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1、发根农杆菌介导的植物遗传转化发根农杆菌介导的植物遗传转化农杆菌质粒介导的基因转移系统是植物基因工程农杆菌质粒介导的基因转移系统是植物基因工程中比较完善而有效的方法。在转基因植物中有中比较完善而有效的方法。在转基因植物中有8080以上是由农杆菌介导转化的，但是其中大以上是由农杆菌介导转化的，但是其中大部分是由根癌农杆菌部分是由根癌农杆菌TiTi质粒介导获得的。质粒介导获得的。19821982年年ChiltonChilton报道发根农杆菌报道发根农杆菌(AgrobacteriumAgrobacterium rhizogenesrhizogenes)能诱导植物产生发状根能诱导植物产生发状根(Hair
2、y(Hairy root)root)，这种发状根又称毛状根，是由发根农，这种发状根又称毛状根，是由发根农杆菌所含有的杆菌所含有的RiRi质粒质粒(Root inducing(Root inducing plasmid)plasmid)引起的。引起的。与根癌农杆菌相比，发根农杆菌在植物遗传转化方面具有明与根癌农杆菌相比，发根农杆菌在植物遗传转化方面具有明显的优越性。显的优越性。用用Ti质粒作为基因载体时由于质粒作为基因载体时由于Ti质粒质粒T-DNA区的癌基因区的癌基因经常造成被转化的植物组织形成肿瘤，阻碍正常植物的再经常造成被转化的植物组织形成肿瘤，阻碍正常植物的再生，为了防止肿瘤的形成，常采
3、用除去生，为了防止肿瘤的形成，常采用除去Ti质粒质粒TDNA区区癌基因的方法，即癌基因的方法，即“解除武装解除武装”，而用，而用Ri质粒作为基因载质粒作为基因载体时，不需要体时，不需要“解除武装解除武装”，从其转化的植物细胞上很容，从其转化的植物细胞上很容易再生出植株；易再生出植株；Ti质粒转化植物产生的瘤组织有可能是一个转化细胞与非质粒转化植物产生的瘤组织有可能是一个转化细胞与非转化细胞所构成的嵌合体，而发根农杆菌转化植物产生的转化细胞所构成的嵌合体，而发根农杆菌转化植物产生的毛根来源于同一个植物细胞，因此，毛根的每一个细胞都毛根来源于同一个植物细胞，因此，毛根的每一个细胞都是转化的；是转化
4、的；毛根的无性系可以通过激素的自主性进行选择；毛根的无性系可以通过激素的自主性进行选择；毛根的无性系可以通过激素的自主性进行选择；毛根的无性系可以通过激素的自主性进行选择；RiRi质粒转化植物所产生的毛状根分化为正常植株的分化质粒转化植物所产生的毛状根分化为正常植株的分化质粒转化植物所产生的毛状根分化为正常植株的分化质粒转化植物所产生的毛状根分化为正常植株的分化率高，倍性稳定，并且容易建成一系列能够在不同植物率高，倍性稳定，并且容易建成一系列能够在不同植物率高，倍性稳定，并且容易建成一系列能够在不同植物率高，倍性稳定，并且容易建成一系列能够在不同植物细胞核染色体上插入一个细胞核染色体上插入一个
5、细胞核染色体上插入一个细胞核染色体上插入一个T-DNAT-DNA拷贝的株系。拷贝的株系。拷贝的株系。拷贝的株系。毛状根具有生长迅速、多分支、数量大、没有向地性，毛状根具有生长迅速、多分支、数量大、没有向地性，毛状根具有生长迅速、多分支、数量大、没有向地性，毛状根具有生长迅速、多分支、数量大、没有向地性，拥有亲本植物的特征次级代谢途径，能形成有价值的次拥有亲本植物的特征次级代谢途径，能形成有价值的次拥有亲本植物的特征次级代谢途径，能形成有价值的次拥有亲本植物的特征次级代谢途径，能形成有价值的次生代谢产物等特点。生代谢产物等特点。生代谢产物等特点。生代谢产物等特点。由毛状根再生的植株经常表现出节间
