《DB5301∕T 26-2019 马铃薯品种鉴定----分子标记检测(昆明市).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DB5301∕T 26-2019 马铃薯品种鉴定----分子标记检测(昆明市).pdf（14页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、ICS 65.020.01B05DB5301昆明市地方标准DB5301/T 262019代替 DG5301/T 26-2017马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定DNA 分子标记2019-12-01 发布2019-12-01 实施昆明市市场监督管理局发 布DB5301/T 262019I前言本标准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由昆明市农业局提出并归口。本标准起草单位：云南师范大学马铃薯科学研究院、昆明市农业科学研究院。本标准主要起草人：唐唯、易靖、李灿辉、朱维贤、段晓艳、郝大海、刘卫民、邹万君、李华、张仲平、李明富、张丽芳、蒋瑜、杨春利。
2、本标准代替了DG5301/T 26-2017。DB5301/T 2620191马铃薯品种真实性和种薯纯度鉴定DNA 分子标记1范围本标准规定了DNA分子标记鉴定马铃薯（Solanum tuberosumL.）品种的方法。本标准适用于马铃薯品种真实性鉴定和种薯纯度检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 18133 马铃薯种薯GB/T 28660 马铃薯种薯真实性和纯度鉴定SSR分子标记3术语和定义GB/T 28660和以下术语及定义适用于本文件。3.1
3、简单序列重复基因组中由16个核苷酸残基组成的基本单位串联多次重复构成的DNA序列。GB/T 28660，定义3.13.2聚合酶链式反应在耐热DNA聚合酶作用下，于体外快速大量特异性扩增特定DNA序列的方法。GB/T 28660，定义3.23.3毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。3.4DNA 分子标记能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。3.5标准品种按国家农作物品种审定标准认定的品种。4仪器用具、试剂和软件4.1仪器及用具用本方法进行试验时，需要仪器、用具如下：DB5301/2620192PCR 仪（96 孔，梯度）；低温高速离心
4、机（4，16 000 rpm/min）；冰箱（-20，-80）；制冰机(200 kg/天300 kg/天)；高压灭菌器（121，0.15 MPa）；微量移液器（0.5 L10 L、10 L100 L、100 L1 000 L）及配套的枪头；凝胶成像仪；电泳仪；水平电泳槽；基因分析仪（Genetic Analyzer,ABI 3500/3730 xl 系列）；紫外可见分光光度计（190 nm1 100 nm）；0.2 mL PCR 管；96 孔测序板；石英比色皿。4.2试剂用本方法进行试验时，需要试剂如下：常用贮备液（制备方法见附录 A）；DNA 提取试剂（制备方法见附录 B）；DNA 分子标记
5、引物（见附录 C）；Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase）和配套的 PCR 缓冲液；1 000 bp DNA Marker；无 DNA 酶的 RNA 酶 A（DNase-free RNase A）（10 mg/mL）；异丙醇；乙醇（70%）；灭菌双蒸水（ddH2O）；甲酰胺（HIDI）；分子量内标（GeneScan 500LIZ）；EB 染液（100 mL 1TAE+5 L EB 染料）。4.3软件用本方法进行试验时，需要软件如下：Data Collection 4.0（ABI）；GeneMarker 2.09(ABI)；GeneMapper 4.0(ABI)；Micr
6、osoft Excel 2013(Microsoft corporation)。5供试材料5.1取样：按照 GB 18133 取样所述方法进行，采集大田植株叶片或块茎作为检测样品。5.2样品保存：选取适量样品，装入冻存管，液氮速冻，置冰箱（-80 以下）中保存备用（有效保存期小于等于 6 个月）。DB5301/T 26201936鉴定程序6.1总 DNA 提取按下列顺序进行a)称取 100 mg 待测样品，置于预冷 2.0 mL 离心管中，液氮冷冻下迅速研磨成细粉。b)依次加入 700 L 的两倍十六烷基三甲基溴化铵缓冲液（CTAB 缓冲液）（见附录 B 表 B.1）和2 L 的-巯基乙醇涡旋
