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1、1/1/2023|Life Technologies 1 STRSTR片段分析技术相关知识片段分析技术相关知识肖怀东 Field Application SpecialistTel:400 820 8982/800 820 8982E-mail:CNAPM1/1/2023|Life Technologies 2 摘要摘要基本概念回顾片段分析技术原理及过程常见影响分型因素1/1/2023|Life Technologies 3 基本概念回顾基本概念回顾1/1/2023|Life Technologies 4 基本概念回顾基本概念回顾基本概念染色体、DNA、基因、遗传标记、等位基因等分子遗传标记的
2、发展STR概念及相关特性1/1/2023|Life Technologies 5 Target Region for PCR双链DNA细胞核（cell nucleus）Individual nucleotides染色体（chromosome）22 pairsXX or XYGene基因能够表达出特定功能的产物，并决定生物体特定性状的一段DNA序列常用术语常用术语染色体DNA的组装形式，每个人体细胞含有23对染色体1/1/2023|Life Technologies 6 常用术语常用术语能够稳定遗传的任何分子特征个体间有显著差异且易于检测可位于染色体的任意位置遗传标记（Genetic Marke
3、r）1/1/2023|Life Technologies 7 第2号染色体第2号染色体D2S118GAGAD2S118GAGAD2S118GAGAD2S118GAGAGAGAGA纯合子杂合子常用术语常用术语基因座遗传标记在染色体上的位置。同源染色体成对的两条染色体互称为同源染色体等位基因在同源染色体上占据相同座位上的一对等位基因。D2S1181/1/2023|Life Technologies 8 多态性（Polymorphism）序列多态性，DNA在序列上的变异长度多态性-AGACTAGACATT-AGATTAGGCATT-(AATG)(AATG)(AATG)-2 repeats3 repe
4、ats-(AATG)(AATG)-常用术语常用术语1/1/2023|Life Technologies 9 分子遗传标记的发展分子遗传标记的发展“If you want to understand today,you have to search yesterday.”Attributed to Pearl Buck(http:/ Nobel Prize in Literature 1938 Pearl Buck 1/1/2023|Life Technologies 10 分子遗传标记的发展分子遗传标记的发展1985199019941998200020021992200619962004201
5、020082013RFLPSNPGill et al.(1985)Forensic application of DNA fingerprints.Nature 318:577-9PCR首次描述20121991STR第一个商业化荧光复合STR试剂盒PCR应用于办案CODIS loci definedUK National Database launched(April 10,1995)STR成为常规使用Identifiler 5-dye kit and ABI 3100首个Y-STR试剂盒miniSTRIdentifiler DirectIdentifiler Plus3500/xlY-Dir
6、ectGlobal FilerPGMCODIS update参考BulterForensic DNA typing1/1/2023|Life Technologies 11 什么是什么是STR?短串联重复序列（Short tandem repeat,STR）=微卫星DNA(microsatellite DNA)=简单重复序列（simple sequence repeat,SSR)长度多态性遗传标记，一般由 2-6个碱基的DNA重复序列组成，其长度多态性来源于重复单位拷贝数的个体差异。常用术语常用术语DinucleotideTrinucleotideTetranucleotidePentanuc
7、leotideHexanucleotide(CA)(CA)(CA)(CA)(GCC)(GCC)(GCC)(AATG)(AATG)(AATG)(AGAAA)(AGAAA)(AGTACA)(AGTACA)1/1/2023|Life Technologies 12 5TCCCAAGCTCTTCCTCTTCCCTAGATCAATACAGACAGAAGACAGGTGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATCATTGAAAGACAAAACAGAGATGGATGATAGATACATGCTTACAGATGCACAC 3=12 GATA repeats(
