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1、药品QC微生物实验室管理2 2/168目录n微生物实验室质量管理与保障nUSP微生物检测技术精要n培养基的质量控制和规范化操作n菌种管理（保藏、传代、分离和鉴定等）n药品微生物检测分析方法的验证3 3/168第一部分微生物实验室质量管理与保障4 4/168目录4 43 31 1 概述及法规要求WHO微生物实验室管理要求实例质量管理与保障管理2 2微生物实验室的风险分析5 5/168无菌检查和微生物限度检查的性质和特点药品微生物的检验结果受很多因素的影响，如样品中微生物可能分布不均匀、微生物检验方法的误差较大等。因此，在药品微生物检验中，为保证检验结果的可靠性，必须使用经验证的检测方法并严格按照
2、药品微生物实验室规范要求进行。药品微生物实验室管理用于指导药品微生物检验实验室的质量控制及质量保证。6 6/168无菌检查和微生物限度检查的性质和特点这决定了微生物检验质量保证的高要求。药品的无菌和微生物限度检测是指按照一定的检测程序和质量控制措施，l确定要求无菌的样品中是否存有活的或者不允许存在的微生物（定性试验一次检出不得复试），l或者确定单位（g/ml）样品中存在微生物的数量（定量试验）7 7/168相关法规和指南相关法规l2010年版中国药典一部附录XVIIIGl2010年版中国药典二部附录XIXQlUSP36版MICROBIOLOGICALBESTLABORATORYPRACTICE
3、SlWHOTechnicalReportSeries,No.961,2011Annex2WHOgoodpracticesforpharmaceuticalmicrobiologylaboratorieslFDA药品质量控制微生物实验室检查指南8 8/168微生物实验室的风险分析人员风险人员风险p人员配置不足，不能准确及时完成岗位工作。p培训不足，工作人员不能按照SOP要求完成岗位工作。9 9/168微生物实验室的风险分析环境风险环境风险p环境洁净度：环境未达标，检验室环境污染导致测试结果阳性。p实验室功能区设计不合理，污染无菌室。p未对进入微生物实验室的人员进行限制，造成实验室污染。p所用消毒
4、剂管理不规范，未进行消毒效果验证，不能有效保证洁净区的微生物控制。1010/168微生物实验室的风险分析检测方法风险检测方法风险p检测方法的制定不符合法规要求。p检测方法未进行确认或验证。1111/168微生物实验室的风险分析设备风险设备风险p用于实验室的设备、仪器和其它装置未按要求进行验证和校准。p用于实验室的设备、仪器和其它装置维护不足。p实验室的设备、仪器和其它装置的监控未按要求进行。1212/168微生物实验室的风险分析试液及培养基风险试液及培养基风险p未对供应商进行审核，不能保证试液及培养基质量。p未按照要求储存条件进行储存，对试液及培养基质量产生不良影响。p试液及培养基的配制未进行
5、监控或验证，对试液及培养基质量产生不良影响。p未对试液及培养基进行质量检查，不能保证试液及培养基质量。p试液及培养基有效期管理不规范。1313/168微生物实验室的风险分析菌种风险菌种风险p未对供应商进行审核，菌种质量不能保证。p未按照要求储存条件进行储存，降低菌种活力。p菌种操作（复苏、传代、保存）不规范，造成菌种污染和活力降低。p未对保藏菌种进行质量检查，不能保证菌种的纯度及菌种特性。p菌种使用有效期管理不规范。1414/168微生物实验室的风险分析样品管理风险样品管理风险p取样操作管理不规范，污染样品。p样品传递、保存、分发不规范，对样品中微生物产生不利影响或直接导致检验结果错误（如需阴
6、凉存放的样品，放在普通环境，导致样品变质或被污染；分发错误，理化检测的样品用于微生物检测）。p物品：消毒、灭菌措施未经验证，如灭菌釜温度过高，培养基被破坏，微生物没办法真实表达出来，造成假阴性结果。消毒、灭菌后存放条件不合适或放置时间过长造成污染。1515/168微生物实验室的风险分析污物处理管理风险污物处理管理风险p污染物质的处理过程不适当，造成环境和人员的污染。p未按操作规程处理剩余样品，特别是剧毒样品、生物样品，导致严重的环境污染，甚至对人员健康造成不良影响。（检验样品、有毒的溶液、用过的培养基、动物实验动物及其排泄物）1616/168微生物实验室的风险分析质量保证和质量控制质量保证和质
