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1、火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去 Marfey法与质谱联法与质谱联用技术及其应用用技术及其应用 火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去目目 录录前言前言LC/MS决定氨基酸绝对构型的原理决定氨基酸绝对构型的原理 1.Marfey 法分离机制的探讨法分离机制的探讨 2.Marfey法与质谱的联用法与质谱的联用 3.衍生化过程衍生化过程小小 结结应应 用用 举举 例例火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯
2、、湿被褥勇敢地冲出去前前 言言常见的确定化合物立体结构的方法有如下几常见的确定化合物立体结构的方法有如下几种：种：（1）化学转变法；）化学转变法；（2）旋光比较法；）旋光比较法；（3）旋光谱（）旋光谱（ORD）和圆二色光谱（）和圆二色光谱（CD）；）；（4）单晶）单晶X射线衍射法；射线衍射法；（5）核磁共振法；）核磁共振法；（6）Marfey法与质谱联用。法与质谱联用。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去 目前酶法和目前酶法和CD法已用于决定氨基酸的绝对法已用于决定氨基酸的绝对构型，但这些都是直接的方法，构型，但这些都是直
3、接的方法，确定一种对映确定一种对映异构体时需要相对大量的样品及较长的分析时间，异构体时需要相对大量的样品及较长的分析时间，因为在分析之前必须将每种氨基酸分离出来。因为在分析之前必须将每种氨基酸分离出来。另一方面，色谱方法例如另一方面，色谱方法例如GC和和HPLC已经已经代替这些直接方法广泛使用，氨基酸的绝对构型代替这些直接方法广泛使用，氨基酸的绝对构型是通过衍生化后，在非对映环境下比较对照品氨是通过衍生化后，在非对映环境下比较对照品氨基酸的保留时间来决定的，这些色谱学方法的优基酸的保留时间来决定的，这些色谱学方法的优点在于分析所用的样品用量少、节省时间，并且点在于分析所用的样品用量少、节省时间
4、，并且可以同时分析十种以上氨基酸。色谱学方法的缺可以同时分析十种以上氨基酸。色谱学方法的缺点在于需要对照品氨基酸，对于含有非常见氨基点在于需要对照品氨基酸，对于含有非常见氨基酸的肽类是不适用的。酸的肽类是不适用的。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去1984年，年，Marfey发明了一种用发明了一种用HPLC来决定氨基来决定氨基酸绝对构型的方法，该方法基于这样一个原理：酸绝对构型的方法，该方法基于这样一个原理：通过手性试剂进行衍生化，将通过手性试剂进行衍生化，将D-和和L-氨基酸用氨基酸用HPLC分离成对映异构体。分离成对
5、映异构体。于是引入手性试剂于是引入手性试剂FDAA（1-氟氟-2，4-二硝基二硝基苯基苯基-5）-L-丙氨酰胺，丙氨酰胺，(1-Fluoro-2，4-dinitrophenyl-5)-L-alaninamide ），被命名为），被命名为Marfey试剂。试剂。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去氨基酸与氨基酸与Marfey试剂反应所得衍生物用常用的试剂反应所得衍生物用常用的HPLC进行分离，并在进行分离，并在UV340 nm处进行检测。处进行检测。L-氨基酸衍生物常常先于对应的氨基酸衍生物常常先于对应的D-氨基酸衍生物氨基
6、酸衍生物从柱上洗脱下来，在梯度洗脱的条件下，该方法从柱上洗脱下来，在梯度洗脱的条件下，该方法能正确地确定氨基酸的绝对构型，并且具有很高能正确地确定氨基酸的绝对构型，并且具有很高的灵敏度。的灵敏度。因此，因此，Marfey法广泛用于肽类化合物的结构确法广泛用于肽类化合物的结构确证，证实肽类合成中的外消旋作用。证，证实肽类合成中的外消旋作用。但是，在没有标准品的情况下，将该方法用来分但是，在没有标准品的情况下，将该方法用来分析含非常见氨基酸的肽类还是很困难的。析含非常见氨基酸的肽类还是很困难的。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲
