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1、ICS 65.020.01 CCS B 60 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 34292021 蒙古栎 SSR 分析技术规程 Technical Regulations of SSR analysis in Quercus mongolica 2021-05-22 发布 2021-06-22 实施 辽宁省市场监督管理局 发 布 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 仪器设备及试剂.1 5 引物.2 6 溶液配制.2 7 分析程序.2 附 录 A （资料性）.5 附 录 B （资料性）.6 附 录 C（资料性）.7 附 录 D（资料性）.
2、8 DB21/T 34292021 II 前 言 本文件按照GB/T 1.1的规则起草。本文件由辽宁省林业和草原管理局提出并归口管理。本文件起草单位：辽宁省林业科学研究院。本文件起草人：陈罡、于世河、卜鹏图、郑颖、陆爱君、王占伟、王敬贤、庞忠义、赫亮、刘怡菲、高旭、李昀峰、扈延伍、曹颖、刘金义、庞家举、许家铭、翟金凤、赵济川、战金伟。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省林业和草原局（辽宁省沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23448927。文件起
3、草单位通讯地址：辽宁省林业科学研究院（辽宁省沈阳市皇姑区鸭绿江街12号），联系电话：024-82241813。DB21/T 34292021 1 蒙古栎 SSR 分析技术规程 1 范围 本文件规定了蒙古栎SRR分析技术的定义和术语、仪器设备、溶液配制、引物和分析程序。本文件适用于辽宁地区蒙古栎的SSR分析。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 28660 马铃薯种薯真实性和纯度鉴定 SSR 分子标记 LY/T 2426
4、枣品种鉴定技术规程 SSR 分子标记法 LY/T 2756 白蜡品种分子鉴定方法SRAP 分子标记法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 简单重复序列 又称微卫星DNA，是一类由16个核苷酸为重复单位的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序列。3.2 聚合酶链式反应 在耐热 DNA 聚合酶作用下，于体外快速大量特意扩增待定 DNA 序列的方法。3.3 引物 一条互补结合在模板 DNA 链上的短的单链，提供 3-OH 末端作为 DNA 合成的起点，延伸合成模板DNA 的互补链。3.4 引物扩增多态性 一对引物在两个或两个以上不同材料基因组 DNA 之间扩增，得到数目不同或长度不同的
5、DNA 片段。4 仪器设备及试剂 DB21/T 34292021 2 仪器设备及试剂见附录B。5 引物 引物相关信息见附录C。6 溶液配制 溶液配制方法见附录D。7 分析程序 7.1 分析材料 采集蒙古栎新鲜幼嫩叶片为材料提取基因组DNA。选取适量样品装入冻存管，液氮速冻后置于-80超低温冰箱保存备用。7.2 DNA 的提取 a)采用 CTAB 法提取蒙古栎基因组 DNA。将干净研钵、研杵、小匙、无水乙醇预先放入冰箱中-20 预冷，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，再用滤纸吸干水分。b)取 510 g 叶片在液氮中迅速研磨成粉状，迅速转至灭过菌的 1.5 mL 离心管中，加入 500 L预热过（6
6、0）的 CTAB 提取液、5 L 0.2%-巯基乙醇和 5 L RNase A(10 mg/mL)，充分混匀后放入 65 水浴 30 min。其间每隔 10 min 轻轻摇动混匀 2 次3 次。c)取出离心管加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀 10 min，再于台式冷冻离心机上 10 000 g离心 10 min。d)将上清液转入另一新的 1.5 mL 离心管中，重复 c)步骤 12 次。e)移取上清液至另一已加入 2 倍体积预冷（0以下）无水乙醇的 1.5 mL 离心管中，轻轻颠倒混匀，使 DNA 沉淀成絮状，-20放置 30 min 以上。f)用钩状玻璃棒轻轻挑出絮状沉淀并
