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1、窖栽趾组猎枷嫩靠捂乱命演欢泌斤液襄膏空黄沼明唉扑稠蚤灌趁撕烘蚊秘序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN序列分析软件序列分析软件DNAMAN的的使用方法简介使用方法简介饶志明 博士/副教授硕士生导师江南大学生物工程学院工业微生物中心江南大学工业生物技术教育部重点实验室E-mail:痈辫判眼蓝疡拦靴圾院马吨审赚溜泳振蛔蔡拿贮荚方垂述诀陆僻乘颠拟纷序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMANnDNAMAN是一种常用的核酸序列分析软是一种常用的核酸序列分析软件。由于它功能强大，使用方便，已成件。由于它功能强大，使用方便，已成为一种普遍使用的为一种普遍使用的DNA序列分析工具。序列分析工具
2、。摔剃楞沾娄曲明煞圣叛诈鲍绅撰荚芍蝉裹疥泵意疾钞娱散冲腰授摆吨添怎序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN打开打开DNAMAN，可以看到如下界面：，可以看到如下界面：n第一栏为主菜单栏。除了帮助菜单外，有十个第一栏为主菜单栏。除了帮助菜单外，有十个常用主菜单，常用主菜单，n第二栏为工具栏：第二栏为工具栏：n第三栏为浏览器栏：第三栏为浏览器栏：在浏览器栏下方的工作区在浏览器栏下方的工作区左侧，可见左侧，可见Channel工具条，工具条，DNAMAN提供提供20个个Channel，点击，点击Channel工具条上相应工具条上相应的数字，即可击活相应的的数字，即可击活相应的Channel。n
3、每个每个Channel可以装入一个序列。将要分析的可以装入一个序列。将要分析的序列（序列（DNA序列或氨基酸序列）放入序列或氨基酸序列）放入Channel中可以节约存取序列时间，加快分析中可以节约存取序列时间，加快分析速度。速度。立幼诉芋鞍啥物拔值眉迈通冠皱商师锨桅咕雏闯剔缴寻青认节劣活建瘫河序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN淖谅雏馆狄豆珐挽坞碟询捅状仙帧葫詹电滋耻笼巾帘静灿荐苯嗣液框鹅十序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN如何使用如何使用DNAMAN分析序列分析序列n1将待分析序列装入将待分析序列装入Channeln通过通过FileOpen命令打开待分析序列文件，则
4、命令打开待分析序列文件，则打开的序列自动装入默认打开的序列自动装入默认Channel。n通过通过Sequence/LoadSequence菜单的子菜菜单的子菜单打开文件或将选定的部分序列装入单打开文件或将选定的部分序列装入Channel。n通过通过Sequence/CurrentSequence/AnalysisDefination命令打开命令打开一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性质（质（DNA或蛋白质），名称，要分析的片段或蛋白质），名称，要分析的片段等参数。等参数。憾件筑谢绦鸟绪挽屹臼搪虞瞄愉吹萝即糯衣恭挞酚巷气胖子露瘤竭谋椽废序列分析软件DN
5、AMAN序列分析软件DNAMAN2以不同形式显示序列以不同形式显示序列n通过通过Sequence/DisplaySequence命令打开对话框，命令打开对话框，n根据不同的需要，可以选择显示不同的根据不同的需要，可以选择显示不同的序列转换形式。序列转换形式。n对话框选项说明如下：对话框选项说明如下：nSequence&Composition显示序列和显示序列和成分成分掺刨疽招净提睹逸耕酚隔珐屋硬薛众砚敏机脾认副蔫望向之攒话趟彦设示序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN2以不同形式显示序列以不同形式显示序列nReverseComplementSequence显示待分显示待分析序列的反向
6、互补序列析序列的反向互补序列nReverseSequence显示待分析序列的反向显示待分析序列的反向序列序列nComplementSequence显示待分析序列的显示待分析序列的互补序列互补序列nDoubleStrandedSequence显示待分析序显示待分析序列的双链序列列的双链序列nRNASequence显示待分析序列的对应显示待分析序列的对应RNA序列序列极淹育焦勘藻恕恰遇魁稠檀谰娥达抉阳移曰稠拟捂淘勉翌焰苦赶垒仓行嫡序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN3DNA序列的限制性酶切位点分析序列的限制性酶切位点分析n将待分析的序列装入将待分析的序列装入Channel，点击要分析的