7、出去常见的Marfey试剂如下所示：L-FDAA:(1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺 L-FDVA:.-L-缬氨酰胺 L-FDPA:.-L-苯丙氨酰胺 L-FDIA:.-L-异亮氨酰胺 L-FDLA:.-L-亮氨酰胺 D-FDAA:.-D-丙氨酰胺火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去其结构如下：火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去 为了将为了将Marfey法与质谱联用的方法建立起法与质谱联用的方法建立起来，必须解决如下三个问题：来，必须解
8、决如下三个问题：（1）解释）解释Marfey法用作色谱技术的分离机制，法用作色谱技术的分离机制，及其局限。及其局限。（2）如何在没有标准品的情况下有效地将）如何在没有标准品的情况下有效地将Marfey法和质谱联系起来，来检测和确定目标法和质谱联系起来，来检测和确定目标氨基酸。氨基酸。（3）如何从一个肽类样品的）如何从一个肽类样品的L-或或D-氨基酸中获氨基酸中获得相应的对映异构体得相应的对映异构体火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去LC/MS 决决 定定 氨氨 基基 酸酸绝绝 对对 构构 型型 的的 原原 理理Marfey
9、 法分离机制的探讨法分离机制的探讨Marfey法与质谱的联用法与质谱的联用衍生化过程衍生化过程火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去Marfey 法分离机制的探讨法分离机制的探讨下图是用下图是用LC/MS来决定肽中氨基酸绝对构型的全来决定肽中氨基酸绝对构型的全过程，命名作过程，命名作“高级高级Marfey法法”火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去如图所示，肽水解所得氨基酸的混合物分成两部如图所示，肽水解所得氨基酸的混合物分成两部分（分（sample 1和
10、和sample 2)。Sample 1与与FDAA衍生化后，直接用衍生化后，直接用LC/MS分分析，通过衍生物的保留时间和质谱得以确定为何析，通过衍生物的保留时间和质谱得以确定为何种氨基酸，如果检测到有非常见氨基酸，其平面种氨基酸，如果检测到有非常见氨基酸，其平面结构可以通过其衍生物的质谱得以阐明。结构可以通过其衍生物的质谱得以阐明。Sample 2主要用来决定非常见氨基酸的绝对构主要用来决定非常见氨基酸的绝对构型。由于天然存在的肽类往往由型。由于天然存在的肽类往往由D-型或型或L-型氨基型氨基酸组成，在色谱图上，每个氨基酸给出一个峰，酸组成，在色谱图上，每个氨基酸给出一个峰，其绝对构型无法在
11、这一步决定。因此，为了得到其绝对构型无法在这一步决定。因此，为了得到其对映体，其对映体，Sample 2中的氨基酸必须在适当的中的氨基酸必须在适当的条件下进行外消旋化。但是，与条件下进行外消旋化。但是，与FDAA衍生化及衍生化及外消旋化后所得的色谱图变得复杂了，很难发现外消旋化后所得的色谱图变得复杂了，很难发现一对差向异构体。一对差向异构体。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去在该法中使用了质量色谱。每对差向异构体有在该法中使用了质量色谱。每对差向异构体有两个峰，在以目标氨基酸衍生物分子离子碎片两个峰，在以目标氨基酸衍生物
12、分子离子碎片的的m/z值为检测指标的质量色谱图上可以选择值为检测指标的质量色谱图上可以选择到这两个峰。到这两个峰。然后，通过比较然后，通过比较Sample 1中原峰的保留时间和中原峰的保留时间和Sample 2中新产生峰的保留时间，就可以根据中新产生峰的保留时间，就可以根据Marfey法中的洗脱规律来判定绝对构型了。法中的洗脱规律来判定绝对构型了。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去本法将可购得的氨基酸分为四类：中性本法将可购得的氨基酸分为四类：中性氨基酸、含氨基酸、含-OH和酸性氨基酸、碱性和和酸性氨基酸、碱性和N-甲基