8、“12”is all that is reported)Target region(short tandem repeat)7 repeats8 repeats9 repeats10 repeats11 repeats12 repeats13 repeatsThe number of consecutive repeat units can vary between people1/1/2023|Life Technologies 14 适用于法医适用于法医DNADNA分型的分型的STRSTR基因座的选择基因座的选择较高的个体识别率，通常0.9，观测杂合度0.7在染色体上定位相对较远，确保无连
9、锁低stutter产物、低突变率 与其他遗传标记复合检测时易于得到结果，且具有重现性鉴定的位点越多，判错的可能性越小，个体识别能力越来越强1/1/2023|Life Technologies 15 统计学基本概念统计学基本概念遗传多态性指控制遗传标记的基因座上存在有两个或两个以上的等位基因，并且等位基因的频率大于0.01.基因频率/等位基因频率指某种等位基因数目占该等位基因上所有等位基因总数目的百分比杂合度（heterozygosity）是一个传统的遗传学指标，指群体中某遗传标记所有基因型中杂合子所占的比例。个人识别率（Probabilty of Discrimination power,PD
10、)在群体中随机抽取两个体，二者的遗传标记表型不同的概率1/1/2023|Life Technologies 16 CSF1POD5S818D21S11TH01TPOXD13S317D7S820D16S539D18S51D8S1179D3S1358FGAVWA13 CODIS Core STR LociAMELAMELSex-typing法医学应用的法医学应用的STRSTR在染色体上的位置在染色体上的位置Core STR Loci for the United States1997SE3320112012D10S1248D2S441D22S104523D2S1338D19S433D1S1656D
11、12S391DYS3911/1/2023|Life Technologies 17 1/1/2023|Life Technologies 18 STR的特性的特性分布广泛，有高度多态性。检测方法简单。扩增片段短，适用于降解、陈旧和腐败检材的分型鉴定。复合扩增，可以实现自动化操作，节约时间、节约检材、提高检测效率。目前，STR已广泛应用于遗传制图、连锁分析、亲子鉴定、个体识别、疾病基因定位和物种多态性研究等领域。常用术语常用术语1/1/2023|Life Technologies 19 片段分析技术原理及过程片段分析技术原理及过程1/1/2023|Life Technologies 20 STR
12、STR片段分析的原理片段分析的原理除同卵双生外，每个人/生物包含的DNA序列是不同的，独一无二的同一个个体的各种组织DNA具有相同的序列特征（如同一个人来自皮肤的DNA和血液的DNA是一样的，相匹配的）同一个个体的DNA序列在一生当中保持不变（除外某些疾病）同一个个体的DNA一半来自母亲，一半来自父亲1/1/2023|Life Technologies 21 样本采集样本制备 /样本提取FLOQSwabPrepFiler ExpressPrepFiler Express BTA AutoMate Express 扩增检测&数据分析STR片段分析的过程片段分析的过程定量7500HID Real
13、Time PCR Analysis Software1/1/2023|Life Technologies 22 样本采集样本制备 /样本提取扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程片段分析的过程样本采集FLOQSwab1/1/2023|Life Technologies 23 生物物证的采集生物物证的采集DNA是否能开展应用，现场采集至关很重要直接提取转移提取：擦拭、粘取、吸取等Fibre SwabFLOQSwab1/1/2023|Life Technologies 24 生物物证的采集生物物证的采集DNA是否能开展应用，现场采集至关很重要直接提取转移提取：擦拭、粘取、吸取等单细胞捕获Arc
14、turusXT LCM1/1/2023|Life Technologies 25 生物物证的采集生物物证的采集DNA是否能开展应用，现场采集至关很重要采集工具/介质无人类DNA，DNA酶和RNA酶高效收集（最大量、操作简便）无人体侵害性转移步骤少可自动化，易存储Bode Buccal CollectorCopan NUCLEICard System1/1/2023|Life Technologies 26 样本采集样本制备 /样本提取扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程片段分析的过程样本制备/样本提取PrepFiler ExpressPrepFiler Express BTA AutoM
15、ate Express 1/1/2023|Life Technologies 27 样本制备样本制备利于峰均衡性利于得到好的峰高利于减少杂峰用于口腔拭子和未经处理的采集卡Prep-n-Go BufferBSDBSD及打孔及打孔 1/1/2023|Life Technologies 28 使用PrepFiler Express试剂盒，专用于法医样品提取，以获得高质量DNA使用简单、可靠 操作时系统密闭，避免污染30分钟内可同时处理13个样本 （使用LySep柱 简化了裂解过程）提取的DNA完整、无抑制物针对定量和片段分析试剂盒进行了验证样本提取样本提取1/1/2023|Life Technolo