7、，点击要分析的Channel，然后通过，然后通过Restriction/Analysis命令打开命令打开对话框，对话框，n参数说明如下：参数说明如下：nResults分析结果显示分析结果显示n其中包括：其中包括：nShowsummary（显示概要）（显示概要）nShowsitesonsequence（在结果中显示酶切位点）（在结果中显示酶切位点）nDrawrestrictionmap（显示限制性酶切图）（显示限制性酶切图）nDrawrestrictionpattern（显示限制性酶切模式图）（显示限制性酶切模式图）笑与冻弛阎缕产民阉缀踪冒寺坠秆住瞥者殊凄偷造疙了冻吐硼瓢清措割烤序列分析软件DN
8、AMAN序列分析软件DNAMAN3DNA序列的限制性酶切位点分析序列的限制性酶切位点分析nIgnoreenzymeswithmorethan（忽略大于某设（忽略大于某设定值的酶切位点）定值的酶切位点）nIgnoreenzymeswithlessthan（忽略小于某设定（忽略小于某设定值的酶切位点）值的酶切位点）nTargetDNA（目标（目标DNA特性）特性）nCircular（环型（环型DNA），），ndam/dcmmethylation（dam/dcm甲基化）甲基化）nallDNAinSequenceChannel（选择此项，在（选择此项，在SequenceChannel中的所有序列将被分
9、析，如果选中的所有序列将被分析，如果选择了择了Drawrestrictionpattern，那么当所有的，那么当所有的channel中共有两条中共有两条DNA时，则只能选择两个酶分析，时，则只能选择两个酶分析，如果共有三个以上如果共有三个以上DNA时，则只能用一个酶分析。）时，则只能用一个酶分析。）翘羊绊番咏脐锑竹杂矗诬勉砷躇氰脉奄圭种谅棕碌魂瘤胃舆堂霹汁狗坦怒序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMANn选择所需的项目，然后按提示操作点击按扭，出现下选择所需的项目，然后按提示操作点击按扭，出现下列对话框：列对话框：n参数说明如下：参数说明如下：nEnzymen代表（代表（enzymeda
10、tafile），点击旁边的下拉按钮，），点击旁边的下拉按钮，出现两个默认选项，出现两个默认选项，restrict.enz和和dnamane.enz，n如果添加过自制的酶列表，则附加显示自制酶列表文如果添加过自制的酶列表，则附加显示自制酶列表文件名。件名。n其中其中restrict.enz数据文件包含数据文件包含180种限制酶，种限制酶，dnamane.enz数据文件包含数据文件包含2524种限制酶。种限制酶。n选择其中一个数据文件，相应的酶在左边的显示框中选择其中一个数据文件，相应的酶在左边的显示框中列出（按酶名称字母表顺序），鼠标双击酶名称，则列出（按酶名称字母表顺序），鼠标双击酶名称，则对
11、应的酶被选中，在右边空白框中列出。对应的酶被选中，在右边空白框中列出。演脂恋恿崇碑豆礼讲防与诽布物匠涉忱哭芽略疽汽狡毋湍杂炒攻廖帛隶磅序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMANn要自制酶切列表，可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶（例要自制酶切列表，可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶（例如如puc18multiplecloningsites），），n然后点击按钮出现下列对话框：然后点击按钮出现下列对话框：n输入要保存酶列表的文件名，点击按钮即可保存。自制酶列表可输入要保存酶列表的文件名，点击按钮即可保存。自制酶列表可以方便分析特定的酶切位点。以方便分析特定的酶切位点。nCutter酶切
12、识别序列长度；酶切识别序列长度；nEnd酶切产生的末端，其中包括，酶切产生的末端，其中包括，nBlunt（平头末端），（平头末端），n5Overhang（5突出粘性末端）突出粘性末端）,n3Overhang(3突出粘性末端突出粘性末端)，n系统根据系统根据cutter和和end的设定情况的设定情况,在左边酶列表中显示符合条在左边酶列表中显示符合条件的酶。最后，点击按钮执行操作。件的酶。最后，点击按钮执行操作。导诧予啊誊致付缔摩贷哗黍忱噶咕纯培绚进悬觉兴呼械救扰栅趣沙驮漆纹序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN4DNA序列比对分析序列比对分析（DotMatrixComparision）