7、置于新的 1.5 mL 离心管中。如果样品未出现云雾状沉淀或看不清沉淀，10 000 g离心 10 min，再收集沉淀。g)加入 1 mL1.5 mL 70%无水乙醇浸泡洗涤沉淀，轻摇几分钟，10 000 g离心 10 min，收集沉淀，重复 1 次。然后将离心管水平放置在清洁场所晾干或在超净工作台上吹干。h)风干后加入 100 L 灭菌的 TE 缓冲液溶解沉淀。7.3 DNA 浓度的检测和定量 用 TE 缓冲液配制l g/mL、2.5 g/mL、5 g/mL、7.5 g/mL 和 10 g/mL 的-DNA 分子量标准溶液，各取3 L-DNA分子量标准溶液和3 L 步骤7.2中提取的未知浓度
8、DNA溶液，在1%琼脂糖凝胶上电泳15 min20 min，稳压90 V，电泳缓冲液为1TBE，325 nm紫外灯下观察，照相，检测提取DNA的质量。按照GB/T 28660要求的方法，计算提取DNA溶液的浓度。7.4 PCR 反应 7.4.1 PCR 反应体系 DB21/T 34292021 3 在4条件下进行操作。15 L反应总体系中，含有10PCR缓冲液1.5 mmol/L，Mg2+1.5 mmol/L，dNTPs 0.3 mmol/L，正向、反向引物各 0.4 mol/L，Taq DNA聚合酶 0.75 U，模板DNA 50 ng/L。7.4.2 PCR 反应程序 扩增程序首先94 预
9、变性5 min；随后的35个循环为：94变性30 s，复性30 s(不同SSR引物所需的退火温度见附录C)，72延伸30 s；最后72延伸8 min，4保存。7.4.3 PCR 产物的处理 PCR扩增反应结束后，在15 L的反应体系中加入5 L的上样缓冲液，充分混匀后，备用。7.5 PCR 产物检测 7.5.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测 7.5.1.1 玻璃板的清洗 用洗涤剂清洗玻璃板（长板和短板），自来水冲洗干净，随后将玻璃板用蒸馏水冲洗2次，再用无屑纸巾沾取无水乙醇擦拭2遍，置于通风橱内垂直晾干待用。7.5.1.2 胶槽装配 a)玻璃板的固定 将长板玻璃板平铺于通风橱内，边条擦拭
10、干净后置于长板玻璃板两侧，随后用短板玻璃板整齐地压盖住，确认边条与两玻璃板均对齐后，将其放入封胶框中并用夹子固定在制胶板上。b)封胶 配制1%的琼脂糖凝胶，煮沸后用胶头滴管吸取，沿底边从左至右缓缓灌注入封胶框中，避免出现气泡，待琼脂糖凝胶完全漫过玻璃板底部，停止灌注，放置于温室下待其凝固后再进行下一步操作。7.5.1.3 丙烯酰胺胶的配制 在30 mL 8%聚丙烯酰胺贮备液中加入100 L 10%过硫酸铵和200 L四甲基乙二胺，迅速轻轻混匀。7.5.1.4 灌胶 按照LY/T 2756要求的方法进行灌胶。灌胶后，将梳子轻轻插入灌胶口中，室温凝固30 min。7.5.1.5 上样和电泳 待凝胶
11、完全凝固后，将装有凝胶的玻璃板轻轻从制胶板上取下，灌胶口向内用夹子固定在电泳槽上，使用1TBE缓冲溶液灌注电泳仪的上下两槽，使下槽溶液漫过封胶框，上槽溶液漫过灌胶孔。垂直缓慢将梳子从灌胶口中拔出，并用1TBE缓冲溶液清洗和整理样品槽。使用200 L移液器从左至右逐个对点样孔进行吹打，直至点样孔内无碎胶、气泡以及其他杂质。取5 L步骤7.4.3处理后的PCR扩增产物上样，并在胶板的一侧或适当位置的点样孔中加入4 L的DNA Marker(DL2000 Marker)作为对照，电泳在200 V稳压，电流100 mA条件下进行，电泳时间约为1.5 2 h。7.5.1.6 卸胶 DB21/T 3429
12、2021 4 电泳结束，关闭电源，将上槽中1TBE缓冲液放出，取下固定的夹子，去掉下部琼脂糖，取下玻璃板。将玻璃板水平放置，用起胶铲沿灌胶口一侧边缘将玻璃板缓慢撬起，将紧贴有凝胶的玻璃板放入装有双蒸水的洗胶盘中轻轻摇晃，待凝胶与玻璃板完全分离后，取出玻璃板，放净双蒸水。7.5.1.7 银染 按照 LY/T 2426 要求的方法，对电泳样品进行银染检测。7.5.1.8 谱带记录 参照 DNA Marker 电泳结果或扫描结果，根据每对 SSR 引物从检测样品中扩增出的条带数以及分子量大小，按“有”带记录为“1”、“无”带记录为“0”的方法，仔细记录每对SSR引物的PCR结果。建立 SSR 引物、
13、检测样品及有无（1/0）对应扩增条带数据库。7.5.1.9 SSR 标记结果分析 利用相关统计分析软件，根据 Nei（1973）的遗传相似系数（Genetic Similarity,GS）按式（1）计算检测样品间的遗传相似性水平。采用非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA）进行聚类分析；绘制聚类分析结果图，显示 SSR 标记的直观结果。（1）式中：GS遗传相似系数，%；Ni第i个样品的扩增条带数；Nj第j个样品的扩增条带数；Nij第i个样品和第j个样品共有的扩增条带数。7.5.2 毛细管电泳荧光检测 7.