6、短、顶端优势比较由毛状根再生的植株经常表现出节间短、顶端优势比较由毛状根再生的植株经常表现出节间短、顶端优势比较由毛状根再生的植株经常表现出节间短、顶端优势比较弱、叶皱等特殊特征，这对于植物转化体的筛选非常有弱、叶皱等特殊特征，这对于植物转化体的筛选非常有弱、叶皱等特殊特征，这对于植物转化体的筛选非常有弱、叶皱等特殊特征，这对于植物转化体的筛选非常有利。利。利。利。发根农杆菌是根瘤菌科发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属农杆菌属(agrobacterium)的一种的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植
7、物和少数单子叶植物以及个别裸子植物以及个别裸子植物。Ri质粒为根诱导质粒质粒为根诱导质粒(Root Inducing Plasmid)；Ri质粒的大小为质粒的大小为200800 kb，它含有负责发根自主性生长和冠瘿碱合成的基因，在结构上有致毒，它含有负责发根自主性生长和冠瘿碱合成的基因，在结构上有致毒区区(Vir区区)，转移进入植物细胞核的，转移进入植物细胞核的T-DNA区及其内部的冠瘿碱合成功能区及其内部的冠瘿碱合成功能区等。区等。根据其合成冠瘿碱的不同，可将根据其合成冠瘿碱的不同，可将Ri质粒分为质粒分为4种类型：种类型：甘露碱型甘露碱型(Mannopine Type)，合成甘露碱及其酸、
8、农杆碱酸与农杆碱，合成甘露碱及其酸、农杆碱酸与农杆碱素素A；黄瓜碱型黄瓜碱型(Cucumopin Type)，合成黄瓜碱；，合成黄瓜碱；农杆碱型农杆碱型(Agropine Type)，合成农杆碱及其酸、甘露碱及其酸、农杆，合成农杆碱及其酸、甘露碱及其酸、农杆碱素碱素A；米奇矛型米奇矛型(Mikimopine Type)Petit等发现含农杆碱型等发现含农杆碱型Ri质粒的发根农杆菌较甘露碱型、黄瓜碱型和米质粒的发根农杆菌较甘露碱型、黄瓜碱型和米奇矛型有更为广泛的宿主范围。奇矛型有更为广泛的宿主范围。Ri质粒RiRi质粒通过质粒通过T-DNAT-DNA转移到被侵染植物中，使其生成毛状根。转移到被侵
9、染植物中，使其生成毛状根。农杆碱型农杆碱型RiRi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA呈不连续分布，呈不连续分布，TR-DNATR-DNA及及TL-TL-DNADNA上的基因与毛状根的形成有关，同时也影响着再生植上的基因与毛状根的形成有关，同时也影响着再生植株地上部分形态和一些生理性状。株地上部分形态和一些生理性状。TR-DNATR-DNA的基因的基因tmsltmsl和和tms2tms2能指导能指导IAAIAA的合成，因此转化生成毛状根在培养时不的合成，因此转化生成毛状根在培养时不需要添加生长激素。所有需要添加生长激素。所有RiRi质粒质粒VirVir区的保守性很高，在区的保守性很高，在转化过
10、程中，转化过程中，VirVir区上的基因不发生转移，但它对区上的基因不发生转移，但它对T-DNAT-DNA的转移起着极为重要的作用；在通常状态下，的转移起着极为重要的作用；在通常状态下，VirVir区的基区的基因处于抑制状态，当发根农杆菌感染植物时，受损伤植因处于抑制状态，当发根农杆菌感染植物时，受损伤植物合成乙酰丁香酮，使物合成乙酰丁香酮，使VirVir区抑制状态的基因被激活，产区抑制状态的基因被激活，产生限制性核酸内切酶，在酶的作用下产生生限制性核酸内切酶，在酶的作用下产生T-DNAT-DNA链，并引链，并引导导T-DNAT-DNA链与细菌细胞膜上的特定部位结合，然后向植物链与细菌细胞膜上