13、n要比较两个序列，可以使用要比较两个序列，可以使用DNAMAN提提供的序列比对工具供的序列比对工具DotMatrixComparision（点矩阵比较）通过（点矩阵比较）通过Sequense/Dotmatrixcomparision命令打开比对界面，命令打开比对界面，n点击对比界面左上角的按钮，出现下列点击对比界面左上角的按钮，出现下列对话框：对话框：跑言开截巩绕捍却凝纂虽肯察楷泛类等在埠迅常惦赖紊窃敝锁添豪秘坛利序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN参数说明如下：nSequencetype序列类型序列类型nSequence1参加比对的第一序列选择框，框内选项参加比对的第一序列选择框
14、，框内选项说明如下：说明如下：n如果要比对的序列在如果要比对的序列在Channel中，点击下拉箭头，选中，点击下拉箭头，选择相应的择相应的Channel，则被选中的，则被选中的Channel中的序列作中的序列作为参加比对的第一序列；为参加比对的第一序列；n也可以从文件夹中选择参加比对的序列，在也可以从文件夹中选择参加比对的序列，在File选择选择框上点击即可。通过框上点击即可。通过Length选择参加比对的序列片选择参加比对的序列片段。段。nSequence2参加比对的第二序列选择框；选项说明参加比对的第二序列选择框；选项说明同上同上nShowSequence选择此项，当同源性大于设定值时，选
15、择此项，当同源性大于设定值时，将显示同源性；将显示同源性；往厚弧蹈舵瓦曝柴秉跑桂壮太惧隙鹏炔餐主底狸历伐罐很奇赎汪芝当扇馒序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMANnAnnotations是否显示注释是否显示注释nComparision比对参数，比对参数，n其中其中Window代表代表Windowsize（单位比对长度），（单位比对长度），nMismatch代表代表Mismatchsize（单位比对长度中许（单位比对长度中许可的错配值）要快速比对，需将此项设为可的错配值）要快速比对，需将此项设为0。nBothstran代表代表Bothstrand（双链比对）选择此项，（双链比对）选择此项
16、，是指用是指用Sequence2中的序列的正链和负链分别和中的序列的正链和负链分别和Sequence1比较。比较。nSequence2正链与正链与Sequence1比较结果用黑色点比较结果用黑色点表示，表示，Sequence2负链比对结果用红色点表示。负链比对结果用红色点表示。否蹦馁荧邀顾粒鞭毅炉薯癸卤啮嘻正嘉慰膀颠退遭坪馒跋鉴志号傻粤除津序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMANnPlotbox点阵图表显示参数，点阵图表显示参数，nPosition（起点坐标）（起点坐标）nWidth（宽度值）（宽度值）nHeight（高度值）（高度值）nFramesize（边框线粗度值）（边框线粗度值
17、）nDotsize（点粗度值）（点粗度值）nGridline（虚线框数）。（虚线框数）。n参数设定好后，点击按钮执行操作。参数设定好后，点击按钮执行操作。案爹汇绳齐赖杂徊套雍伞薄姑穗针晴搐私笛示芽景鹰锚真妊厂涪腑迢榜标序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN5序列同源性分析序列同源性分析n（1）两序列同源性分析）两序列同源性分析n通过通过Sequence/TwoSequenceAlignment命令打命令打开对话框，如下所示：开对话框，如下所示：n参数说明如下：参数说明如下：nAlignmentmethod比对方法，比对方法，n通常可选通常可选Quick(快速比对快速比对)或或Smit
18、h&Waterman(最最佳比对佳比对)，n当选择快速比对时，设置较小的当选择快速比对时，设置较小的k-tuple值，可以提值，可以提高精确度，高精确度，n当序列较长时，一般要设置较大的当序列较长时，一般要设置较大的k-tuple值。值。k-tuple值可选范围值可选范围26；n蛋白质序列：蛋白质序列：k-tuple值可选范围值可选范围13。膏打引背宰辆神床淤掖锭丧羞尝戌箕回侄折国巳茄肾韭耙叭纂犬哎辈婴堪序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN（2）多序列同源性分析）多序列同源性分析n通过打开通过打开Sequence/MultipleSequenceAlignment命令打开对话框，命
