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1、实验十二实验十二 土壤中微生物的分离及纯化土壤中微生物的分离及纯化 （设计性实验）（设计性实验）1一、目的要求一、目的要求 1、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；基本操作技术；2、初步观察来自土壤中的三大类群微生物的菌落形态、初步观察来自土壤中的三大类群微生物的菌落形态特征；特征；3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。本技能。2二、基本原理二、基本原理（一）土壤是微生物生存的大本营，所含微生物无论是数量还（一）土壤是微生物生存的大本营，所含微生物无论是数量还是种
2、类都是极其丰富的，原因是什么？是种类都是极其丰富的，原因是什么？由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以酸碱度、渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以说，土壤是微生物的说，土壤是微生物的“天然培养基天然培养基”，也是它们的，也是它们的“大本营大本营”因此，土壤是因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可与从微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可与从中分离、纯化获得许多有价值的菌株。中分离、纯化获
3、得许多有价值的菌株。3（二）如何分离？（二）如何分离？在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。为微生物的分离与纯化。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据
4、该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法稀释涂布平板法或或平板划线分离法平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征
5、外，还要结合显微镜检测个体形态特征因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征（产酸产气情况、染色情况、营养要求、氧气需求、酸碱度、渗透压和温度等）（产酸产气情况、染色情况、营养要求、氧气需求、酸碱度、渗透压和温度等）鉴定方能得到。鉴定方能得到。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。程称为微生物的分离与纯化。4（三）平板菌落计数法的原理（三）
6、平板菌落计数法的原理 将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上，经过培养后在平板上形将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上，经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度（一般选择每个平板上长有中细胞密度（一般选择每个平板上长有50-200个菌落的稀释度计算每个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适）。毫升的含菌量较为合适）。由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自两个或多个细胞。菌落
7、不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自两个或多个细胞。因此，平板菌落记数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在因此，平板菌落记数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用使用菌落形成单位菌落形成单位取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。该法虽然操作较繁琐，结果需要培养一段时间才能获得，而且测定结果该法虽然操作较繁琐，结果需要培养一段时间才能获得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该方法能直接反映样品中活细胞数量，所易受多种因素的影响，但是，由于该方法能直接反映样品中活细胞数量，所以被广泛用于生物制品（如活菌制剂）、食品、
8、饮料、水（包括水源水）以以被广泛用于生物制品（如活菌制剂）、食品、饮料、水（包括水源水）以及多类产品等质量检测与控制的标准方法。快速细菌自动稀释仪和自动菌落及多类产品等质量检测与控制的标准方法。快速细菌自动稀释仪和自动菌落计数仪则提供快速准确的结果。计数仪则提供快速准确的结果。5培养基培养基的类型的类型？6三、实验器材三、实验器材1、土壤样品（自带）、土壤样品（自带）2、培养基：淀粉琼脂培养基（高氏、培养基：淀粉琼脂培养基（高氏号培养基），牛肉号培养基），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基。膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基。3、溶液和试剂：、溶液和试剂：10酚，链霉素，盛酚，链霉素，
9、盛9ml无菌水的试管，无菌水的试管，盛盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。4、仪器和其他用品：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，无菌培、仪器和其他用品：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，无菌培养皿等。养皿等。7四、操作步骤四、操作步骤 1、倒平板、倒平板 标记，最好写在皿底边上，以防盖子盖错；标记，最好写在皿底边上，以防盖子盖错；加热熔化三种培养基，冷至加热熔化三种培养基，冷至5560时，在高氏时，在高氏号培养基中加入号培养基中加入10酚数滴，马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液（终质量浓度为酚数滴，马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液（终质量浓度为30ul/mg），混匀后看清标记分别倒
10、平板，在火焰附近，每皿倒），混匀后看清标记分别倒平板，在火焰附近，每皿倒1520ml，静置凝固后备用；，静置凝固后备用；(若皿盖上冷凝水过多，最好用灭菌棉花或若皿盖上冷凝水过多，最好用灭菌棉花或灭菌纸擦后再涂布灭菌纸擦后再涂布)82、稀释土样、稀释土样 制备土壤稀释液称取土样制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用一支一支1ml无菌吸管从中吸取无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，无菌水的试
11、管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。各种稀释度的土壤溶液。减小误差应注意的方面：减小误差应注意的方面：称量准确；称量准确；土样与水混合，一定要摇匀；土样与水混合，一定要摇匀；每次稀释取液应换一支新的吸管；每次稀释取液应换一支新的吸管；每次取液时应先混匀试管中的溶液；每次取液时应先混匀试管中的溶液；9各培养基涂布菌液时对稀释度的选择：牛肉膏
12、蛋白胨培养基10-4、10-5、10-6；高氏一号培养基：10-3、10-4、10-5；马铃薯培养基：10-2、10-3、10-4；平板菌落计数法，所选择倒平平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。减少稀释度加以调整。10平板分离平板分离113、涂布：、涂布：标记：选择标记：选择3个稀释度写在平板底部；个稀释度写在平板底部；取样：每皿准确取悬液取样：每
13、皿准确取悬液0.2ml，放于平板中央；（注意每次取液时，放于平板中央；（注意每次取液时应先混匀试管中的溶液）应先混匀试管中的溶液）涂布：在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直涂布：在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向90沿另一垂直线来沿另一垂直线来回推动，平板内缘处可改变方向用涂棒再涂布几次，室温下静置回推动，平板内缘处可改变方向用涂棒再涂布几次，室温下静置510分钟；分钟；注意涂棒的正确使用。注意涂棒的正确使用。124、培养：、培养：将含高氏将含高氏号培养基和马丁氏琼脂培养基
14、的平板倒置于号培养基和马丁氏琼脂培养基的平板倒置于28温室温室中培养中培养35天，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板倒置于天，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板倒置于37温室中培养温室中培养12天。天。5、记数：、记数：培养培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算，均数，并按下列公式进行计算，每毫升中菌落形成单位每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数同一稀释度三次重复的平均菌落数稀释倍数稀释倍数56、镜检纯培养：挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培、镜检纯培养：挑菌落将培养后
15、长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置养基的斜面上，分别置28和和37温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。13五、实验报告五、实验报告、将培养后菌落计数结果填入表格（实验教材、将培养后菌落计数结果填入表格（实验教材P34表表II-5）、你所做的涂布平板法是否较好地得到了单菌落？如果不、你所做的涂布平板法是否较好地得到了
16、单菌落？如果不是，请分析其原因。是，请分析其原因。、在种不同的平板上你分离得到那些类群的微生物？简、在种不同的平板上你分离得到那些类群的微生物？简述它们的菌落形态特征。述它们的菌落形态特征。14六、思考题六、思考题1 1、如何确定平板上单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。、如何确定平板上单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。2 2、如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样，分离培养基有何、如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样，分离培养基有何特点？说明理由。特点？说明理由。3 3、怎样判断稀释涂布平板计数数据是否可靠？需要掌握哪几个关键？、怎样判断稀释涂布平板计数数据是否可靠？需要掌握哪几个关键？4 4、为什么高氏、为什么高氏号培养基和马丁氏琼脂培养基中要分别加入酚和链霉号培养基和马丁氏琼脂培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基分离一种对青霉素具有抗性的细素？如果用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？菌，你认为应如何做？5 5、某单位希望检测一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计、某单位希望检测一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1-21-2种可行种可行的检测方法。的检测方法。15 实验十三实验十三 菌种保藏菌种保藏16