11、的特定部位结合，然后向植物细胞转移，进入植物细胞核内，细胞转移，进入植物细胞核内，T-DNAT-DNA随后整合进入植物随后整合进入植物细胞基因组。细胞基因组。发根农杆菌感染植物的方法发根农杆菌感染植物的方法发根农杆菌感染植物的方法发根农杆菌感染植物的方法发根农杆菌诱导植物毛状根生成的方法主要有以下发根农杆菌诱导植物毛状根生成的方法主要有以下3种：种：植物体直接接种法植物体直接接种法 在植物无菌苗、茎杆上划出伤口，将发根农杆菌接种在伤在植物无菌苗、茎杆上划出伤口，将发根农杆菌接种在伤口处，培养一段时间后，在接种部位产生毛状根。口处，培养一段时间后，在接种部位产生毛状根。外植体接种法外植体接种法
12、取植物的无菌外植体，与发根农杆菌共同培养，在选择培取植物的无菌外植体，与发根农杆菌共同培养，在选择培养基上进行继代培养，发根农杆菌被杀死，转化细胞产生养基上进行继代培养，发根农杆菌被杀死，转化细胞产生愈伤组织，并诱导生成毛状根。愈伤组织，并诱导生成毛状根。原生质体共培养法原生质体共培养法 将愈伤组织制备成原生质体，与发根农杆菌共同培养，在将愈伤组织制备成原生质体，与发根农杆菌共同培养，在含抗生素的选择培养基上对转化细胞进行筛选，得到转化含抗生素的选择培养基上对转化细胞进行筛选，得到转化克隆，再在分化培养基上得到完整的植株。克隆，再在分化培养基上得到完整的植株。发根的鉴定发根的鉴定形态学水平形态
13、学水平形态学水平形态学水平 ：激素自养，根丛生，多分枝，：激素自养，根丛生，多分枝，：激素自养，根丛生，多分枝，：激素自养，根丛生，多分枝，多根毛，无向地性多根毛，无向地性多根毛，无向地性多根毛，无向地性 组织水平：组织水平：组织水平：组织水平：GUS GUS 活性的测定或活性的测定或活性的测定或活性的测定或 NPTII NPTII 酶的检酶的检酶的检酶的检测测测测 细胞水平：冠瘿碱的测定细胞水平：冠瘿碱的测定细胞水平：冠瘿碱的测定细胞水平：冠瘿碱的测定 分子水平：分子水平：分子水平：分子水平：Southern Blot,PCRSouthern Blot,PCR等方法等方法等方法等方法 发根农
14、杆菌发根农杆菌1.1 菌株类型菌株类型 目前采用的发根农杆菌主要有天然农杆碱型的目前采用的发根农杆菌主要有天然农杆碱型的A4、ATCCl5834、16834、LBA9402及及1601、R1000、R1200等等人工构造质粒；还有黄瓜碱型的人工构造质粒；还有黄瓜碱型的2635、2657、2659等；等；以及甘露碱型的以及甘露碱型的5196、TRl01、TR7等，每一种菌株对不等，每一种菌株对不同植物的发根能力是不同的。同植物的发根能力是不同的。1.2 菌液浓度菌液浓度 一般菌种浓度过大，细菌生长迅速，一定程度上抑制细一般菌种浓度过大，细菌生长迅速，一定程度上抑制细胞代谢过程，且不易除菌；浓度太
15、稀，能附着在细胞的胞代谢过程，且不易除菌；浓度太稀，能附着在细胞的细菌太少，不足以形成足够的毛状根。细菌太少，不足以形成足够的毛状根。影响发根农杆菌转化的因素影响发根农杆菌转化的因素 植物及其外植体植物及其外植体2.1 植物种类植物种类 目前转化成功的植物主要是草本植物，尤以双子叶植物为目前转化成功的植物主要是草本植物，尤以双子叶植物为多，也有为数不多的单子叶植物多，也有为数不多的单子叶植物(如栝楼、旱墨莲、露水如栝楼、旱墨莲、露水草草)和少数木本植物和少数木本植物(如银杏如银杏)等诱导成功。等诱导成功。2.2 外植体类型外植体类型 已成功诱导出毛状根的植物外植体有叶片，茎、子叶、愈已成功诱导