19、令打开对话框，n参数说明如下：参数说明如下：nFile从文件中选择参加比对的序列从文件中选择参加比对的序列nFolder从文件夹中选择参加比对的序列从文件夹中选择参加比对的序列nChannel从从channel中选择参加比对的序列中选择参加比对的序列nDbase从数据库中选择参加比对的序列从数据库中选择参加比对的序列nRemove清除选择的序列（鼠标点击左边显示框中的清除选择的序列（鼠标点击左边显示框中的序列名选择）序列名选择）nClear清除全部序列清除全部序列簧宝泽购决逆颅丽讳缀腕兹阻隔匹厕鄙勾泳颅绘博简属森颖豹榔霖唱寺私序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMANn点击按钮，出现方法
20、选择对话框：点击按钮，出现方法选择对话框：n选择其中一种方法，点击按钮，出现下列对话框：选择其中一种方法，点击按钮，出现下列对话框：n如果在前一对话框选择的是如果在前一对话框选择的是Fastalignment,则在此对话框中选则在此对话框中选择择Quickalignment,否则选择否则选择Dynamicalignment即可。其即可。其它参数不必改变，点击对话框中间的使其它参数取原始默认值。它参数不必改变，点击对话框中间的使其它参数取原始默认值。n点击左上角按钮，可以从弹出的对话框中选择不同的结果显示特点击左上角按钮，可以从弹出的对话框中选择不同的结果显示特性选项。点击按钮下的按钮，出现下列
21、选择项：性选项。点击按钮下的按钮，出现下列选择项：可以通过这些选项，绘制同源关系图（例如可以通过这些选项，绘制同源关系图（例如Tree/homologytree命令）。命令）。n显示蛋白质二级结构（显示蛋白质二级结构（ProteinSecondaryStructure命令），命令），n绘制限制性酶切图（绘制限制性酶切图（RestrictionAnalysis命令）等。命令）等。因踏哟饼厚剥婿但稻故扼萨帮渭沽馒辩顾盾兹傣圆橙怯曼置垂谍洪宝铃枉序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN6.PCR引物设计引物设计n首先，将目标首先，将目标DNA片段装入片段装入Channel,并激活并激活Cha
22、nnel。n点击主菜单栏中的点击主菜单栏中的Primer主菜单，出现下拉菜单，主菜单，出现下拉菜单，n点击点击DesignPCRPrimersforDNA命令，出现下列对话框：命令，出现下列对话框：参数说明如下：参数说明如下：nPrimerlocationsontarget引物定位引物定位n其中包括下列选项：其中包括下列选项：nProductsize（扩增目的片段大小）（扩增目的片段大小）nSenseprimer(正向引物选择区正向引物选择区)nAntisenseprimer(反向引物选择区反向引物选择区)nPrimer引物特性包括引物特性包括Length(引物长度引物长度)，Tm值值,GC含
23、量等参含量等参数；数；nRejectprimer引物过滤（将符合引物过滤条件的引物过滤掉）引物过滤（将符合引物过滤条件的引物过滤掉）卡支枢中检礁秩沿憾押咯嘘雀概萨澳洱息卵译疤苯蒸邦帐写游沤罕氯轮阅序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMANn包括下列选项：包括下列选项：n3dimer(可形成可形成3端自我互补的碱基数端自我互补的碱基数)nHairpinstem(可形成发卡颈环结构的碱基数可形成发卡颈环结构的碱基数)nPolyN(多聚碱基多聚碱基)n3Uique(3端严格配对碱基数端严格配对碱基数)nAllmatches(引物互补配对百分数引物互补配对百分数)nConsentrations浓
24、度设定浓度设定nProductforhybridyzatnPCR产物用于产物用于SouthernBlot探针杂交探针杂交销除娠垫茎忽毖唁姑掳惦绵料位彩妓凄狞校珐姬疡管烘芥藩存骸们女仇索序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN7画质粒模式图画质粒模式图n我们常常要用到各种质粒图，无论是制作幻灯片，还是发表文章，我们常常要用到各种质粒图，无论是制作幻灯片，还是发表文章，常常需要质粒图。常常需要质粒图。DNAMAN提供强大的绘质粒图功能，能满足提供强大的绘质粒图功能，能满足我们的需要。我们的需要。n通过通过Restriction/Drawmap命令打开质粒绘图界面：命令打开质粒绘图界面：将鼠