13、氨基酸，在同样的条件下研究其甲基氨基酸，在同样的条件下研究其分离行为。分离行为。FDAA主要与氨基酸上未取代的氨基、主要与氨基酸上未取代的氨基、酚羟基、巯基包括酚羟基、巯基包括N-甲基反应。甲基反应。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去每种氨基酸的非对映每种氨基酸的非对映异构体对都是通过其异构体对都是通过其D-异构体的保留时间异构体的保留时间(tRD)和和L-异构体的保异构体的保留时间留时间(tRL)的差值的差值(t)来判定的。当来判定的。当t值大于值大于1.0时，每时，每组非对映异构体对完组非对映异构体对完全被分离为两个
14、非对全被分离为两个非对映异构体。映异构体。左边的表格显示了四左边的表格显示了四种氨基酸的两种异构种氨基酸的两种异构体保留时间及其差异。体保留时间及其差异。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去对中性氨基酸已经获得很好的判定，所有对中性氨基酸已经获得很好的判定，所有L-型非型非对映异构体都先于对映异构体都先于D-型被洗脱下来。随着烃基侧型被洗脱下来。随着烃基侧链增长，判定效率提高，保留时间也会更长（亚链增长，判定效率提高，保留时间也会更长（亚氨基酸和脯氨酸除外）。酪氨酸得到两衍生物，氨基酸和脯氨酸除外）。酪氨酸得到两衍生物，因
15、为因为FDAA会引入到会引入到NH2上，也会引入到酚上，也会引入到酚OH上。上。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去酸性或含酸性或含OH氨基酸的判定相对于中性氨基氨基酸的判定相对于中性氨基酸要难一些。因为其保留时间变短。侧链含有酸要难一些。因为其保留时间变短。侧链含有酰氨基的天冬酰胺、谷氨酰胺比天冬氨酸和谷酰氨基的天冬酰胺、谷氨酰胺比天冬氨酸和谷氨酸更难判定。在含氨酸更难判定。在含OH的氨基酸中，丝氨的氨基酸中，丝氨酸显示出最差的判定能力，但是高丝氨酸的判酸显示出最差的判定能力，但是高丝氨酸的判定稍好些，氧甲基丝氨酸显示了
16、与丙氨酸相似定稍好些，氧甲基丝氨酸显示了与丙氨酸相似的判定能力。另外，的判定能力。另外，-OH天冬氨酸的两个非天冬氨酸的两个非对映异构体显示相反的洗脱规律，而且它们的对映异构体显示相反的洗脱规律，而且它们的保留时间极短保留时间极短火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去对于碱性氨基酸，赖氨酸和鸟氨酸有三种衍生对于碱性氨基酸，赖氨酸和鸟氨酸有三种衍生物：单物：单-取代、单取代、单-取代和二取代衍生物；取代和二取代衍生物；组氨酸有两种衍生物，单组氨酸有两种衍生物，单-取代和双取代衍生取代和双取代衍生物。它们的单物。它们的单-取代和
17、双取代可被判定，而单取代和双取代可被判定，而单-取代衍生物无法判定，表明取代衍生物无法判定，表明-氨基的衍生氨基的衍生化对于判定是必要的。化对于判定是必要的。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去但是碱性氨基酸的洗脱规律取决于所选流动相但是碱性氨基酸的洗脱规律取决于所选流动相的的PH大小，可能为大小，可能为L D的常规顺序，也可的常规顺序，也可能相反。赖氨酸和组氨酸的双衍生物显示了正能相反。赖氨酸和组氨酸的双衍生物显示了正常的洗脱规律，而鸟氨酸却显示相反的顺序，常的洗脱规律，而鸟氨酸却显示相反的顺序，尽管它们有较长的保留时间
18、。尽管它们有较长的保留时间。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去购得的购得的N-甲基氨基酸，例如丙氨酸、苯丙氨酸、甲基氨基酸，例如丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和天冬氨酸的缬氨酸、亮氨酸和天冬氨酸的N-甲基衍生物，甲基衍生物，尽管其保留时间长于各母氨基酸，但其判定能尽管其保留时间长于各母氨基酸，但其判定能力要低于母氨基酸。尤其是力要低于母氨基酸。尤其是N-甲基丙氨酸无法甲基丙氨酸无法判定，判定，N-甲基天冬氨酸以相反顺序被洗脱出。甲基天冬氨酸以相反顺序被洗脱出。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断