16、出毛状根的植物外植体有叶片，茎、子叶、愈伤组织、下胚轴等多种，但不同的外植体发状根的诱导率伤组织、下胚轴等多种，但不同的外植体发状根的诱导率不同。究竟植物的哪一部分器官最适合用于转化，并无严不同。究竟植物的哪一部分器官最适合用于转化，并无严格的规律可循，但一般采用的都是较幼嫩的组织，因为这格的规律可循，但一般采用的都是较幼嫩的组织，因为这些细胞处于旺盛的分裂状态，容易接受外源些细胞处于旺盛的分裂状态，容易接受外源DNA。2.3 外植体预培养以及浸染和共培养时间外植体预培养以及浸染和共培养时间 外植体产生伤口后在愈合过程中会形成乙酰丁香酮等物质并释放出外植体产生伤口后在愈合过程中会形成乙酰丁香酮
17、等物质并释放出来作为诱导发根农杆菌识别的信号分子，因此发根农杆菌侵染前要来作为诱导发根农杆菌识别的信号分子，因此发根农杆菌侵染前要经过一定时间预培养，使受体能形成并释放这种信号分子，提高转经过一定时间预培养，使受体能形成并释放这种信号分子，提高转化率。同时经农杆菌感染的外植体伤口处细胞因为过敏反应而可能化率。同时经农杆菌感染的外植体伤口处细胞因为过敏反应而可能导致褐化，严重影响根的形成及转化效率预培养也能较好的解决导致褐化，严重影响根的形成及转化效率预培养也能较好的解决褐化问题。褐化问题。用烟草叶片在菌液中分别浸泡用烟草叶片在菌液中分别浸泡1，5，10、30、60 rain后进行转化，结后进行
18、转化，结果表明果表明5 rnin可达到较高转化率，时间过长超过可达到较高转化率，时间过长超过30 min叶片死亡率上叶片死亡率上升。转化后叶片共培养升。转化后叶片共培养14 d有不同的转化率，共培养有不同的转化率，共培养2 d转化率最转化率最高，过早的结束共培养，转入抗生素虽可抑制菌的增殖，但也明显高，过早的结束共培养，转入抗生素虽可抑制菌的增殖，但也明显降低了发根诱导率，共培养时间过长，由于农杆菌过量增殖而致使降低了发根诱导率，共培养时间过长，由于农杆菌过量增殖而致使叶片组织死亡率升高，而且增加了除菌的难度，转化率也大幅下降。叶片组织死亡率升高，而且增加了除菌的难度，转化率也大幅下降。2.4
19、 外植体放置方向外植体放置方向 可能与叶片上下表皮细胞生理结构不同、分泌次生物质能力存在差可能与叶片上下表皮细胞生理结构不同、分泌次生物质能力存在差异等有关。异等有关。化学因子化学因子3.1 培养基培养基 一般而言，高盐培养基如一般而言，高盐培养基如MS、LS等有助于毛状根的形成；而低盐培养等有助于毛状根的形成；而低盐培养基如基如B5等则有助于细菌增殖，在毛状根形成后的除菌过程中，除菌比较等则有助于细菌增殖，在毛状根形成后的除菌过程中，除菌比较困难。困难。3.2 外源激素外源激素 在发状根的诱导过程中，添加适当浓度的外源激素对于提高发状根的诱在发状根的诱导过程中，添加适当浓度的外源激素对于提高
20、发状根的诱导频率有明显的促进作用。导频率有明显的促进作用。3.3 酚类物质酚类物质 植物受伤后产生的酚类物质能激活植物受伤后产生的酚类物质能激活vir基因，促使基因，促使Ri质粒向植物细胞转移，质粒向植物细胞转移，在转化系统中加入某种酚类物质可以促进基因转化。目前广泛使用的是在转化系统中加入某种酚类物质可以促进基因转化。目前广泛使用的是AS、羟基乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮(OH-AS)和香草酚等酚类物质。添加适量和香草酚等酚类物质。添加适量AS能显著能显著提高发状根的转化效率，但是过量的提高发状根的转化效率，但是过量的As对外植体有毒害作用，影响转化对外植体有毒害作用，影响转化效果。效果。3.