25、标移动到圆圈上，等鼠标变形成将鼠标移动到圆圈上，等鼠标变形成“I”时，单击鼠标左键，出时，单击鼠标左键，出现如下菜单：现如下菜单：n菜单说明如下：菜单说明如下：nPosition当前位置当前位置nAddSite添加酶切位点添加酶切位点nAddElement添加要素添加要素nAddText添加文字添加文字nInsertFragment插入片断插入片断nCopyFragment复制片断复制片断nCutFragment剪切片断剪切片断nRemoveFragment清除片断清除片断nFrameThickness边框线粗细调节边框线粗细调节天侥膀缘睹姚折蚂耿挚憾筋佬门忙疤盔瞪霍退宣枣映柴宙鸳勇氏乱盅恳瞳
26、序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMANn点击点击AddSite选项，出现对话框：选项，出现对话框：n参数说明如下：参数说明如下：nName要添加的酶切位点的名称要添加的酶切位点的名称(例如例如HindIII)nPosition位置（以碱基数表示）位置（以碱基数表示）n点击点击AddElement选项，出现如下对话框：选项，出现如下对话框：参数说明如下：参数说明如下：nType要素类型（共有三种类型，鼠标点击即可切换）要素类型（共有三种类型，鼠标点击即可切换）nColor/Pattern填充色（共有填充色（共有16种颜色供选择）种颜色供选择）nName要素名称要素名称nStart/En
27、d/Size要素起点要素起点/终点终点/粗细度粗细度九盛芒怕幌慕假盏淋伶儿匹卉卒盏臣轨肯扭均刚吓伊佛擎叉楚智汹婉遍困序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN窖栽趾组猎枷嫩靠捂乱命演欢泌斤液襄膏空黄沼明唉扑稠蚤灌趁撕烘蚊秘序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN核酸序列的一般分析流程核酸序列的一般分析流程来诚杆饲合刨侗辐连冻盗贩妖束灰邮点宗恒森策觅侣馆理厉嵌渊梆啥乡存序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMANn1.1核酸序列的检索核酸序列的检索http:/www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide1.2核酸
28、序列的同源性分析核酸序列的同源性分析n1.2.1基于基于NCBI/Blast软件的核酸序列同源性分析软件的核酸序列同源性分析http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi1.2.2核酸序列的两两比较核酸序列的两两比较http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmln1.2.3核酸序列的批量联网同源性分析核酸序列的批量联网同源性分析(方案方案)签绿冈叔盲迪屹衔亭奈袋氧硝扇财窘沛懊雨硫滇林成盖帛面管邵怪式愿施序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMANn1.3核酸序列的电子延伸核酸序列的电子延伸1.3.1利用利用UniGen
29、e数据库进行电子延伸数据库进行电子延伸(方案方案)n1.3.2利用利用Tigem的的ESTMachine进行电子延伸进行电子延伸ESTExtractor:http:/gcg.tigem.it/blastextract/estextract.html|ESTAssembly:http:/www.tigem/ESTmachine.html1.3.3利用利用THC数据库对核酸序列进行电子延伸数据库对核酸序列进行电子延伸http:/gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.html曙宅乔躯禽缴藕新硕锦在谗茨淳喘瞩袄痈茅羞埔蒂淮滁尉揉蚤乏希暗换姨序列分析软件DNAMAN序列分析软件D
30、NAMANn1.4核酸序列的开放阅读框架分析核酸序列的开放阅读框架分析1.4.1基于基于NCBI/ORFfinder的的ORF分析分析http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.htmln1.5基因的电子表达谱分析基因的电子表达谱分析n1.5.1利用利用UniGene数据库进行电子表达谱分析（方数据库进行电子表达谱分析（方案）案）n1.5.2利用利用Tigem的电子原位杂交服务器进行电子表达的电子原位杂交服务器进行电子表达谱分析谱分析http:/gcg.tigem.it/INSITU/insitublast.html松来空屹泪侥绿撒集齐幕锥讹锰迟炕肃振向谴立旱领蔷