14、5.2.1 样品准备 对6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍（注：不同荧光标记的扩增产物他的最适稀释度通过预实验确定）。分别取等体积的上述2种稀释液混合，从中吸取1 L加入到基因分析仪专用96孔板中，在各孔分别加入0.5 L的ROX-500分子量内标和8.5 L去离子甲酰胺，置于离心机中1 000 g下离心10 s。将样品在PCR仪上95变性3 min后上机测序。7.5.2.2 收集数据 启动基因分析仪，检查仪器工作状态后更换缓冲液。将装有样品的96孔板置于样品架基座上，打开数据收集软件。将电泳板信息等录入后，启动运行程序，基因分析仪自动收集毛细管电泳数据。将检测得到的原始
15、数据文件导入到分析软件GeneMapper 3.2中进行自动分析。8 分析和鉴定 用多对SSR引物组合进行检测，将不同种源或家系待测样品的电泳结果进行统计，据SSR位点的多态性，从而分析不同种源或家系间的遗传组成差异。DB21/T 34292021 5 附 录 A （资料性）原理 A.1 原理 SSR广泛分布于蒙古栎基因组中，不同蒙古栎种源或家系间每个SSR位点重复单位的数量可能不同。针对两侧序列高度保守的特点，设计一对特异引物。利用PCR技术对重复序列进行扩增。在电泳过程中，由于SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度PCR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记加以区分
16、。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术，可以对蒙古栎种源或家系间遗传组成差异进行分析。DB21/T 34292021 6 附 录 B （资料性）仪器设备及试剂 B.1 主要仪器设备 PCR仪、基因分析仪、凝胶成像系统、水平电泳槽及配套的制胶配件、垂直电泳槽及配套的制胶配件、台式低温高速冷冻离心机、超微量紫外/可见分光光度计、高压灭菌锅、液氮罐、超低温冰箱、高压电泳仪、移液器、超纯水系统、水平摇床、电子天平、制冰机。B.2 试剂 三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）、RNase A、氯仿、异戊醇、-巯基乙醇、硼酸、
17、氢氧化钠、浓盐酸、溴化乙锭（EB）、琼脂糖、SSR引物、Taq DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸（dNTPs）、10PCR缓冲液（含Mg2+）、-DNA分子量标准液、DNA Marker、丙烯酰胺、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED)、甲醛、硝酸银、冰乙酸、无水乙醇、甲叉双丙烯酰胺、ROX-500分子量内标、离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青、DNA分析用光谱校准基质（包括 FAX、HEX荧光标记DNA片段）、DNA分析仪专用电泳缓冲液。DB21/T 34292021 7 附 录 C （资料性）SSR（简单重复序列）标记引物序列 表 C.1 SSR（简单重复序列）标记引物序列 位点 引物序列（
18、5-3）重复单元 片段长度(bp)荧光 退火温度（）N1010265 F:AGACTCTCCGGATGCTCCTT(CAA)9 180-192 56-FAM 51 R:ATGCCGAACCCTAACCTCTT N1014482 F:GCCAATGTTGCTGAATTTCC(AAT)6 171-202 56-FAM 50 R:TCTAGCATGGACTGACGTGC N1105306 F:TCTTCTTCCAAACCTCGTCG(TTC)7 150-168 56-FAM 50 R:GGTTAGAACGGCATCATCGT N1110207 F:GTTCTGTACGAAGGCCGAAG(CAA)8
19、 164-183 56-FAM 52 R:CGGTGTTGGAGACACGTAAG N1345390 F:TTAGGAGGCGTGATCGTACC(GAC)7 135-153 56-FAM 50 R:AGACGAGCATTTCACAATCG N12361 F:GACACGTCACGACCACTCAC(CAAA)5 139-152 5 HEX 53 R:TTACGCAGAATGCCACTGTC N1247890 F:AGGGACACGTGCTCATTAGG(CTTT)6 185-205 5 HEX 54 R:CTCTACTCCGATCACTCCGC N1457047 F:AGCACAAGCCAA