7、量控制风险风险p实验室未制定内部质量保证和质量控制体系（如偏差的处理、加标样品的使用、重复性检测和操作的熟练度），不能保证每天的检测结果与标准规定的一致性。1717/168质量管理和保障管理5.废弃物的处理6.检测报告7.样品8.检测步骤1.人员2.环境3.检验方法的验证4.结果质量保证和操作质量控制9.样品操作和鉴别10.标准物质和标准培养基11.试剂和培养基12.设备微生物实验室管理1818/168WHO微生物实验室管理要求实例区域安装级别推荐要求样品接收无级别无级别培养基制备无级别无级别灭菌前室无级别无级别灭菌后室（无菌区域内）GradeBISO5and10cfu/m3无菌测试（操作区）
8、GradeAISO5and1cfu/m3无菌测试（背景区）GradeBISO5and10cfu/m3操作区域布局-11919/168WHO微生物实验室管理要求实例区域安装级别推荐要求无菌测试（隔离器）GradeAISO5and1cfu/m3无菌测试（隔离器背景）无级别无级别培养箱无级别无级别计数区域无级别（关键步骤应在层流区域操作）无级别（关键步骤应在层流区域操作）清洁区域无级别无级别操作区域布局-22020/168WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率培养箱冰箱冷库、烘箱清洁和消毒内部外部每月需要时（3个月）需要时（每年）水浴清洁、消毒、更换用水每月每6月灭菌剂消毒离心机维护清洁和消
9、毒每年每次使用高压蒸汽灭菌器外观检查维护压力容器安全检查按照供应商要求每年（按照供应商要求）每年设备维护-12121/168WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率安全柜层流柜维护及机械检查每年（按照供应商要求）显微镜维护每年厌氧罐清洁和消毒每次使用培养基分配装置清洁及适当消毒每次使用螺旋震荡器清洁及消毒每次使用实验室清洁和消毒工作区域、地面清洁和消毒其它表面每次使用每3月设备维护-22222/168WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率标准液体温度计全量程校准单点校准（通常为0点）每3年每年标准热电偶全量程校准标准温度计核对每3年每年工作温度计和工作热电偶标准温度计冰点和/或全
10、量程核对每年湿度计校准每次使用设备校准及频率2323/168WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率温控设备确认温度的稳定性和均一性温度监控每2年及维修改造后每次使用干热灭菌柜确认温度的稳定性和均一性温度监控每2年及维修改造后每次使用高压蒸汽灭菌器确认温度的稳定性和均一性温度监控每2年及维修改造后每次使用无菌测试A级区安全柜隔离器性能确认微生物监控空气流型监控高效过滤器完整性监控每年及维修改造后每次使用每6月每6月设备确认及监控-12424/168WHO微生物实验室管理要求实例设备类型要求频率单向层流柜性能确认微生物监控空气流型监控高效过滤器完整性监控每年及维修改造后每周每6月每6月培养
11、基分配器体积分配检查每次调节及复位移液管体积分配精确性检查定期（依据使用频率确定）厌氧罐/培养箱厌氧指示剂检查每次使用实验室环境空气及表面微生物污染检查（通常使用空气采样器、沉降碟、接触碟、拭子）依据风险评估，建立合适的监测计划。设备确认及监控-22525/168WHO微生物实验室管理要求实例标准菌株的使用标准菌株（来源于有资质的供应商）标准储存菌株1代（冻干、液氮、超低温保存）工作菌株日常使用标准储存菌株2代（冻干、液氮、超低温保存）工作菌株日常使用标准储存菌株3代（冻干、液氮、超低温保存）工作菌株日常使用标准储存菌株4代（冻干、液氮、超低温保存）工作菌株日常使用工作菌株日常使用2626/1
12、68第二部分USP微生物检测技术精要2727/168目录1.药典微生物章节概要2.非无菌制剂的微生物检查3.无菌测试4.微生物特性确定，鉴定及菌株分型2828/168微生物专家委员会的责任范围负责不负责p微生物测试p微生物监控p水p个论（除了设立微生物限度、无菌和细菌内毒素标准）2929/168微生物学是开发、生产及成品测试的一部分n无菌控制也适用于非无菌产品n控制贯穿于一个药物或生物制剂从研发到市场到成品控制的整个过程n整个过程中的各种微生物控制的整合将提高最终产品微生物的质量保证nUSP提供了每个阶段微生物控制程序和指导3030/168作为重要组成的微生物控制n原料和组分的微生物控制n环境