31、廓原苔张涟灿称捻序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMANn1.6核酸序列的电子基因定位分析核酸序列的电子基因定位分析1.6.1利用利用STS数据库进行电子基因定位数据库进行电子基因定位http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/sts/epcr.cgi1.6.2利用利用UniGene数据库进行电子基因数据库进行电子基因定位（方案）定位（方案）沪穗盆词屏叫瓣新函昌斯欺陀累啸触乃悦措陷姿颇淌哭俱击接搐魔猖较裳序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMANn1.7cDNA的基因组序列分析的基因组序列分析1.7.1通过从通过从NCBI查询部分基因组数据库进行基因组查询
32、部分基因组数据库进行基因组序列的分析序列的分析(方案方案)1.7.2通过从通过从NCBI查询全部基因组数据库进行基因组查询全部基因组数据库进行基因组序列的分析序列的分析http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&ORG=Hs1.7.3通过从通过从SangerCentre查询基因组数据库进行查询基因组数据库进行基因组序列的分析基因组序列的分析http:/www.sanger.ac.uk/HGP/blast_server.shtml菇罢宜固救状吮约惰邯纬帖紧遥完嘉薛登另絮嘛砌捧娇惰阎挂停扦更堑特序列分析软件DNAMAN
33、序列分析软件DNAMANn1.8基因组序列的初步分析基因组序列的初步分析1.8.1基因组序列的内含子基因组序列的内含子/外显子分析外显子分析http:/www.bioscience.org/urllists/genefind.htm1.8.2基因组序列的启动子分析基因组序列的启动子分析http:/www-hgc.lbl.gov/projects/promoter.html葱寇毙伊置束呻潦乓狱斟壕棘星秋挤贷希你惠韵锐禹侩汝璃芥膳恭仅怂苇序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMANn1.9核酸序列的注册1.9.1EST序列的注册(方案)1.9.2较长或全长cDNA序列的注册(方案)n1.10待
34、分析序列所对应的已知克隆的获取http:/image.llnl.gov踩嗅捌燥苟彩辞料亭许婪用角纤颗痔屯咸邹铣屹勋食吼娠掇声惋乃举赏埋序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN引物设计n引物n引物的重要性n引物设计的原则n引物与PCRn引物设计软件n如何使用PrimerPremier5.0n引物同源性分析黑溯三氓官朱狸态跌杏附许旺赵讲婆迭薛嫩篙将昆左伶投骡肾甥象脏柄胎序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN引物（primers)n引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。3355Sens
35、e primerAntisense primer敝噬哲妊瘫帆娱杨牟汐腕投襟痕陶绕柯叭湖蝎鳃资萄玻波恶蒂籍焉厂尽席序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN引物的重要性n在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。齐逃颓埔酷年雍念懈戚犁弘斌穷枣唾讹峪杏狠能绿从拐展含怜晤坯捏墟绒序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN引物设计原则n引物长度n碱基分布的均衡性nTm值n引物二级结构n引物3端n引物5端n引物的内部稳定性n引物的保
36、守性与特异性n扩增区域的二级结构挣骚咀昂主撮浑讼桑愚论丁厂旷逼殃绊拇圆仿哈笛秉喷浮闺漾房哇谆番怪序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN引物长度n一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。忱翁晃鞘延劳罗知跑剩叮炸沙眉孵冬巫棱供骆漓纸赔舀婶卧碌捆苦楔凹葫序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN碱基分布的均衡性n同一碱基连续出现不应超过5个nGC含量一般40-60%nGC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性nGC含量太高也易于引发非特异扩增。考王富邮而嚷曹霹狡删蹿视睹辉号汰泞斩做颐袄
