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1、ICS 65.020.30 CCS B 44 上日B王1海市士也方标3佳DB31月1278-2021实验裸摄鼠遗传质量控制Laboratory naked mole-rat-Genetic quality control 2021-01-04发布2021-04-01实施Al白室主，.a.f)/100 表1封闭群裸睡鼠遗传栓测果样要求采用微卫星DNA标记检测方法。具体方法执行附录A.6.4 结果判定采样数量不少于16只不少于30只群体内遗传变异采用平均杂合度指标或群体平衡状态方法进行评价。当平均杂合度在0.50.7,且期望杂合度与观测杂合度经卡方检验无明显差异时，群体为裸摄鼠封闭群。或通过群体所
2、有位点哈代温伯格指数(Hardy-Weinberg,HWE)2的P值进行判断，若P值均大于0.05，判定为裸睡鼠封闭群。若有任何一个位点的P值小于或等于0.05，则不能判定为裸睡鼠封闭群。6.5 检测频率封闭群裸摄鼠生产群12个月至少进行一次遗传质量检测。2 A.1 原理附录A(规范性)封闭群裸睡鼠的微卫星DNA标记检测方法DB31月1278-2021采集封闭群裸假鼠的血液或组织，提取基因组DNA。对特定的微卫星标记座位进行PCR扩增，通过遗传分析仪检测各座位基因的峰形和大小，确定各微卫星标记的遗传概貌。A.2 仪器设备应用到的仪器设备包括但不限于EU 常压电泳仪Fb)4C冰箱、-20C冰箱5
3、c)低温高速离心机Fd)水浴锅;e)分析天平$f)pH计sg)紫外分光光度仪zh)PCR仪si)毛细管电泳仪(STR)0 A.3 检测方法A.3.1 样本的采集采集约0.1g组织或0.5mL血液，放人75%乙蹲保存。.4.3.2 基因组DNA的提取用酷-锅仿萃取法或试剂盒提取基因组DNAoA.3.3 微卫星位点采用25个微卫星位点检测封闭群裸摄鼠的遗传概貌。各微卫星位点的名称、引物序列、等位基因数、镜离子浓度及等位基因分布范围见表A.l。表A.1微卫星位点的引物序列、最佳退火温度、镶离子跟度及等位基因数分布范围二核心序列-范围l 编号等位基因数引物(5仁3)最佳退火温度Mg2+浓度mmol/L
4、 ATACCCTGGTTTCCTGAT SMMU2016001 4 54 GAATGGTTTTATTGCATAG 2 CTAA)口284-299 SMMU2016003 4 I GGGTAGCAGGGCCAAGTT GGTAAAGGTCCTCGCATC 56 1.5(TAA)171-189 ACCCAGCAGCCAGAATAA SMMt;20 16005 3 56 1.5(TTA)13 219-228 AAGCCAGGAGGATCAAAA GCCTGGGATAAGCACTCA SMMU2016008 4 56 2(TAA)CTTTCCTTTGTTACCCTC 二二二3 DB31月1278-20
5、21表A.1微卫星位点的引物序列、最佳理火温度、镇离子浓度及等位基因数分布范围(续)一-M旷+浓度范围最佳退火温度核心序列编号等位基因数引物(5-3)mmol/L TCCCTTTGCATATCAACA 56 2(TAA)15 227-242 SMMU2016009 5 AAGCAGGCAGAATACCAT GCCCAGCTAAAGCACAGT SMMU2016010 4 AAGCCAGCCCTACAAATA 56 2(TTA)H 202-223 TCAGAGGCTCCAGTTCAT SMMU2016012 4 GGTTCTGGGATCTGTC 56 1.5(ATT)16 186-201 SMM
6、U2016013 4 TGAAATGGGCTTAGGTTT ATTACGGGGATATGGTAG 56 1.5(TTA)19 248-263 TTCCATTTGGCTACACTT SMMU2016016 6 CTCTGCTGGGTTTCACTA 56 2(TTA)u 282-300 AGCAACAGATTCCTTAAA SMMU2016021 6 GAGGTGGAGAAAATAACA 56 2(TAA)16 240-261 SMMU2016022 6 GGACCCAAA寸CAATCCGTGCGTGCTGCTGATAG 56 2(AAGG)34 206-262 GCAAAGTAAAAGGATTC
7、 SMMU2016023 3 ACATTGAAGATGCTGAA 54 2(GAGAA)9 284-294 CCAGAAGAAGCCCAAAG SMMU2016024 4 ACAGGAGGATCGCCAAG 56 2(CTCTT)9 186-216 TCTGCATTTAATACTGG 56 2(CTCTT)10 207-222 SMMU2016026 4 GATGGAGACAAACAAGG TCCATGCAACTGTTTGAG SMMU2016028 6 CTTCCTGGTGACATCTACTG 56 2(CA)u 258-272 AACTGAAGAACTGCCTAA SMMU2016029