20、TGTAGAAGC(AAAT)5 156-171 5 HEX 50 R:TTTGGACAGCAACAACAACC N4544558 F:TTCTACTCTTGCCCTGGACG(AAT)6 168-182 5 HEX 52 R:TAAGGCCTGCAGAGTTGGAC N4529840 F:CCAGCTAAGACGCTCAATCC(TTC)5 200-215 5 HEX 51 R:AATCGAAACTCACTCCGTGG DB21/T 34292021 8 附 录 D（资料性）主要试剂的配制 D.1 常用贮备液 D.1.1 0.5 mol/L EDTA-二钠（pH8.0）溶液 将18.61 g
21、 乙二胺四乙酸二钠溶于80 mL H2O中，加入氢氧化钠（NaOH）调节pH至8.0，用超纯水定容至100 mL，高压灭菌，4 保存。D.1.2 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液 将24.22 g三羟甲基氨基甲烷溶解于160 mL水中，用浓盐酸（HCl）调节pH至8.0，用超纯水定容至200 mL，高压灭菌，4 保存。D.1.3 5 mol/L NaCl 溶液 将58.44 g氯化钠（NaCl）溶于160 mL水中，定容至200 mL，高压灭菌，4 保存。D.1.4 CTAB 提取缓冲液 缓冲液成分为2%（质量浓度）溴代十六烷基三甲胺、100 mmol/L Tris-HCl（
22、1 mol/L pH8.0）、20 mmol/L EDTA（0.5 mol/L，pH8.0）和1.4 mol/L NaCl（5 mol/L）。在500 mL超纯水中加入20 gCTAB，搅动溶解后，加入100 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）、40 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）和280 mL 5 mol/L NaCl，定容至1 L，高压灭菌，4 保存。D.1.5 TE（pH8.0）缓冲液 取1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）1 mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）0.2 mL，用水定容至100 mL，高压灭菌，4 保存。D.1.6
23、 10 mol/L NaOH 溶液 称取80 g氢氧化钠（NaOH），先用160 mL水溶解后，在加水定容至200 mL，高压灭菌，室温保存。D.1.7 EB（1 mg/mL）溶液 取0.05 g溴化乙锭（EB）用50 mL水溶解，用铝箔或黑纸包裹容器，室温保存，工作浓度为1 mg/mL。D.1.8 6 DNA 上样电泳缓冲液(DNA Lording Buffer)6DNA Lording Buffer，其中含 0.05%（质量分数）溴酚蓝、0.05%（质量分数）二甲苯青、30 mmol/LEDTA、36%（质量分数）甘油和 ddH2O。使用时按照每 5 L DNA 样品加入 1 L DNA
24、上样缓冲液的比例，混匀 DNA 样品和 DNA 上样缓冲液后，直接加到点样孔即可。D.2 琼脂糖凝胶电泳溶液的配制 称取1 g电泳级琼脂糖置于200 mL三角瓶中，加入100 mL 1TBE电泳缓冲液，在微波炉中熔化至溶液透明（确保所有琼脂糖颗粒均完全熔化），冷却至50 60，加入EB（1 mg/mL）溶液使其终浓度为0.5 g/mL，混匀后倒入放好梳子（距底板约1 mm）的载板上，凝胶厚度为3 mm5 mm，待凝胶完全凝固后放入电泳槽中，然后向槽内加入1TBE稀释缓冲液至液面刚好没过胶板上表面。DB21/T 34292021 9 D.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制 D.3.1 40%
25、丙烯酰胺贮备液 分别称取丙烯酰胺 380g 和甲叉双丙烯酰胺 20 g，用灭菌双蒸水定容至 1000 mL,混匀，过滤。于棕色瓶中室温保存。D.3.2 10%过硫酸铵溶液 称取过硫酸铵 1 g,用灭菌双蒸水定容至 10 mL，4冰箱保存（现用现配）。D.3.3 10 倍三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸缓冲液（10TBE 缓冲液）分别称取 Tris 碱 108 g 和硼酸 55 g，再加入 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）40 mL，用灭菌双蒸水定容至 1000 mL，混匀，室温保存。D.3.4 8%非变性聚丙烯酰胺工作液 分别量取 40%丙烯酰胺贮备液 10 mL，10TBE 5 mL，10%过硫酸铵 100 L，四甲基乙二酸 200 L和双蒸水 35 mL，混匀后 4 保存备用。D.4 银染试剂配制 D.4.1 固定/脱色液 量取 100 mL 冰乙酸，加灭菌双蒸水定容至 1000 mL（现用现配）。D.4.2 硝酸银染色液 称取 3 g 硝酸银，加灭菌双蒸水定容至 500 mL，加入 1.6 mL 37%甲醛，混匀。D.4.3 氢氧化钠显影液 称取 10 g 氢氧化钠，加入 500 mL 灭菌双蒸水，在 4冰箱预冷 30 min 后，加入 2 mL 37%甲醛，混匀（现用现配）。_