16、gies 29 样本采集样本制备 /样本提取扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程片段分析的过程定 量7500HID Real Time PCR Analysis Software1/1/2023|Life Technologies 30 定量定量准确的定量在法医DNA检测过程中至关重要过多的 DNA 会导致 off-scale峰,分裂峰(由于 noise 或+A),滑移峰和其他颜色的渗透峰.过少的 DNA 导致位点丢失、峰高不平衡指导后续试验选择试剂盒D3S1358-A+A10 ng template(overloaded)2 ng template(suggested level)DN
17、A Size(bp)Relative Fluorescence(RFUs)DNA Size(bp)100 pg template5 pg templateWe generally shoot for 0.5-2 ng1/1/2023|Life Technologies 31 定量定量仪器仪器 75007500定量试剂盒的选择定量试剂盒的选择Quantifiler Human DNA Quantification KitQuantifiler Y Human Male DNA Quantification KitQuantifiler Duo DNA Quantification kit1/1/
18、2023|Life Technologies 32 样本采集样本制备 /样本提取扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程片段分析的过程扩 增1/1/2023|Life Technologies 33 扩扩 增增PCR是什么?Polymerase Chain ReactionPCR的应用有哪些？个人识别和亲权鉴定，传染病诊断，快速分子诊断，动物健康与食品安全PCR的过程PCR反应组分PCR反应影响因素Master MixPCRbufferTris-HClMgCl2KCldNTP增强剂BSA等PrimerForward PrimerReverse PrimerTaq酶MgCl2浓度dNTP浓度引
19、物浓度模板质量反应PH值循环参数模板1/1/2023|Life Technologies 34 PCRPCR过程示意图过程示意图1/1/2023|Life Technologies 35 样本采集样本制备 /样本提取扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程片段分析的过程电泳检测1/1/2023|Life Technologies 36 不同长短的片段可以通过电泳分离相同长短的片段可以通过不同颜色来区分。电泳检测电泳检测1/1/2023|Life Technologies 37 样本采集样本制备 /样本提取扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程片段分析的过程数据分析GeneMapper 3
20、.2/3.3GeneMapper ID-X1/1/2023|Life Technologies 38 数据分析数据分析1、片段分析（、片段分析（GeneScan）分子量内标（LIZ500）的作用：已知长度的片段作分子量标准，可以得到长度对迁移时间的标准曲线标准曲线。测定出未知样品的迁移时间，与标准曲线相比较后，计算出未知片段长度，这就是片段分析（GeneScan）。生成标准曲线，判定未知片段大小生成标准曲线，判定未知片段大小迁移时间迁移时间115.75未知片段未知片段片片段段长长度度75100t1t2t31391/1/2023|Life Technologies 39 数据分析数据分析2、基因
21、分型（、基因分型（Genotyping）样品峰与ladder比对，自动判定等位基因1/1/2023|Life Technologies 40 常见影响分析因素常见影响分析因素1/1/2023|Life Technologies 41 正常的正常的STRSTR图谱图谱1/1/2023|Life Technologies 42 理想的峰型理想的峰型具有良好分型的峰特征：尖锐光滑对称落在bin内，且被软件标注正确分型无肩膀峰或者分裂峰1/1/2023|Life Technologies 43 常见分析因素常见分析因素Stutter（影子峰/滑移峰/DNA聚合酶滑脱产物）Split peak（分裂峰）
22、or 加A不全（非模板依赖添加）Null Allele等位基因缺失/无效等位基因突变（三等位基因、亲权鉴定观察到的突变）微变异1/1/2023|Life Technologies 44 1、Stutter也叫影子带，或DNA聚合酶滑脱产物stutter1/1/2023|Life Technologies 45 Stutter产生机理产生机理机理：链滑脱错配机制，在引物延伸过程中，引物链或模板链滑脱，导致一个重复单位形成的碱基非配对环。模板DNA扩增产物扩增产物扩增产物扩增产物模板DNA模板DNA模板DNA1/1/2023|Life Technologies 46 Stutter特点特点Stut