8、5 AAGAGGTCCAAGTGAGG 56 2(TG).259-269 CTCAGGGAACCCCAAAT SMMU2016030 4 GGGAAGTTTTCAGCCAC 56 2(CA)26 178-188 CCAACTGCCTTTGCTGC SMMU2016031 4 GCCCTTGTGGCTTCCTC 56 2(CA)28 235-255 TGAAGGTGGGAAGAAGT SMMU2016032 4 AAGCCATTAGCATTGTG 56 2(TG)9 259-269 SMMU2016036 6 TGAACTCTGGTCCTTGT AACCTCATTAAGCAGATAG 56 2(
9、CA)6 264-292 GTTCTGTGCAGGACTCGG 56 2(TG)183-215 SMMU2016037 8 ATTCGGTGGTGAAATGAGAr ACAGTTAAATGGCCTTAG CTG)口262-280 56 2 SMMU2016038 6 TGTTCTGACAGCATCCC AGGTGAATCTGGAAGGA 56 2 CGT)3 247-257 SMMU2016041 5 GGTGGGATTTAGGAATAG TGTGACCTCCGAATAGC SMMU2016043 8 56 TGACTTAGAAAGACCCTGT 2 CTG)206-238 CTCCTCCTG
10、ACTTTTCA SMMU20160 45 5 ACTGCTTCACTTTCCTC 56 2 CTG)26 244-256-4 DB31月1278-2021A.3.4 PCR扩增A.3.4.1 PCR扩增的体系A.3.4.1.1 PCR总反应体积为30L，其中含10XPCR缓冲液3L，各组分的终浓度为0.05U Taq Polymerase/L，250M dNTP,50 mM KCl，特异性引物(R链，F链)o.2M，0.5L DNA模板(30 ng60 ng)，纯71补齐反应体积。A.3.4.1.2 PCR反应程序为:94.C预变性，3min;94.C变性，30s;退火温度各位点退火温度参见
11、表A.口，30 s;72.C延伸，30的30个循环;72.C继续延伸5min;扩增产物4.C保存。A.3.4.2 PCR产物的栓测PCR产物，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳以及凝胶成像系统拍照检测扩增结果。A.3.4.3 扩增产物的STR扫描扩增产物经过琼脂糖凝肢电泳检测确保扩增出目的片段后，选择分别以FAM，HEX标记的两个位点的扩增产物，以1:1.5体积比混合，取1L上样进行STR扫描。A.3.5 STR扫描结果的判读与统计分析A.3.5.1 STR扫描结果的判读A.3.5.1.1 扫描结果出现两种波形z一种为纯合基因型，只有一个主波z另一种为杂合基因型，有两个主波。同时，根据软件读出波峰处的
12、扩增产物的bp数。A.3.5.1.2 由基因分型软件读出每个样本在每个微卫星位点的扩增片段大小。每个位点的等位基因根据扩增片段从小到大顺序排列记录为a，b，c，d.等。A.3.5.2 运用群体遗传分析软件对敢据进行统计分析将所有样本的每个微卫星位点的基因型以ab，bb等形式输入群体遗传分析软件的数据文件，计算样品在各微卫M位点上的基因频率、平均观察等位基因数、平均有效等位基因数(Ne)、香隆指数、平均杂舍度(H)等。A.3.6 结果判定平均杂合度在0.50.7，且期望杂合度与观测杂合度经卡方检验无明显差异时，判定为裸睡鼠封闭群。或者，首先得到各个位点上各基因频率、基因型频率的实际值，然后计算出
13、基因频率和基因型频率的预期值。用实际值和预期值比较，通过群体所有位点晗代温伯格指数(Hardy-Weinberg，HWE)X2的P值进行判断，若P值均大于0.05，判定为裸瞟鼠封闭群。若有任何一个位点的P值小于或等于0.05，则不能判定为裸服鼠封闭群。-NON-hNFHFm由自上海市地方标准实验棵睡鼠遗传质量控制DB31/T 1278-2021*中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址总编室:(010)68533533发行中心:(010)51780238读者服务部，(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销*印张0.75字数12千字2021年4月第一次印刷开本880X12301/16 2021年4月第一版16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价唔I 号155066 5-29:31 DB31/T 1278-2021 打印H期2021年4JJ12十jF002AA