7、混匀。置 65 水浴 1 h，期间每隔 10 min 摇动混匀一次。c)冰上冷却约 10 min 后，加入 700 L 的氯仿：异戊醇（24:1）混合液（见附录 B 表 B.2），涡旋混合,轻缓颠倒混匀数次。d)12 000 rpm 离心 5 min。吸取上层水相至新 1.5 mL 离心管中，加入等体积（400 L500 L）的预冷异丙醇。轻缓颠倒混匀。e)4 冰箱静置 30 min 后，12 000 rpm 离心 15 min。弃上清液。f)向离心管中加入 70%乙醇 1.0 mL，静置 3 min 后，12 000 rpm 离心 20 min。g)小心倒出 70%乙醇，再加入 90%乙醇
8、1.0 mL，静置 5 min 后，12 000 rpm 离心 10 min，小心倒去乙醇。h)在干净的吸水纸上倒置离心管，自然干燥 15 min。i)晾干的 DNA，应为透明状。加入 100 L 的 1TE 缓冲液，将十倍三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液（EDTA 缓冲液）（见附录 B 表 B.3）稀释 10 倍并灭菌溶解 DNA，再加入 2 L 的无 DNA 酶的 RNA 酶 A（10 mg/mL）。37 温浴 1 h 去除 RNA。4 冰箱放置备用。6.2总 DNA 质量鉴定6.2.1取 DNA 提取液 1.0 L5.0 L 于新的 1.5 mL 离心管中，加入 1TE 缓冲液稀释至
9、 1.0 mL，混匀后转入石英比色皿中，用紫外分光光度计测定 OD260和 OD280下的光密度值（OD260：紫外光 260 nm 下的光密度值；OD280：紫外光 280 nm 下的光密度值）。用 OD260/OD280比值判断 DNA 纯度，比值在 1.81.9之间表明 DNA 纯度较高。按公式（1）计算提取液中 DNA 浓度。100050260tODdsDNA.(1)式中：dsDNA双链DNA分子的含量（g/mL）；OD260紫外光260 nm下的光密度值；t稀释倍数。6.2.2总 DNA 浓度确定后，用 1TE 缓冲液将所提取的总 DNA 稀释为终浓度 50 ng/L，根据每次用量分
10、装，置-20 冰箱保存备用。6.3PCR 反应6.3.1PCR 反应体系在冰盘中或4 条件下，按表1所列成分及其用量，顺序依次加入PCR管，准备 25.0 L PCR反应体系。DB5301/2620194表 1PCR 反应体系成分用量ddH2O16.1 L10 PCR 缓冲液2.5 LdNTPs(10 mM)2.0 L正向引物(10 M)1.0 L反向引物(10M)1.0 LTaq DNA 聚合酶(2.5 U/L)0.4 LDNA 模板(50 ng/L)2.0 L总体积25.0 L注：供 1 个样品、1 对引物检测，25L6.3.2反应程序:按表2程序设置PCR反应流程。表 2PCR 反应程序
11、反应程序时间备注94 预变性5 min94 变性1 min退火1 min不同引物所需的退火温度见附录 C 表 C.172 延伸1 min循环次数35 次变性退火延伸反应循环次数72 延伸5 min4 终止反应PCR 产物放置在 4 冰箱中保存备用6.4细胞质标记检测用琼脂糖凝胶电泳6.4.1器具清洗首先将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净，包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘（EB污染，需独立清洗）。清洗流程为：先用自来水冲洗三次，然后用纯水冲洗三次，最后用纸巾或医用纱布擦干。6.4.2配胶制备好的凝胶需平整、不漏孔，方可用于电泳检测。制胶按下列顺序进行：a)量取 20 mL 的电泳缓冲液
12、1TAE 至锥形瓶中；b)再称取 0.4g 的琼脂糖倒入锥形瓶中，摇匀并用保鲜膜封口；c)放入微波炉中以 40%火力加热 60 s，取出摇匀，再次放入微波炉中以 40%火力加热至凝胶完全溶解。制备好的凝胶应为色泽均匀、无气泡；d)将制备好的凝胶放入 65 的水浴锅中，待凝胶冷却至 65 时，及时将凝胶倒入装配好的干净胶槽中；e)待凝胶完全凝固后，将胶槽小心转移至 4 冰箱，冷藏 30 min 后拔出梳子；DB5301/T 2620195f)把制备好的凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央，胶孔的方向朝向负极，往电泳槽中倒入电泳缓冲液（1TAE）至刚好将凝胶淹没。6.4.3上样取5 L PCR产物，加