23、ter峰比相应等位基因峰小一个重复单位，极少出现多一个重复单位的峰。Main peak-4bp stutter+4bp stutter1/1/2023|Life Technologies 47 是混合样品还是stutter？Stutter region9%(a)(b)100%100%Stutter 具有基因座特异性Stutter 具有试剂盒特异性Stutter对样本分析造成的困扰对样本分析造成的困扰1/1/2023|Life Technologies 48 Stutter产物的解决产物的解决主要通过改进Mix的配方来减少滑移峰采用标准反应体系及扩增程序使用适当量的DNA，Identifiler
24、推荐模板量0.5-1.0ng1/1/2023|Life Technologies 49 2、非模板添加，加、非模板添加，加A峰峰特点：比正常产物多一个A原理：所有的Taq酶本身都有加A效应AAAAA+A+A+A+A1/1/2023|Life Technologies 50 非模板添加，加非模板添加，加A峰产生的原因峰产生的原因加入模板DNA过多没有足够的时间给所有的产物都加A没有足够的酶量加A扩增的参数设置不正确延伸时间不充分酶少或者变质反应体系变化（减小或者改变）PCR仪有问题1/1/2023|Life Technologies 51 非模板添加，加非模板添加，加A峰对样本分析造成的困扰峰对
25、样本分析造成的困扰峰型变宽影响潜在的微变异的准确分型-A+A1/1/2023|Life Technologies 52 非模板添加非模板添加/加加A不全的解决不全的解决加加A方法方法全部转换成-A全部转换成+A引物进行修饰A引物带一段不同源的尾巴尾巴促使加A采用标准的扩增程序采用推荐的DNA量采用标准的反应体系引物引物A1/1/2023|Life Technologies 53 在DNA模板存在，但由于在PCR过程中的引物结合问题导致扩增失败的等位基因 AmelogeninD22S1045D2S4413、无效等位基因，、无效等位基因，Null Alleles1/1/2023|Life Tech
26、nologies 54 无效等位基因（无效等位基因（Null Alleles）产生的机理）产生的机理*8866 8Allele 6 amplicon has“dropped out”Imbalance in allele peak heightsHeterozygous alleles are well balanced引引物物区区突突变变1/1/2023|Life Technologies 55 杂合子“被”纯合子不同的PCR引物扩增相同样本，得到不同的结果影响DNA数据库的比对结果，出现假阴性结果或者相同来源的两个样本被错误排除。无效等位基无效等位基因对样本分析造成的困扰因对样本分析造成的
27、困扰1/1/2023|Life Technologies 56 无效等位基因（无效等位基因（Null Alleles）的解决）的解决降低Tm值扩增更换引物结合区设计兼并引物1/1/2023|Life Technologies 57 AMELD8S1179D21S11D18S51(B)TPOX(A)额外的染色体引物结合区点突变特殊峰型特殊峰型4、突变、突变三三等位基因等位基因1/1/2023|Life Technologies 58 4、突变、突变亲权鉴定观察的突变亲权鉴定观察的突变14,1815,1815,1714,1813,1715,17Paternal Mutation父亲母亲儿子STR基
28、因座等位基因的正常传递(No Mutation)常染色体STR突变率0.1-0.4%!1/1/2023|Life Technologies 59 5、微变异微变异“Off-Ladder”Alleles核心重复区并非完整的排列插入缺失微变异Allele命名：完整重复数.不完整重复单元的碱基数(Bar et al.Int.J.Legal Med.1994,107:159-160)Example:TH01 9.3 allele:TCAT4-CAT TCAT5Deletion of T1/1/2023|Life Technologies 60 确保精确分析确保精确分析“Off-Ladder”峰型“尖锐
29、”Ladder准确电泳成功1/1/2023|Life Technologies 61 28.11=S25-L25=244.34-244.46=-0.12 bp2=SOL-L28=257.51-256.64 =+0.87 bpc=|1-2|=|-0.12-0.87|=0.99 bp1/1/2023|Life Technologies 62 QuestionQuestion1/1/2023|Life Technologies 63 Legal 2010 Life Technologies Corporation.All rights reserved.The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective owners.For Research,Forensic or Paternity Use Only.Not for use in any animal or human therapeutic or diagnostic procedure.