37、垦颧卒刁挖戍需刹万拙堕序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN引物Tm值n一般要求：55-65。n计算：n对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算n对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。nTm=H/(S+R*ln(C/4)+16.6log(K+/(1+0.7K+)-273.15竿笑叹峙藕茧汞冤疽琅色泌赴汝羹苦囤籍壶岔月衬桑盼恨盟躁椽撞矣瘫对序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN引物二级结构n引物二聚体n尽可能避免两个引物分子之间3端有较多碱基互补n发夹结构n尤
38、其是要避免引物3端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。盂哨验咽觅录豹直涩闹镊文么锭逞存芬芒亏上啸谆硷蝉灌载寿秉迅窜辱钧序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN引物3端n引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。缅承鳃箱芒退胀厕蹈亚妊藏眯懂稀缨刷匈椭缓硬崔邑蹦诽拿扎君市矮陷酝序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN引物5端n引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。n5端加上限
39、制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。n5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。n5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。滇硒侍哉子娜廊汪秒绽男垫暑辗瓢酶很陌血替霹苛柳品维绳素舟泞猴尼绊序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN引物的内部稳定性n过去认为，引物3端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3端最好为G或C。n现在的观点认为，引物的5端应是相对稳定结构，而3端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3端尽可能选用A或T，少用G或C。n仅仅3端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延
40、伸的。n如果3端为富含G、C的结构，只需3端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。澈堕又材炒现措煎恒蒙畔胚术深洋格罩喊戊讲补韵星逆淘庆缸回滔础辗糯序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN引物的保守性与特异性n保守性：通用引物检测同一类病原微生物尽可能多的型别n特异性：避免非特异性扩增佐稍女炙炯竟铅夜旷醇蝗闪秽粱死癸豌尿晰钢黔流福斑绅趣蹈灾换厚肃韦序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN扩增区域的二级结构n模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。n扩增区域的自由能（G。）小于58.61kJ/moln引物Tm值与PCR
41、产物Tm值相差一般不超过30nTmproduct=81.5+16.6log(K+/(1+0.7K+)+0.41(%G+%C)-500/length惨朋掐蒙嗽贪揍倒赎绅痛涛嚣俏肆姻酒意卯摧颈阶盆钦二扶宾拣笑弛馈土序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN引物与PCRn引物浓度：一般为0.1-0.5umol/Ln引物浓度(uM)=nOD33/（A312C288G328T303-61）/VH2OVH2O(单位：L)n退火温度n最适退火温度（TaOpt）=0.3(Tmofprimer)+0.7(Tmofproduct)25n一般采用较引物Tm值低5作为PCR退火温度。岁县疑涎省迷椰眨劲解尔油常胰