13、入1L 6溴酚蓝（见附录A 表A.4）混匀，按胶孔顺序上样并做好记录；以5 L的DNA Ladder为分子量标准。6.4.4电泳在电压120 V或400 mA电流条件下，电泳30 min或溴酚蓝条带迁移距至胶板底部1 cm时停止。6.4.5染色电泳结束之后，把凝胶转移到EB染胶盘中，盖上盖子避光染色30 min。6.4.6凝胶成像将凝胶放入凝胶成像系统中，按照凝胶成像系统操作规程进行操作，拍照保存检测结果。6.5细胞核标记检测用毛细管电泳分析6.5.1内标配置25 mL Hi-Di和193 L GeneScan 500liz混合（130:1），混合后震荡15 s，根据每次使用量分装至1.5 m
14、L的灭菌管中，-20 冻存，使用前4解冻。6.5.2分内标将解冻后的内标震荡混匀，分别加入96孔板，每孔9.0 L。若每批次检测样品不足96个时，空白的孔加入ddH2O 10.0 L，用封口膜封闭内标板，瞬时离心。6.5.3加样小心揭去内标板的封口膜，吸取0.5L-1.0 L的待检测样品PCR产物，按顺序分别加样，再次用封口膜封闭已加样的内标板，并用吸水纸压紧。6.5.4变性震荡10 s混匀，3 900 rpm离心5 min后，放入PCR仪中96 变性处理5 min，再迅速冷冻(-20)2 min，瞬时离心。6.5.5电泳与分析按照基因分析仪（ABI 3500/3730 xl）操作流程进行电泳
15、、数据收集。用软件GeneMarker和GeneMapper进行数据分析，最后用软件Excel进行数据统计。7数据记录和分析7.1细胞质 DNA 标记检测结果7.1.1叶绿体 DNA 标记检测：T 标记检测结果分为两种带型（446 bp 或 205 bp），以区分普通栽培亚种（T,带型 205 bp）和野生种（W，446 bp）的叶绿体 DNA 类型。DB5301/26201967.1.2线粒体 DNA 标记检测：D 标记检测结果分为有或无 527 bp 条带，有条带表示携带六倍体野生种Solanum demissum（D）的线粒体 DNA 类型。ALM4/5 标记检测结果为 2 400 bp
16、、1 600 bp 或无特异性扩增产物，可将线粒体 DNA 类型分别分为、或三种。7.2细胞核 DNA 标记检测结果7.2.1SSR 引物(STI0003)标记检测：在 137 bp188 bp 分子量大小范围内有无扩增峰，根据峰值的位置和个数进行判断。7.2.2SSR 引物(STI0033)标记检测：在 131 bp155 bp 分子量大小范围内有无扩增峰，根据峰值的位置和个数进行判断。7.2.3SSR 引物(STM0030)标记检测：在 122 bp168 bp 分子量大小范围内有无扩增峰，根据峰值的位置和个数进行判断。8结果判定8.1品种真实性鉴定8.1.1直接比较待测品种与标准品种样品
17、的标记检测结果，在本标准要求的细胞质基因组 3 个分子标记位点及核基因组 3 个 SSR 分子标记位点检测结果基础上进行判定。8.1.2首先判定叶绿体 DNA 标记类型，如电泳带型与标准样品不一致，则判定和待测品种不一致，不进入检测。8.1.3如叶绿体 DNA 标记检测带型一致，则根据线粒体 D 标记、ALM4/5 标记及 3 个核基因组 SSR 标记检测结果进行判定。若待测品种样品与标准品种样品之间所有条带数目和峰位完全吻合，则判定待测品种和标准品种为同一品种；如存在不一致条带和峰值，则判定为不是同一品种。8.2种薯纯度检测根据待检测样品数量，在逐一提取样品基因组DNA后，可采取混合样品（5
18、10个样品DNA等量混合为一个混合样品）检测。按8.1结果判定流程，如判定为同一样品，则品种纯度（P）记为100%。如检测结果低于100%，则对有差异的混合样品分别进行逐一检测，最后根据有差异的检测样品数量（S）占总抽样检测样品数量（T）的百分比来判定品种纯度，按照公式（2）进行计算：%1001TSP.(2)式（2）中：P种薯纯度（%）；S有差异的检测样品数量；t总抽样检测样品数量。8.3鉴定结果报告样式鉴定结果报告样式见附件D。DB5301/T 2620197附录A（规范性附录）常用贮备液表 A.l表 A.4 给出了常用贮备液的配制方法。表A.1为1.0 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸贮
19、备液（Tris-HCl贮备液）（pH 8.0，1 000 mL）。表 A.1Tris-HCl 贮备液成分用量备注三羟甲基氨基甲烷（Tris 碱）121.1 g灭菌双蒸水(ddH2O)800 mL37%浓盐酸(HCl)约 42 mL用约 42 mL 浓盐酸调节 pH 值至 8.0最终体积1 000 mL用 ddH2O 定容至 1 000 mL。灭菌后，室温保存表A.2为0.5 mol/L 乙二胺四乙酸贮备液(EDTA贮备液）（pH 8.0，1 000 mL)。表 A.2EDTA 贮备液成分用量备注乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA-2H2O)186.1 g灭菌双蒸水(ddH2O)700 mL10