19、，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去综上，综上，FDAA的的L-氨基酸衍生物并不总是氨基酸衍生物并不总是先于对应的先于对应的D-氨基酸衍生物被洗脱下来。氨基酸衍生物被洗脱下来。因此，阐明不了分离机制，因此，阐明不了分离机制，Marfey 法就法就不能用于非常见氨基酸的判定。不能用于非常见氨基酸的判定。此外，实验结果表明以下两点对于洗脱此外，实验结果表明以下两点对于洗脱顺序至关重要：顺序至关重要：氨基酸的疏水性；氨基酸的疏水性；在分离过程中在分离过程中FDAA衍生物的构象。衍生物的构象。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇
20、敢地冲出去使用使用UV（二极管阵列检测器）和（二极管阵列检测器）和NMR方法来方法来解决该问题（因为，它们易受构象的影响）解决该问题（因为，它们易受构象的影响）。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去如上图所示，在如上图所示，在340和和414nm处有特征性最大处有特征性最大吸收，是由二硝基苯上的硝基与氨基酸及吸收，是由二硝基苯上的硝基与氨基酸及L-丙氨酰胺的丙氨酰胺的NH2之间的氢键所形成的发色团之间的氢键所形成的发色团产生的；而且，产生的；而且，D-缬氨酸衍生物的缬氨酸衍生物的UV谱与其谱与其L-型衍生物的相符。所有被测
21、氨基酸的衍生型衍生物的相符。所有被测氨基酸的衍生物显示非常相似的物显示非常相似的UV谱，脯氨酸和谱，脯氨酸和N-甲基氨甲基氨基酸除外。尤其是给出相反洗脱顺序的双取基酸除外。尤其是给出相反洗脱顺序的双取代衍生物及代衍生物及D-和和L-鸟氨酸显示了特征的鸟氨酸显示了特征的UV谱，谱，其吸收波长从其吸收波长从340nm蓝移到蓝移到320nm。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去这些结果表明，稳定的构象，包括分子内氢这些结果表明，稳定的构象，包括分子内氢键，形成了一个像蒽一样的三环系统的平面键，形成了一个像蒽一样的三环系统的平面分
22、子（如下图所示）。分子（如下图所示）。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去综上，对于综上，对于L-和和D-氨基酸衍生物的判定基于其氨基酸衍生物的判定基于其疏水性的差异，源于氨基酸和疏水性的差异，源于氨基酸和L-丙氨酰胺丙氨酰胺碳上两个疏水性取代基的顺反位置。于是，碳上两个疏水性取代基的顺反位置。于是，顺式排列的顺式排列的FDAA衍生物与衍生物与ODS作用更强烈，作用更强烈，比反式排列的衍生物有更长的保留时间。比反式排列的衍生物有更长的保留时间。对于大多数氨基酸来说，由于氨基酸侧链取代对于大多数氨基酸来说，由于氨基酸侧链取代
23、基的疏水性往往小于基的疏水性往往小于COOH，D-氨基酸衍生氨基酸衍生物具有顺式结构，因此在物具有顺式结构，因此在Marfey 法中法中L-氨基酸氨基酸衍生物往往先于衍生物往往先于D-氨基酸衍生物出柱。氨基酸衍生物出柱。另有文献证明，氢键的形成对结构的判定也是另有文献证明，氢键的形成对结构的判定也是很有用的。很有用的。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去L-缬氨酸的缬氨酸的FDAA衍生物的衍生物的NOE实验显示，缬实验显示，缬氨酸的氨酸的-质子及质子及L-丙氨酰胺的丙氨酰胺的-质子与苯环的质子与苯环的H6之间存在着强烈的之
