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1、 DNA DNA的复制的复制Godsaidtothem:“Befruitfulandmultiply！”圣经创世纪第一节第一节 DNADNA复制概貌复制概貌一、DNA复制的半保留性二、复制过程中的顺序性复制从原点开始边解链边复制w 为什么不采取先将DNA全部解链，然后再分别进行复制的方法？三、DNA的半不连续复制冈崎片段的发现DNA只能从5到3方向合成不能从两端同时复制3，5磷酸二酯键的形成第二节 DNA的复制酶和相关蛋白一、DNA聚合酶1.种类：DNA聚合酶I：1956年，Kornbergw具有聚合酶、3-5 外切核酸酶、5-3 外切核酸酶活性w主要生理功能：主要的DNA修复酶，并参与半保留
2、复制Roger,Kenneth,Sylvy,ArthurandThomas.DNA聚合酶II：没有5-3 外切核酸酶活性，次要的DNA修复酶DNA聚合酶III：是真正的DNA复制酶w多亚基w多层次组装DNA聚合酶IV和V：参与SOS修复2.DNA聚合酶III的结构：DNA聚合酶 3-5核酸外切酶 激活外切酶活性 使核心酶结合为二聚体；结合复合物结合ATP 与亚基结合与和亚基结合 与SSB蛋白结合 与和亚基结合slidingclamp（滑动夹环）核心酶 Pol IIIPol IIIPol III*复复合合体体slidingclamp二、解螺旋酶(helicase)：Ahelicaseisanen
3、zymethatusesenergyprovidedbyNTPhydrolysistoseparatethestrandsofanucleicacidduplex三、SSB蛋白（单链结合蛋白）Thesingle-strandbindingprotein(SSB)attachestosingle-strandedDNA,therebypreventingtheDNAfromformingaduplex防止单链复性维持单链刚性状态避免单链降解TheSSBbindsasamonomer,buttypicallyinacooperativemannerinwhichthebindingofonepro
4、teinmoleculemakesitmucheasierforanothertobind四、引发酶(primase):TheprimaseisatypeofRNApolymerasethatsynthesizesshortsegmentsofRNAthatwillbeusedasprimersforDNAreplication.为什么DNA的合成需要RNA引物？五、旋转酶(gyrase)：aTypeIItopoisomerase,actstoovercomethetorsionalstressimposeduponunwindingbyintroducingnegativesupercoil
5、sattheexpenseofATPhydrolysis.复制叉前进带来扭曲张力拓扑异构酶II：引入负超螺旋六、DNA连接酶（DNAligases）DNAligasemakesabondbetweenanadjacent3-OHand5-phosphateendwherethereisanickinonestrandofduplexDNA.1、酶活化2、AMP转移3、3-OH亲核攻击第三节DNA的复制过程一、原核生物的复制（E.coli）（一）复制的起始：1.复制原点：OriC，含两个系列的重复单位，3个13bp重复序列（富含AT），和4个9bp重复序列（识别位点）2.起始过程：Theorig
6、inisinitiallyrecognizedbyaproteinthatformsalargecomplexwithDNA.AshortregionofAT-richDNAismelted.Helicaseisboundtothecomplexandcreatesthereplicationfork.ThefirstnucleotidesofthenewchainaresynthesizedintotheprimerDnaA proteinistheinitiationfactor:wThefour9bpconsensussequencesontherightsideoforiCprovid
7、etheinitialbindingsitesforDnaA.ItbindscooperativelytoformacentralcorearoundwhichoriCDNAiswrapped.wThenDnaAactsatthreeA-T-rich13bptandemrepeatslocatedintheleftsideoforiC.InthepresenceofATP,DnaAmeltstheDNAstrandsateachofthesesitestoformanopencomplexwHU proteinhasthecapacitytobendDNA,andisinvolvedinbui
8、ldingthestructurethatleadstoformationoftheopencomplex.wTranscriptional activation:RNA polymerasecouldberequiredtoreadintotheoriginfromadjacenttranscriptionunits.TheactoftranscriptioncouldbeassociatedwithastructuralchangethatassistsmeltingofDNA.HuThereplicationforkisgeneratedw2-4monomersofDnaAbindatt
9、heorigin,andtheyrecruit2preprimingcomplexesofDnaB-DnaC tobind,sothatthereisoneforeachofthetwo(bidirectional)replicationforks.wDnaBproteinisdeliveredtooriCbyDnaCproteinintheformofahexameric(DnaB:DnaC)6complex,butDnaCproteindoesnotentertheproteinassemblageatoriC.wDnaBproteinhashelicaseactivityanditfur
10、therunwindstheDNAinthepre-primingcomplexinbothdirections,assistedbyDNAgyrase.SSBtetramerscoatsingle-strandedregionsastheyarise.Primersynthesis:eachDnaBactivatesaDnaG primase,inonecasetoinitiatetheleadingstrand,andintheothertoinitiatethefirstOkazakifragmentofthelaggingstrand.（二）复制的延伸：1.复制体：酶和相关蛋白在复制叉
