滴标本悬液滴于载玻片上（载玻片事先浸在蒸馏水中置水中置4冰箱），使悬液自然均匀铺开，待自然干燥或冰箱），使悬液自然均匀铺开，待自然干燥或微风吹干后，用瑞氏染液染色微风吹干后，用瑞氏染液染色510min。用自来水冲去染。用自来水冲去染液，待干燥后镜检计数。液，待干燥后镜检计数。5、计数方法、计数方法 在高倍镜或油镜下数在高倍镜或油镜下数200个淋巴细胞，每个淋巴细胞个淋巴细
13、胞，每个淋巴细胞结合结合3个以上的绵羊红细胞为玫瑰花结形成细胞。形成玫个以上的绵羊红细胞为玫瑰花结形成细胞。形成玫瑰花结的淋巴细胞数目以百分率表示。瑰花结的淋巴细胞数目以百分率表示。四、方法与步骤四、方法与步骤第14页，共17页，编辑于2022年，星期五五、实验结果五、实验结果T T淋巴细胞玫瑰花结淋巴细胞玫瑰花结光镜照片光镜照片第15页，共17页，编辑于2022年，星期五1.1.一定要用新鲜血，否则会影响细胞活性，且红细一定要用新鲜血，否则会影响细胞活性，且红细 胞受体会从胞受体会从T T细胞表面脱落。细胞表面脱落。2.2.计数前，重悬和混匀细胞要轻柔，否则花结会散计数前，重悬和混匀细胞要轻柔，否则花结会散 开消失。开消失。六六.注意事项注意事项第16页，共17页，编辑于2022年，星期五七七.思考题思考题试述试述E E玫瑰花结实验的目的及其意义玫瑰花结实验的目的及其意义。简述活性简述活性E E玫瑰花结实验条件玫瑰花结实验条件。计算实验中形成活性玫瑰花结的百分计算实验中形成活性玫瑰花结的百分率率注：注：E E花结形成百分率花结形成百分率=形成花结细胞数形成花结细胞数/（花结细胞数（花结细胞数+未形成花结细胞数）未形成花结细胞数）X100X100%第17页，共17页，编辑于2022年，星期五