13、的微生物控制n生产过程的微生物控制n成品的微生物控制n人员的微生物控制n所有微生物控制的组合微生物控制3131/168原料和组分的微生物控制的USP观点及文件n非无菌制剂的微生物检查：微生物计数测试n非无菌制剂的微生物检查：特定微生物的检验n非无菌药品的微生物属性原料和组分的微生物控制的USP观点及文件3232/168环境微生物控制的USP观点及文件n洁净室和其他受控环境的微生物评估n消毒剂与杀菌剂n无菌产品包装-完整性评估环境微生物控制的USP观点及文件3333/168过程微生物控制的USP观点及文件n灭菌与无菌保证n生物指示剂n灭菌-化学和物理指示剂，及综合指示剂n生物指示剂-耐受力测试过
14、程微生物控制的USP观点及文件3434/168成品微生物控制的USP观点及文件n无菌测试n细菌内毒素测试n热源测试n抗菌有效性测试n最终灭菌物品-参数放行n无菌产品包装-完整性评估成品微生物控制的USP观点及文件3535/168微生物章节n防腐剂-有效性n生物指示剂耐受力测试n非无菌产品的微生物检查：微生物测试n控制菌的微生物检查n无菌测试n细菌内毒素测试n灭菌生物指示剂3636/168微生物章节n消毒剂与杀菌剂n非无菌产品的微生物属性n水分活性应用n洁净室和其他受控环境的微生物评估n微生物实验室规范n无菌产品包装-完整性评估3737/168微生物章节n无菌测试-隔离系统验证n无菌-化学和物理
15、化学指示剂，及综合指示剂n灭菌和无菌保证n最终灭菌药品-参数放行n微生物替代方法验证n药物的微生物回收率验证n药典物质灭菌3838/168微生物章节n制药用水n微生物计数测试-营养和食品补充剂n控制菌的微生物检查-营养和食品补充剂n非无菌营养和食品补充剂的微生物评估3939/168非无菌制剂的微生物检查-计数方法介绍n在此描述的测试允许对在需氧条件下生长的嗜温细菌和真菌进行定量计数n这些测试设计用于确定原料药或制剂是否符合已建立的微生物质量标准。当用于这样的目的时，按下列指导进行，包括取样数量，结果诠释。n该方法不适用于将微生物作为活性成分的产品。n其它可替代的微生物程序，包括自动化方法，如果
16、已证明了其同药典方法的等效性，也可以使用。4040/168常规过程n避免产品以外的微生物污染（最大的污染源是什么？）n去除细菌抑制/真菌抑制性（为什么？）4141/168计数方法薄膜过滤法孔径0.45um的滤膜，选择不受样品液干扰的材质，不对微生物的截留产生影响，建议每片薄膜上的样品量为1g，过滤后适当冲洗薄膜平皿计数：平皿浇注法9cm的平皿，加入1ml样品液，15-20ml培养基，浇制温度45，每种培养基每个稀释度至少2个平皿，可使用更大规格的平皿平皿计数：表面涂布法9cm的平皿，加入45左右15-20ml培养基，待凝固，每种培养基每个稀释度至少2个平皿，样品涂布不少于0.1ml，可使用更大
17、规格的平皿最大可能计数法（MPN）用于检测极少数量的微生物，精密度、准确度差，不适用于霉菌4242/168生长能力测试和方法适用性生长能力测试包括：n一般考虑n测试菌株准备n缓冲液n阴性对照n培养基生长测试计数方法适用性包括：n样品制备n接种与稀释n中和/去除抗菌活性n产品存在情况下的微生物回收率n结果与解释4343/168生长能力测试和方法适用性n“必须建立在待测产品存在微生物情况下，仍有检出微生物能力的方法”n“如果测试性能发生变化或发生可能影响测试结果的产品变更，方法适用性必须重新进行再确认”nUSP4444/168测试菌种及阴性对照n微生物使用不超过5代n2小时内使用，如2-8不超过2
18、4hn黑曲霉及枯草芽孢杆菌也可制备孢子悬浮液，2-8保存期限需确认n阴性对照必须没有微生物，测试失败需要进行调查4545/168培养基生长能力测试n测试每批“待用”培养基，每批从干粉培养基制备得到的培养基，及根据配方制备得到的培养基n按上述表中的条件培养TSA/TSB30-35，沙堡葡萄糖琼脂20-25细菌：3d，真菌5dn结果判断：固体培养基：偏差系数为2液体培养基：有明显生长，与前次测试结果一致4646/168计数方法的适用性n计数方法适用性章节包括样品准备，接种，稀释，中和抗菌活性和在产品存在的情况下的回收率，结果和解释的方面的讨论4747/168样品制备n样品制备方法依据待测产品的物理
19、特性。如如下述的个程序均被证明不适用，必须开发适用的替代方法水溶性产品水不溶性非脂类产品脂类产品气雾剂皮肤贴剂4848/168测试样品数量n除非其他地方指出，用10g或10mln气雾剂：10个容器n皮肤贴剂：取10片n随机抽样，混合测试4949/168产品检测样品培养：nTAMC:30-35,3-5dnTYMC:20-25,5-7d5050/168非无菌制剂的微生物检查-特定微生物的检验介绍样品培养n下述检验方法用于在规定条件下测定指定的微生物是否存在。n该测试设计用于确定一种原料药或制剂是否符合已建立的微生物质量质量标准。当用于这样的目的时，按下述的指导进行，包括取样数量，结果诠释。n可替代