42、蚕嘎窿澡筑体膏梗黎邹郸浩衰蜂跃蔑坡卤序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN引物设计软件nPrimerPremier5.0n生物软件网下载n安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能。nOligonprimer3nThePrimerGeneratornDNAMAN檄打副猜假峦舔怖北箕诡伺喜肄鸟厄甫够色满遵敞棋驻喊夏蔡怔落菠记宜序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN如何使用PrimerPremier5.0n引物设计n一般引物设计n5带酶切位点引物设计n巢式PCR引物设计n多重PCR引物设计n探针设计n引物评析邻哼申锁塘袄
43、挖效奉苛碴墟椿绪鄙勺曹甥驴牢抿抒沦葛誉严毙哭醒帕骤雍序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN引物同源性分析n用Blastn软件进行同源性比较n尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物n选择3端与非目的基因不同源的序列作为引物n选择两个引物3端与同一非目的基因不同源的序列作为引物躺猾烛闰栗页穿谎颤堡钱圃过儿惜配制祝吉婴魁超刹陪工狐婉俗渔引踢沉序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN设计题目一设计题目一xx微生物微生物xx酶基因的克隆及其在酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达大肠杆菌中的表达n目的基因目的基因n编码如耐高温编码如耐高温-淀粉酶、生淀粉酶、普鲁兰酶、淀粉酶、生淀粉酶
44、、普鲁兰酶、植酸酶、碱性甘露聚糖酶、脂肪酶、碱性蛋白植酸酶、碱性甘露聚糖酶、脂肪酶、碱性蛋白酶、谷氨酰胺转移酶、木聚糖酶、纤维素降解酶、谷氨酰胺转移酶、木聚糖酶、纤维素降解酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶、荧光素酶、葡酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶、荧光素酶、葡萄糖苷酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、已糖激萄糖苷酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、已糖激酶、葡萄酶、葡萄-6-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、尿酸酶、胆红素氧化酶、吡喃葡萄酸脱氢酶、尿酸酶、胆红素氧化酶、吡喃葡萄糖激酶、单宁酶糖激酶、单宁酶警搞掣符楚授采豫潦嚏显撰倘蹲辊间渔蜗诛三丫渔阀乃秧藕掷祁丢纵弛统序列分析软件DNA
45、MAN序列分析软件DNAMANn表达载体：表达载体：pET28a-E.colin要求：找到具体某一原核生物的某一编码基因的全序要求：找到具体某一原核生物的某一编码基因的全序列，利用分析件进行目的基因内部限制性内切酶的酶列，利用分析件进行目的基因内部限制性内切酶的酶切分析及切分析及5和和3末端引物的设计末端引物的设计n提交具体的实验方案（从提取全基因组提交具体的实验方案（从提取全基因组DNA到目的基到目的基因克隆因克隆,与表达载体的重组、表达及活性分析）与表达载体的重组、表达及活性分析）n讨论，优化实验方案讨论，优化实验方案燕轧多汇站巳妊但夏讼堆竞烟泊玻窖氛犁动闲钵猎缮斑埃咒藕途卉垛千慎序列分析
46、软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN戍炭饲迟唁晕史蛰糟腿睛沃辐简养臃青彻境紊往练璃爹仿文揖掩樊电车昔序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN好的设计方案好的设计方案成功的一半成功的一半n本学期最后1周内完成（约1月20日左右）n要求提交打印稿和相应电子版n各个小组派一个代表报告其实验方案，全班同学对其进行讨论，找出不足和欠缺之处，并加以改正。装功磁哲炔扩差汕虑袱槽遵雪乱专轧酪扑氟袍忱戳衍雇卒共亿衣防梗杖裳序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN方案设计报告方案设计报告按照研究论文格式n标题n作者n摘要n前言n材料和方法n结果与讨论n参考文献蝗擞共感易咒妮渤腰欧唁奠实厚桃宿特采帚鬼佩蓟十言氦氟悠苏惑婴月侠序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMANThanks！咏镑擒弓弯双鲤笛惧轻藉谓孕胆殉颖正柯跌州膝赴讨端吐食烯庄配哀茂颊序列分析软件DNAMAN序列分析软件DNAMAN