21、4 碳水化合物碳水化合物 发根农杆菌发根农杆菌Ri质粒的质粒的rolC生根基因的启动子活性受蔗糖浓度的调节，糖生根基因的启动子活性受蔗糖浓度的调节，糖类物质可以协助乙酰丁香酮等物质诱导产生高水平的类物质可以协助乙酰丁香酮等物质诱导产生高水平的vir区基因表达，从区基因表达，从而提高转化率。而提高转化率。物理因子物理因子4.1 光照强度光照强度 4.2 温度温度4.3 pH值值 在农杆菌与植物细胞进行共培养时，使用较低在农杆菌与植物细胞进行共培养时，使用较低pH的培养基有利于转化的培养基有利于转化频率的提高。原因可能是在偏酸的培养条件下，有利于农杆菌频率的提高。原因可能是在偏酸的培养条件下，有利
22、于农杆菌Vir区基区基因的表达，但较低因的表达，但较低pH条件下，培养基的凝固状态较差不利于试验操条件下，培养基的凝固状态较差不利于试验操作，容易污染。作，容易污染。4.4 超声波、微波和真空渗透处理超声波、微波和真空渗透处理 真空渗透处理在植物材料表面产生很多微损伤，抽真空后形成的负压真空渗透处理在植物材料表面产生很多微损伤，抽真空后形成的负压使农杆菌更紧密地吸附于外植体伤口及伤口内细胞间隙，促进使农杆菌更紧密地吸附于外植体伤口及伤口内细胞间隙，促进T-DNA向植物细胞的导入。超声波处理也可在外植体上产生许多微小伤口，向植物细胞的导入。超声波处理也可在外植体上产生许多微小伤口，从而提高农杆菌
23、与外植体之间的接触面积，提高转化频率。短暂微波从而提高农杆菌与外植体之间的接触面积，提高转化频率。短暂微波辐射产生的热效应也有助于农杆菌辐射产生的热效应也有助于农杆菌T-DNA向植物细胞的导入。向植物细胞的导入。4.5 甘露醇预处理甘露醇预处理 高渗处理可有效提高转化率。这可能是由于一定浓度的高渗处理可有效提高转化率。这可能是由于一定浓度的甘露醇使细胞处于渗透胁迫条件下发生质壁分离和轻微细甘露醇使细胞处于渗透胁迫条件下发生质壁分离和轻微细胞伤害，而这种受伤状态有利于农杆菌向受体细胞的附着胞伤害，而这种受伤状态有利于农杆菌向受体细胞的附着和和T-DNA通过合成如脯氨酸类渗透调节物向植物细胞的转通
24、过合成如脯氨酸类渗透调节物向植物细胞的转移和整合。但是甘露醇浓度过高移和整合。但是甘露醇浓度过高(0.75 molL)和处理时和处理时间过长间过长(24 h)则可能使细胞处于高渗环境形成不可逆受伤则可能使细胞处于高渗环境形成不可逆受伤状态，转化率反而降低。状态，转化率反而降低。毛状根的应用毛状根的应用用毛状根生产次生代谢产物用毛状根生产次生代谢产物 利用发根农杆菌进行次生代谢物质生产，具有利用发根农杆菌进行次生代谢物质生产，具有许多适应工业化生产的特点，如无需添加外源许多适应工业化生产的特点，如无需添加外源生长素、迅速自主生长、遗传稳定性高、能合生长素、迅速自主生长、遗传稳定性高、能合成植物特
25、有的次生代谢物，而且其含量往往比成植物特有的次生代谢物，而且其含量往往比植物自身合成的含量还高。植物自身合成的含量还高。毛状根培养技术在理论研究中的应用毛状根培养技术在理论研究中的应用 由于发根农杆菌诱导生成的毛状根生长迅速、条件可由于发根农杆菌诱导生成的毛状根生长迅速、条件可控且遗传稳定性高，因而生成的毛状根是进行许多与根控且遗传稳定性高，因而生成的毛状根是进行许多与根相关的理论研究的理想试验系统。相关的理论研究的理想试验系统。另外，发根农杆菌转基因获得的毛状根也可以作为研另外，发根农杆菌转基因获得的毛状根也可以作为研究作物根部寄生病虫害病理的良好材料。究作物根部寄生病虫害病理的良好材料。毛
26、状根再生获得转基因植物和培育作物新品种毛状根再生获得转基因植物和培育作物新品种 将经过筛选的含有目的基因的毛状根转到分化培养基上将经过筛选的含有目的基因的毛状根转到分化培养基上诱导芽的产生，带芽组织再经生根培养即可诱导生根，诱导芽的产生，带芽组织再经生根培养即可诱导生根，成为一株完整的转基因再生植株。目前，烟草、苜蓿、成为一株完整的转基因再生植株。目前，烟草、苜蓿、豌豆、咖啡等植物都已经可以经毛状根诱导再生出完整豌豆、咖啡等植物都已经可以经毛状根诱导再生出完整植株。植株。此外，由发根农杆菌感染植物获得的毛状根所再生的后此外，由发根农杆菌感染植物获得的毛状根所再生的后代会表现出顶端优势丧失、叶片皱缩、节间缩短、花形代会表现出顶端优势丧失、叶片皱缩、节间缩短、花形改变等现象。这种再生植株的矮化现象在花卉矮化育种改变等现象。这种再生植株的矮化现象在花卉矮化育种中具有特别的意义。中具有特别的意义。