20、的微生物程序，包括自动化方法，如果已证明了其同药典方法的等效性，也可以使用。5151/168常规过程常规过程n避免产品以外的微生物污染（最大的污染源是什么？）n去除细菌抑制/真菌抑制性（为什么？）5252/168产品测试产品测试通则分别列出了各个微生物测试的章节，每个章节包括以下这些通用部分：n样品制备和增殖n选择性培养n结果解释5353/168培养基适用性测试和方法适用性测试培养基适用性测试和方法适用性测试n培养基适用性测试：测试菌株准备缓冲液阴性对照生长能力测试，抑制及选择性测试n方法适用性包括样品制备接种与稀释中和/去除抗菌活性产品存在情况下的微生物回收率结果与解释5454/168菌种、
21、阴性对照及培养基菌种、阴性对照及培养基n菌种n微生物使用不超过5代n2小时内使用，如2-8不超过24hn生孢梭菌也制备孢子悬浮液，2-8保存期限需确认n阴性对照必须没有微生物，测试失败需要进行调查n测试每批“待用”培养基，每批从干粉培养基制备得到的培养基，及根据配方制备的培养基，根据药典确认相应培养基具有适当的特性5555/168质控可接受标准质控可接受标准n生长能力测试n液体培养基与前一批通过测试并被批准的培养基结果一致n固体培养基-清楚观察到与前一通过测试并被批准的培养基的前次结果一致n抑制性n应无测试微生物生长n指示能力n菌落外观和指示反应与前一通过该测试并被批准的培养基的前次结果一致5
22、656/168方法适用性方法适用性n如果对某个微生物的抗菌活性不能去除，那就假设这个被抑制的微生物不会出现在产品中5757/168剂型TAMC(cfu/g or cfu/ml)TYMC(cfu/g or cfu/ml)控制菌（1g或ml）非液体口服给药制剂103102大肠埃希菌液体口服给药制剂102101大肠埃希菌直肠给药制剂103102-牙龈、皮肤、鼻及耳用102101金黄色葡萄球菌铜绿假单孢菌阴道制剂102101金黄色葡萄球菌铜绿假单孢菌白色念珠菌吸入剂102101金黄色葡萄球菌铜绿假单孢菌耐胆盐革兰阴性菌活性药物成分，辅料103102方法适用性5858/168控制微生物测试控制微生物测试
23、沙门菌大肠埃希菌铜绿假单孢菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌生孢梭菌耐胆盐G-的定性及定量没有其他的有害微生物吗？5959/168FDA说什么无有害微生物n21CFR211.113微生物污染控制（a）适当的书面程序必须建立并遵循以防止非无菌药品中的有害微生物6060/168FDA说什么还有什么？n21CFR211.165分发前的测试与放行（b）必须的话，对每批应不存在有害微生物的药品应有适当的实验室测试不仅仅是不存在USP规定的微生物6161/168有害微生物有害微生物n有害微生物的概念不适合用于无菌产品，无菌产品中不得有任何微生物n将用于非无菌产品的微生物测试，及非无菌生产环境中分离得到的微生物评估
24、及清洁验证6262/168有害微生物有害微生物n有害微生物可以被定义为：a)能在产品中增殖的微生物，对药品的物理特性及治疗作用有负面影响，并且b)由于产品中微生物的数量及致病性能导致使用该药品的患者受到感染6363/168有害微生物有害微生物显而易见的药品的有害微生物举例：在含有普通防腐剂的局部用霜剂、鼻腔喷剂或口服液中能够增殖的假单胞菌，片剂的表面生长的真菌食源性的致病细菌，如口服制剂中的沙门菌和志贺菌暴露与高湿环境中的气泡眼包装内的片剂表面会生长真菌6464/168在注射剂中经常会发现下述要求：“当按待检产品无菌测试要求进行膜过滤法测试时符合要求。”各论中对无菌的通常要求在各论中另一种指出
25、无菌测试要求的方法是什么呢？6565/168吗啡硫酸盐注射剂：“其他要求符合注射剂项下要求。”各论中对无菌的通常要求FromInjections注射剂：无菌测试-注射剂应符合无菌测试的要求6666/168美国传统的对无菌的观点：“没有细菌或其它微生物”什么是“无菌”灭菌和无菌保证中的观点“按照无菌最严格的定义，只有当样品中完全没有活的微生物时，它才能被称为是无菌的”证明产品中完全没有活的微生物，有可能吗？6767/168不能，除非你不准备留下产品进行销售，因为你不将整批产品进行逐个破坏检查是无法证明绝对无菌的无菌测试的首要难点尽管批产品中有污染，但通过无菌测试的概率有多大呢？6868/168无