24、间存在着强烈的NOE，如上图所示；，如上图所示；而而H6与缬氨酸的异丙基和与缬氨酸的异丙基和L-丙氨酰胺的甲基丙氨酰胺的甲基之间没有之间没有NOE。另外，。另外，D-缬氨酸的缬氨酸的FDAA衍生衍生物与物与L-衍生物几乎显示相同的衍生物几乎显示相同的NMR行为。这些行为。这些结果表明，两结果表明，两-质子都在空间上位于苯环质子都在空间上位于苯环H6的附近，在的附近，在L-和和D-缬氨酸衍生物中均如此。缬氨酸衍生物中均如此。由此，缬氨酸和丙氨酰胺的除由此，缬氨酸和丙氨酰胺的除NH2以外的其以外的其它取代基均位于垂直于二硝基苯平面的位置上，它取代基均位于垂直于二硝基苯平面的位置上，在溶液中是稳定的
25、，也是占优势的。在溶液中是稳定的，也是占优势的。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去如图所示：如图所示：D-缬氨酸的缬氨酸的FDAA衍生物为顺衍生物为顺（Z）式排列，两个疏水性取代基在同侧；）式排列，两个疏水性取代基在同侧；L-缬氨酸的缬氨酸的FDAA衍生物为反（衍生物为反（E）式排列，）式排列，两个疏水性基团在异侧。两个疏水性基团在异侧。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去为了确定为了确定COOH是否对结构的判定必不可少，是否对结构的判定必不可少，文
26、章对氨基酸甲酯和脱文章对氨基酸甲酯和脱COOH的氨基化合物的氨基化合物的的FDAA衍生物进行了研究。衍生物进行了研究。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去所测氨基酸甲酯及氨基化合物的判定结果如上所测氨基酸甲酯及氨基化合物的判定结果如上表所示，它们的表所示，它们的UV谱与母氨基酸的完全相同，谱与母氨基酸的完全相同，保留时间比母氨基酸长，氨基酸甲酯的判定能保留时间比母氨基酸长，氨基酸甲酯的判定能力下降。力下降。另外，丙氨酸甲酯的另外，丙氨酸甲酯的FDAA衍生物未得判定，衍生物未得判定，丝氨酸甲酯衍生物显示相反的洗脱顺序。丝氨酸
27、甲酯衍生物显示相反的洗脱顺序。氨基化合物的保留时间和判定能力几乎与其母氨基化合物的保留时间和判定能力几乎与其母氨基酸相同。氨基酸相同。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去结果表明，结果表明，COOH对于氨基酸的判定并不对于氨基酸的判定并不总是必须的。前已述，与中性氨基酸相比，酸总是必须的。前已述，与中性氨基酸相比，酸性和含性和含OH氨基酸及氨基酸甲酯的判定能力氨基酸及氨基酸甲酯的判定能力差，尤其是差，尤其是-OH天冬氨酸、丝氨酸甲酯天冬氨酸、丝氨酸甲酯,给出给出了相反的洗脱顺序（了相反的洗脱顺序（D L）。这些数据进一）。
28、这些数据进一步证实一个氨基酸的步证实一个氨基酸的FDAA衍生物在氨基酸和衍生物在氨基酸和L-丙氨酰胺部分有两个处于反式的疏水性取代丙氨酰胺部分有两个处于反式的疏水性取代基，要比其相应的顺式氨基酸衍生物先流出反基，要比其相应的顺式氨基酸衍生物先流出反相柱。相柱。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去以上结果也可如下证实，考察用以上结果也可如下证实，考察用FDPA、FDVA、FDIA、FDLA和和D-FDAA的氨基酸衍的氨基酸衍生物的分离行为，如下表所示：生物的分离行为，如下表所示：火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财
29、物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去如所预期，随着烃基侧链增长，其保留时间也如所预期，随着烃基侧链增长，其保留时间也增长，判定能力也增强；而增长，判定能力也增强；而D-FDAA的氨基酸的氨基酸衍生物则显示了相反的洗脱顺序。衍生物则显示了相反的洗脱顺序。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去本机理有一缺陷，即明确地评价两个功能基本机理有一缺陷，即明确地评价两个功能基团的疏水性是有困难的，可以考虑用氨基酸团的疏水性是有困难的，可以考虑用氨基酸衍生物保留时间的顺序来解释洗脱顺序。因衍生物保留时间的顺序来解