11、形成的超分子复合物2.先导链和后随链的同时复制Laggingtemplatestrand通过复制体形成一个环状结构，primase已经合成一条引物2随着冈崎片段的合成，环逐渐变大，直到2片段末端接近前一冈崎片段的引物复制体释放环，primase合成一个新的引物3.环型DNA的复制类型：型（E.Coli）:anorigincreatestworeplicationforksthatmoveinoppositedirectionsD-loop(mammalianmitochondrialDNA)：mtDNA的复制在H链的复制起点OH开始合成;当置换链通过L链的复制起点OL时，开始合成新的H链;新的
12、L链合成完成，子代双链被释放。Keyconcepts:MitochondriausedifferentoriginsequencesRolling circles（X174 phage）wA proteinnickstheoriginandbindsto5end.wUsingtherollingcircle,the3OHendofthenickisextendedintoanewchain.wThepositivestrandhasgrowntodoublelengthandreplicationforkisbackattheorgin.wAproteincutsthebouble-lengt
13、hpositivestrandinhalf,releasingthedisplacedhalfandbindstothenew5end.wReleasdplusstrandformscovalentcircle.4.Restartofstalledreplicationforks:wInitiationofX174replicationrequirestheprimosome complextodisplaceSSBfromtheorigin.Theprimosomeconsistsofsixproteins:PriA,PriB,PriC,DnaT,DnaB,andDnaC.Aprimosom
14、eassemblesatauniquesite,calledtheassemblysite(pas).wTheimportanceoftheprimosomeforthebacterialcellisthatitisusedtorestartreplicationatforksthatstallwhentheyencounterdamagedDNA.Atforkswithoutalaggingstrand,thesingle-strandedlagging-strandtemplatecanbebounddirectlybyDnaB.Atforkswithalaggingstrand,this
15、strandmustbeunwoundbyPriAhelicasetogenerateasingle-strandedbindingsiteforDnaBloading（三）、复制的终止：1.环形DNA：单向复制：复制终点复制起点双向复制：两个生长点的简单碰撞 (无固定 终点)有固定终点（如E.Coli）E.coli的Ter终止位点当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNAwT7DNA两端各有一段重复的数百个核苷酸，叫末端冗余。w两个5端有空缺的分子通过
16、3端凸出的重复序列互补配对。w然后DNA聚合酶从3端延伸填补起这个空缺，留下最后的裂隙由连接酶封闭，产生了一个连环分子。w再由特异性限制内切酶在连接处交错切割，产生3凹端w由DNA多聚酶在3-OH上延伸填满新的空缺，产生两条完整的双链。2.线性DNA：环化，如DNA形成连环分子，如T7DNA1.真核生物复制特点：复制速度慢基因组较大，有多个复制起点在全部复制完成以前，起点不开始新一轮复制二、真核生物的复制2.真核生物DNA聚合酶：表表2-11 真核生物真核生物DNA聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较性性质质DNA聚合聚合酶酶DNA聚合聚合酶酶DNA聚合聚合酶酶DNA聚合聚合酶酶DNA聚合聚合酶酶
17、亚基数4122-31在细胞内分布核内核内线粒体核内核内(?)功能DNA引物合成损伤修复线粒体DNA复制主要DNA复制酶DNA复制(?)35外切无无有有有53外切无无无无无3.复制过程中的核小体复制叉前进是核小体解离为H32H42四聚体和H2AH2B二聚体新合成的组蛋白也被组装成H32H42四聚体和H2AH2B二聚体旧的和新的四聚体、二聚体，在CAF-1因子的帮助下，随机地被组装到复制叉后新形成的核小体中4.端粒的复制：端粒(Telomere)端粒是真核染色体的末端序列，富含G。主要由一串十分简单和串联重复的序列组成如四膜虫：GGGGTT端粒功能：操持染色体的稳定性端粒酶(Telomerase)
18、：一种含RNA的蛋白复合物，能使端粒延伸。酶所含的RNA长约150bp，是合成端粒的模板。端粒酶实际上是一种逆转录酶。复制过程：a)除去子代链5端引物b)2.在母链3末端添加端粒序列c)3.以新合成的端粒序列为模板合成DNAd)4.除去步骤3中所使用的引物，缺口被保留，但未丢失DNAElizabethH.BlackburnJackW.SzostakCarolW.GreiderThe Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009for the discovery of how chromosomes are protected by telomeres a
19、nd the enzyme telomerase三、复制的调控：1.复制原点的甲基化：复制原点Ori C包含11个拷贝的GATC序列，该序列是DAM甲基化酶的作用位点。DAM甲基化酶使腺嘌呤上的N6位点甲基化。复制前，双链上回文序列中的A都被甲基化。子代链复制过程中，产生半甲基化DNA。对dam-E.Coli的研究表明，半甲基化的OriC不能发动一轮新的复制在复制过程中，OriC的半甲基化状态约保留13min。而在基因组其它区域的GATC位点，在复制后1.5min内即被甲基化。wColEl质粒DNA的复制调控：引物RNA前体的转录起始于复制起点上游555个核苷酸处，需经RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，然后由DNA聚合酶I在引物的3末端起始DNA合成。RNA1的编码区在引物RNA编码区的5末端，转录方向与引物RNA相反，因此与引物RNA的5末端互补RNA1通过氢键配对与引物RNA前体相互作用，阻止了RNaseH加工引物前体，使其不能转化为有活性的引物而对复制起负调控作用。w当不存在RNA1时，RNA引物前体形成自身的发夹结构，起类似终止子的作用w当前体RNA与RNA1互补配对时，类终止子效应消失，引物前体的转录被继续，阻止了RNaseH加工引物前体END