26、菌测试的首要难点n假设生产无菌注射剂，批量为20，000瓶，该批染菌率为0.1%，即20瓶，从20，000中随机抽取20（n）瓶进行无菌检查，检查合格的机会P为多少？P=（1-0.1%）20=98%6969/168首要难点的推论如果你不能评估批产品中的每个产品，那根据什么判断产品的？无菌是根据概率的原则判断的。从给定批号的所有产品中存在被污染产品的概率得出判断目的是使其可能性与真实性仅有可接受的微小差异。在无菌保证中将详细讨论。7070/168我们现在知道不能用无菌测试合格来证明整批产品的无菌性无菌测试那么，一个产品通过无菌测试能证明什么呢？7171/168无菌测试本身并不是设计用于保证产品无
27、菌或产品已灭菌。产品的无菌保证是通过灭菌工艺或灭菌工艺的验证来得到的。无菌测试无菌测试适用于药典要求无菌的药物成分，配剂或制剂。然而，合格结果仅说明在测试条件下受检的样品中未发现微生物污染。7272/168无菌测试流程1.培养基和细菌抑制/真菌抑制性测试（方法验证）2.去除任何抑制细菌和真菌生长的因素3.确定用于测试的样品数量，每个样品的用量4.培养样品5.检查测试样品是否有生长的迹象6.显微镜检查有疑问的容器是否有生长的迹象7.必要的话再接种培养8.写报告7373/168无菌测试：培养基测试培养基储存2-25无菌，密闭容器储存不超过验证的期限巯乙醇酸盐液体培养基颜色指示要求符合培养基的无菌每
28、种要求的培养基取一部分在特定温度下培养14天，检查是否浑浊？（为什么不止一个温度？）与测试同时进行培养基的无菌检查（这样做有什么风险吗？）7474/168无菌测试：培养基测试生长能力测试：细菌培养3天，真菌培养5天检查生长的迹象“生长”看起来是什么样的？7575/168无菌测试：方法适用性测试产品特性允许的话，首选膜过滤法解释：u如果生长，有浑浊产生，和对照一致。u如果不是，你需要修改测试条件以去除抗菌活性u如何做呢？7676/168无菌测试：常规方法测试的样品量是多少？每个容器中需要转移出的样品量，例如：液体（非抗生素）:装量小于1ml/瓶所有内容物；固体：装量300mg5g150mg每种培
29、养基的样品测试的数量，例如：批量大于500瓶2%或20瓶，取少量。当一个容器的内容物足够用于两种培养基时，该测试数量可等分至两种培养基，否则按药典表中取双倍数量7777/168无菌测试：常规方法测试的样品量是多少？膜过滤法时，可能的话，使用容器中所有样品直接接种法时，两种培养基中使用同样的样品，除非一个容器中的样品不够用于两种培养基7878/168无菌测试：通常的注意点u无菌测试在无菌环境中进行u注意避免污染的同时，注意不要影响测试对微生物的检出u进行测试的工作环境应通过对工作环境取样，进行定期监控并进行适当的控制u无菌测试时包括适当的阴性对照7979/168无菌测试：常规方法培养条件：u巯乙
30、醇酸盐液体培养基在32.52.5培养不少于14D，TSB在22.52.5培养不少于14D，观察u在14D的培养过程中定期观察培养基u显微镜检查（浑浊的话，除非合理的将结果视为无效）8080/168无菌测试：结果解释只有一项或多项下列情况发生时，测试才可能被考察为无效测试：u无菌测试区域的微生物环控数据显示有错误发现u发现测试过程有错误u阴性对照发现微生物阳性u测试污染微生物鉴定后，能明确地将微生物生长归因于用于无菌测试使用的物料/技术发生错误无效测试可重新进行测试8181/168微生物特性确定，鉴定及菌株分型-概述USP35-NF302012年5月1日生效内容介绍纯培养分离初步筛选及初步确认表
31、型微生物鉴定基因型微生物鉴定微生物鉴定方法确认生物种类史思考8282/168何时需要进行微生物定性在下述情况中检出的微生物原料药辅料制药用水生产环境中间体成品8383/168微生物定性程度微生物特性确定微生物鉴定菌株分离8484/168微生物定性程度微生物特性确定利用菌落形态学、细胞形态学，不同的染色计数，重要的诊断特性来确定实验室分离得到的微生物的特性，用于趋势分析及调查，并不是鉴定。适用于大多数非无菌生产运作及部分无菌生产环境的风险评估。8585/168微生物定性程度微生物鉴定定义：确定实验室分离的微生物的类别，大类（如细菌，酵母菌或霉菌），小类（如属、种）。更明确的鉴定到种和属，某些方法