30、释洗脱顺序。因为在氨基酸中为在氨基酸中COOH是一个常见的功能基是一个常见的功能基团，而一个氨基酸的团，而一个氨基酸的FDAA衍生物的疏水性也衍生物的疏水性也决定于该氨基酸的侧链，因此，决定于该氨基酸的侧链，因此，DL-氨基酸的氨基酸的tR和洗脱顺序间的关系已如和洗脱顺序间的关系已如Table1所示。所示。如如Figure4所示，具有常规洗脱顺序（所示，具有常规洗脱顺序（L D）的）的D-和和L-氨基酸衍生物的氨基酸衍生物的tR要比侧链疏水要比侧链疏水性与性与COOH相当的氨基酸衍生物的长，例相当的氨基酸衍生物的长，例如丝氨酸和天冬氨酸。如丝氨酸和天冬氨酸。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而
31、出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去另一方面，具有相反洗脱顺序的氨基酸衍生另一方面，具有相反洗脱顺序的氨基酸衍生物具有相对较短的平均保留时间。物具有相对较短的平均保留时间。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去于是，目标氨基酸的洗脱顺序可以用于是，目标氨基酸的洗脱顺序可以用L-和和D-氨氨基酸衍生物的平均保留时间进行解释。基酸衍生物的平均保留时间进行解释。DL-丝丝氨酸和天冬酰胺衍生物可被看作临界样品，它氨酸和天冬酰胺衍生物可被看作临界样品，它们的平均保留时间位于洗脱顺序的临界点上。们的平
32、均保留时间位于洗脱顺序的临界点上。然而，鸟氨酸的二取代衍生物表现出非常有趣然而，鸟氨酸的二取代衍生物表现出非常有趣的分离行为，它们的洗脱顺序是相反的，尽管的分离行为，它们的洗脱顺序是相反的，尽管它们有相对较长的保留时间（它们有相对较长的保留时间（27.3min），如），如Figure4所示。对这种分离行为的研究正在进所示。对这种分离行为的研究正在进行之中。行之中。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去至此，第一个问题已基本得到解决。至此，第一个问题已基本得到解决。由于氨基酸与由于氨基酸与L-FDAA所得衍生物的热不稳定所得衍
33、生物的热不稳定性和低疏水性，致使它们对性和低疏水性，致使它们对LC/MS分析的敏分析的敏感性很差。于是，选择电喷雾离子化和感性很差。于是，选择电喷雾离子化和frit-FAB作为接口，并发展用作为接口，并发展用(1-氟氟-2，4-二硝基二硝基苯基苯基-5)-L-亮氨酰胺，即亮氨酰胺，即L-FDLA取代取代FDAA:(1-氟氟-2，4-二硝基苯基二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺，作为丙氨酰胺，作为衍生化试剂，以便将衍生化试剂，以便将Marfey法和质谱联系起法和质谱联系起来。来。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去Marfey法
34、与质谱的联用法与质谱的联用在在Marfey法中，氨基酸的法中，氨基酸的L-FDAA衍生物由常衍生物由常规的反相规的反相HPLC分离并在分离并在UV340nm处检测；在处检测；在本法中，本法中，UV检测器被换成质谱仪，即氨基酸衍检测器被换成质谱仪，即氨基酸衍生物经生物经LC/MS分析。分析。为了顺利地将传统的为了顺利地将传统的HPLC条件改为适合条件改为适合LC/MS分析的分析的LC条件，必须解决如下两个问题：条件，必须解决如下两个问题：火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去（1）将从将从HPLC洗脱出来的液体注入质谱仪时，洗
35、脱出来的液体注入质谱仪时，其体积应大大减小，因为其体积应大大减小，因为ESI和和frit-FAB是最终是最终被作为一种接口来使用的。被作为一种接口来使用的。（2）HPLC流动相中的非挥发性缓冲液应用挥发流动相中的非挥发性缓冲液应用挥发性缓冲液代替。性缓冲液代替。解决方法：解决方法：（1）应用半微量柱（）应用半微量柱（1502.1mm I.d,），本法），本法用该柱给予用该柱给予L-和和D-氨基酸衍生物以足够的分离氨基酸衍生物以足够的分离度。若为度。若为frit-FAB LC/MS 溶液流速应进一步减溶液流速应进一步减小至小至5l/min。（2）使用使用TFA或醋酸铵缓冲液（或醋酸铵缓冲液（PH