20、mol/L 氢氧化钠(NaOH)约 50 mL用约 50 mL 氢氧化钠调节 pH 值至 8.0最终体积1 000 mL用 ddH2O 定容至 1000 mL。灭菌后，室温保存表A.3为十倍三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸缓冲液（50TAE缓冲液）（pH 8.0，1 000 mL）。表 A.350TAE 缓冲液成分用量备注Tris 碱(Tris base)242 g冰醋酸(Acetic acid)57.1 mL0.05 M EDTA(pH 8.0)100 mL灭菌双蒸水(ddH2O)800 mL用 ddH2O 定容至 1 000 mL最终体积1 000 mL灭菌后，室温保存表 A.4 为电
21、泳上样缓冲液（50 mL）。表 A.4上样缓冲液成分用量备注98%甲酰胺(Formamide)47 mL0.2 M EDTA(pH8.0)2.5 mL溴酚蓝（Bromophenol）0.25 g也可用 5 mL ddH2O 溶解后，按需要量加入二甲苯青（Xylene cyanol）0.25 g最终体积50 mL4 冰箱保存DB5301/2620198AB附录B（规范性附录）DNA 提取试剂表B.1为2X十六烷基三甲基溴化铵缓冲液（2 CTAB缓冲液）(pH 8.0，1 000 mL)。表 B.12 CTAB 缓冲液成分用量备注1.0 M Tris-HCl(pH8.0)100 mL0.5 M E
22、DTA(pH8.0)40 mL氯化钠(NaCl)81.82 g加入 600 mL ddH2O 加热搅拌十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)20 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2 g灭菌双蒸水(ddH2O)用 ddH2O 定容至 1 000 mL最终体积1 000 mL灭菌后，室温保存表B.2为氯仿：异戊醇混合液(24：1，100 mL)。表 B.2氯仿：异戊醇混合液成分用量备注氯仿(Chloroform)96 mL异戊醇(Isoamylol)4 mL最终体积100 mL临时配制表B.3为十倍三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液（10 TE缓冲液）（pH 8.0，1 000 mL）。表 B.310 TE
23、 缓冲液成分用量备注1.0 M Tris-HCl(pH 8.0)100 mL0.5 M EDTA(pH 8.0)20 mL灭菌双蒸水(ddH2O)800 mL用 ddH2O 定容至 1 000 mL最终体积1 000 mL灭菌后，室温保存DB5301/T 2620199BC附录C（规范性附录）引物表C.1为细胞质和细胞核引物信息表。表 C.1引物信息引物名称SSR 基序引物序列(53)退火温度()染色体预期产物(bp)T-F:GGAGGGGTTTTTCTTGGTTGR:AAGTTTACTCACGGCAATCG60cpDNA446/205D-F:CGGGAGGTGGTGTACTTTCTR:ACG
24、GCTGACTGTGTGTTTGA60mtDNA527/N*ALM4/5-F:AATAATCTTCCAAGCGGAGAGR:AAGACTCGTGATTCAGGCAAT57mtDNA2 400/1 600/N*STI0003(ACC)nF:ACCATCCACCATGTCAATGCR:CTCATGGATGGTGTCATTGG60VIII137188STI0033(AGG)nF:TGAGGGTTTTCAGAAAGGGAR:CATCCTTGCAACAACCTCCT61VII131155STM0030(GT/GC)(GT)nF:AGAGATCGATGTAAAACACGTR:GTGGCATTTTGATGGATT58XII122168*：无条带扩增DB5301/26201910CD附录D（规范性附录）检测报告样式表D.1为马铃薯品种真实性及种薯纯度检测报告。表 D.1马铃薯品种真实性及种薯纯度检测报告No.样品名称马铃薯询问品种名称送检日期品种采样时间品种采样地点样品数量检测依据地方标准规范号检验日期检测指标样品结果类型标准品结果类型一致性送检样品纯度%细胞质 T 标记细胞质 D 标记细胞质 ALM4/5 标记细胞核 STI0003 标记细胞核 STI0033 标记细胞核 STM0030 标记检验结论签发日期：年月日备注审批：送检员：_