32、甚至鉴定到株。当产品中的微生物数量高于制定限度或出现异常高的微生物检出率时，尤其适用。对无菌工艺很有帮助，对在无菌测试阳性及模拟工艺，如培养基灌装，失败时检出的微生物污染进行评估时是必须的。8686/168微生物定性程度微生物鉴定控制菌检测中，特别指出，当在选择性或指示培养基上发现的疑似菌落需进行确认鉴定。建议对分离得到的微生物进行适当频率的鉴定，以支持环境监测计划。对大量的非致病微生物，如葡萄球菌，棒状杆菌，微球菌，一般鉴定到属。8787/168微生物定性程度菌株分离菌株分型是临床及公共健康微生物学中，流行病学调查的组成部分。方法包括脉冲场凝胶电泳，核糖体DNA测序，随意引物聚合酶链反应，全
33、基因组序列限制图或光学图，用于证明微生物是相同菌株，并非常可能是同一来源。用于调查微生物的来源。8888/168微生物定性程度菌株分离对无菌工艺很有帮助，对在无菌测试阳性或模拟工艺失败时检出的微生物污染进行评估时是必须的。无菌测试允许，当测试中分离的微生物经鉴定，其生长明确归因于与物料和/无菌测试中所用到的技术相关的错误，该测试可判断为无效。8989/168微生物鉴定步骤及方法u分离纯培养u初步筛选及特性确定u表型微生物鉴定u基因型微生物鉴定9090/168第三部分培养基的质量控制和规范化操作9191/168目录培养基制备的质量控制2培养基使用规范4培养基测试3 3培养基的确认和接收3 1培养
34、基有效期的验证3 59292/168培养基定义培养基（Medium）是供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定。9393/168培养基特点培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须冷藏存放。9494/168购置验收要求技术数据清单产品名称、编号批号使用前的pH必要的安全/危害数
35、据有效期生产企业提供材料：产品标签9595/168购置验收要求生产企业提供材料：质控证书性能评价所用测试菌株9696/168购置验收要求实验室验收例行常规检查内容使用前检查(即用型培养基)9797/168培养基储存培养基的储存条件应按照供应商的要求进行。大部分培养基应储存在干燥、阴凉处，温度一般为1525。部分培养基需要储存在28。9898/168培养基储存培养基应建立台账，至少应包括以下信息：名称、批号、数量、规格、有效期、到货日期、验收日期、有效期、储存地点、储存条件依据“先进先出”原则进行使用。应制定开瓶的培养基的使用周期。9999/168药典2010版，2部除附录另有规定外，在实验室中
36、，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可只进行1次。如果培养基的制备过程未经验证，那么每一批培养基均要进行适用性检查试验，试验的菌种可根据培养基的用途从相关附录中进行选择，也可增加从生产环境及产品中常见的污染菌株。培养基制备的质量控制100100/168培养基用水配制环境器具称量溶解培养基制备的质量控制pH灭菌前分装灭菌灭菌后分装储存101101/168成品质量检查外观检查pH值无菌性检查促生长能力抑菌能力指示能力培养基测试102102/168外观检查外观、色泽和均一性无沉淀（一般）无气泡包装完整琼脂凝胶无裂痕无褶皱平板培养基应水平特殊要求培养
37、基测试103103/168pH值冷却至室温后测定。应与培养基说明或相关法规要求范围一致。如不符合，应进行pH值调整。培养基测试104104/168无菌性检查无菌检查用培养基均应进行无菌性检查。用于环境监控的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养以防止外来的污染物带到环境中及避免出现假阳性结果。其他试验用培养基应进行预培养。培养基测试105105/168菌种菌悬液制备促生长能力抑菌能力指示能力培养基测试106106/168培养基使用规范制备培养基的储存，注意琼脂培养基易受冷冻的影响，不宜低于0，凝胶结构破坏。避光、避热。琼脂培
38、养基密封，防止水分蒸发。107107/168培养基使用规范融化重复融化应被限制（不超过1次），防止过度加热或潜在污染融化时，使用水浴或流通蒸汽微波炉，热板要防止过度加热融化的培养基的储存在40-45水浴不应超过8h浇制平皿前擦干防止污染108108/168培养基使用规范-存储培养基应标示批号，制备批号制备日期，有效期培养基名称有效期确定根据成分，配方，容器，储存条件等确定生长能力试验数据支持培养基储存不得超过有效期109109/168培养基使用规范-存储培养基应根据生产商的说明书，并在验证过的条件下储存重要区域环控用培养基必须双重包装最终灭菌，否则进行全数预培养及用前检查应根据当地生物危险品安
39、全程序处置过期培养基110110/168培养基使用规范记录入库记录配置记录灭菌记录菌种使用记录培养箱使用记录培养基质量检测记录培养基配制验证报告培养基有效期验证报告111111/168培养基有效期的验证培养基有效期：干粉培养基未开封，按照商品说明制定。已开封，依据培养基组分性质制定，有效期应适中。外购成品培养基参考商品说明和有效期验证结论制定。112112/168培养基有效期的验证培养基有效期：自制成品培养基平板固体培养基：有效期一般为七天未密封培养基：有效期一般为21天密封培养基：有效期最长不超过一年113113/168培养基有效期的验证培养基有效期验证内容：外观检查pH值无菌性检查促生长能
40、力抑菌能力指示能力114114/168培养基有效期的验证培养基有效期验证阶段：有效期较短的培养基：两点验证：0天、有效期截止时间（可适当延长）应有验证报告有效期较长的培养基：多点验证：0天、有效期内选择验证时间点、有效期截止时间（可适当延长）验证报告定期的培养基质量检查115115/168第四部分菌种管理116116/168目录菌种管理2菌种确认4菌种复苏、传代、保藏3 3菌种概述3 1117117/168菌种概述 菌种泛指从自然界获取的各种微生物的不同的种。标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。标准储备菌株：由标准菌株经传代得到的培养物。工作菌株：
41、由标准储备菌株经传代得到的培养物。商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称为一代。118118/168菌种概述 中国药典2010年版在新增的“药品微生物实验室规范指导原则”中对菌种有了较为明确的规定实验室认可准则检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明（CNAS-CL09）USP119119/168菌种概述 涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供。CMCC提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。美国模
42、式培养物集存库(American type culture collection,ATCC)ATCC向全球发布其获取、鉴定、保存及开发的生物标准品，推动科学研究的验证、应用及进步120120/168菌种概述 中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株ATCC的标准菌株商业派生菌株自制冷冻保藏菌株121121/168为保证菌种的质量应对以下几个方面进行控制：文件管理效期管理标识管理确认管理使用管理菌种管理122122/168菌种的使用：菌种采购菌种的接受和储存菌种的复苏菌种的传代工作菌悬液的制备菌种的保存菌种的确认菌种的销毁菌种管理123123/168实验环境应在生物安全柜中进行菌种的传代冻干保藏菌种处
43、理用75%酒精棉消毒菌种管外壁。先用砂轮在安瓶上三分之一处划痕，再用干燥的无菌纱布包裹安瓶，最后将安瓶掰开。用无菌吸管将胰酪胨大豆肉汤培养基0.5ml左右注入被开启的菌种安瓶中吹打，使安瓶中的冻干菌种溶解成菌悬液。菌种复苏124124/168甘油冷冻保藏菌种处理将甘油冷冻保藏菌种置于28至融化。用75%酒精棉消毒菌种管外壁。用无菌吸管混匀菌种悬液接种：用无菌吸管吸取适量菌种悬液加入到适量胰酪胨大豆肉汤培养基中，其中生孢梭菌加入到硫乙醇酸盐流体培养基中进行复苏，并做好标识。菌种复苏125125/168培养：将接种好的培养基置于培养箱中进行培养。细菌于3035培养1824小时；真菌于2328培养2
44、448小时。废弃物灭菌：将染菌的器具、试剂等浸泡消毒液，进行湿热灭菌12130min后废弃或清洗。菌种复苏126126/168实验环境应在生物安全柜中进行菌种的传代。混匀：用无菌吸管混匀培养好的菌种复苏培养物。接种：用无菌吸管吸取适量菌种复苏培养基加入到适量的适宜胰酪胨大豆肉汤培养基或胰酪胨大豆琼脂培养基中。其中生孢梭菌提供厌氧环境或加入到硫乙醇酸盐流体培养基中进行传代；黑曲霉接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基。已接种菌种的培养基均应做好标识。菌种传代127127/168培养：将接种好的培养基置于培养箱中进行培养。接种于液体培养基时，细菌于3035培养1824小时；真菌于2328培养2448小时。接种
45、于固体培养基时，细菌于3035培养2448小时；白色念珠菌于2328培养4872小时；黑曲霉于2328培养57天。废弃物灭菌：将染菌的器具、试剂等浸泡消毒液，进行湿热灭菌12130min后废弃或清洗。菌种传代128128/168保藏原理首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次应人为地创造环境条件（如：干燥、低温和缺氧），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。菌种保藏129129/168保藏方式各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的
46、通用性、操作的简便性和设备的普及性。菌种保藏130130/168保藏方式斜面低温保藏法甘油冷冻低温保藏法液体石蜡封藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法菌种保藏131131/168菌悬液准备取培养好的菌种传代液体培养物或刮取培养好的菌种传代固体培养物上的菌落至无菌0.9%氯化钠溶液中，并用无菌0.9%氯化钠溶液稀释至11065106CFU/ml。取经2328培养5-7天的黑曲霉固体培养物，加入含0.05%吐温的无菌0.9%氯化钠溶液10ml洗下孢子，吸出转移至无菌试管作为原液，用含0.05%吐温的无菌0.9%氯化钠溶液做10倍系列稀释成1106-5106CFU/ml的菌悬液。菌种保藏13213
47、2/16810%甘油菌悬液向已制备好的菌悬液中加入等体积浓度为20%的无菌甘油溶液，得到10%甘油菌悬液。分装：将10%甘油菌悬液无菌分装至已灭菌的保存管中，每管1.0ml，并标记菌种名称、代次、编号、传代时间。保藏：将菌种保存管置于程序降温盒中，在-70的冰箱中保存过夜。将保存过夜的菌种保存管从程序降温盒中取出，放置于菌种专用保藏容器中，于-70以下保存，保藏有效期为1年。菌种保藏133133/168菌种保藏外购的0代标准菌株复苏，1代传代，2代2代储备菌种复苏，3代传代，4代工作菌种2代储备菌种134134/168菌种确认确认要求：所有标准菌株在进行菌种保存后，应取一支保存菌种进行菌种鉴别
48、，符合要求后方可做为标准菌株储备菌种使用。包括以下几个方面：纯培养：菌落生长情况染色镜检菌种特性检查生化试验血清学检查135135/168菌种确认纯培养所谓微生物的纯培养是指在一个微生物的菌落形成单位中，所有的微生物细胞或孢子都属于生物学的同一个种。严格地说，纯培养是在培养基上由一个细胞或孢子分裂、繁殖而产生的后代。在该细胞或孢子的生长过程种，不受其他微生物的侵犯，不会在培养物中产生另外微生物种的后代，在整个生长过程中不发生变异或死亡。136136/168菌种确认纯培养菌种确认人员按照相应规程对菌种就进行复苏培养。如有厌氧需要，应提供厌氧环境进行培养。菌种确认人员挑取传代培养物，在适当的通用微
49、生物培养基上用进行扇形划线分离，经过适当的培养后得到分离的纯培养单菌落。菌种鉴别人员对菌种的菌落形态进行记录，菌落形态应相似，包括但不限于菌落的隆起度、表面形态、边缘、光泽、质地、颜色、透明程度、表面菌落、深层菌落和底层菌落等，并进行拍照存档。137137/168菌种确认染色镜检革兰氏染色芽孢染色荚膜染色镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。138138/168菌种确认菌种特性检查生化试验各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方
50、法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。血清学检查指抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。139139/168菌种确认大肠埃希菌的确认菌落形态取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经3035培养1824h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。140140/168菌种确认大肠埃希