36、3）作为流）作为流动相，与使用磷酸缓冲溶剂系统有几乎相同的动相，与使用磷酸缓冲溶剂系统有几乎相同的分离度。分离度。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去尝试了尝试了4种用于分析氨基酸种用于分析氨基酸L-FDAA衍生物的衍生物的LC/MS接口，即接口，即ESI、大气压化学离子化、大气压化学离子化（APCI）、）、TSP、和、和frit-FAB。极性氨基酸衍。极性氨基酸衍生物不能用生物不能用TSP和和APCI作为接口。作为接口。尽管任何氨基酸都可以用尽管任何氨基酸都可以用ESI和和frit-FAB接口，接口，但它们的灵敏度特别低
37、，这可能是由于氨基酸但它们的灵敏度特别低，这可能是由于氨基酸的的L-FDAA衍生物的热不稳定性和低疏水性造衍生物的热不稳定性和低疏水性造成的，表明需要制备一种高疏水性的衍生化试成的，表明需要制备一种高疏水性的衍生化试剂。此外，剂。此外，ESI和和frit-FAB被选作接口，还因被选作接口，还因为使用这种接口可以抑制温度诱导效应。为使用这种接口可以抑制温度诱导效应。在在FAB-MS中，疏水性越强的化合物其分离效中，疏水性越强的化合物其分离效果越好。果越好。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去衍生化过程衍生化过程引入了一个外消
38、旋化程序，使用引入了一个外消旋化程序，使用DL-FDLA代替代替传统的化学外消旋化，以得到传统的化学外消旋化，以得到L-或或D-氨基酸相氨基酸相应的对映异构体。应的对映异构体。为了获得满足以下条件的衍生化试剂：为了获得满足以下条件的衍生化试剂：（1）可获得更高疏水性的氨基酸衍生物；）可获得更高疏水性的氨基酸衍生物；（2）不减少以前）不减少以前L-FDAA衍生物的特征衍生物的特征UV吸收；吸收；（3）符合通常所言的分离机制。）符合通常所言的分离机制。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去尝试了尝试了4种衍生化试剂种衍生化试剂L
39、-FDVA、L-FDPA、L-FDIA和和L-FDLA，具体数据如，具体数据如Table1所示：所示：（1）被测衍生化试剂的保留时间要比）被测衍生化试剂的保留时间要比L-FDAA长；长；（2）L-FDLA M+H+的离子丰度最高，约为的离子丰度最高，约为L-FDAA的的30倍。倍。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去由由 Table2可知，可知，L-FDLA的分离效果的分离效果要强于要强于L-FDAA由由Table1、Table2得，得，L-FDLA是用是用于于LC/MS分析的最分析的最有效的衍生化试剂。有效的衍生化试剂。
40、火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去为了确证为了确证L-FDLA的实用性，的实用性，L-FDLA的氨基的氨基酸衍生物使用以酸衍生物使用以frit-FAB 或或ESI作为接口的作为接口的LC/MS进行分析。为了比较氨基酸的进行分析。为了比较氨基酸的L-FDAA衍生物和衍生物和L-FDLA衍生物在相同条件下的电离衍生物在相同条件下的电离情况，两种衍生物的等量混合物进行情况，两种衍生物的等量混合物进行LC/MS分分析。如析。如Ffigure1所示所示火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹
41、上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去DL-丙氨酸的丙氨酸的L-FDAA和和L-FDLA衍生物的衍生物的M+H+阳离子质量色谱，其整体质谱使用阳离子质量色谱，其整体质谱使用frit-FAB 作为接口。作为接口。L-FDLA衍生物的灵敏度衍生物的灵敏度比比L-FDAA衍生物的提高了三倍，这种趋势适衍生物的提高了三倍，这种趋势适合于任何常见氨基酸。合于任何常见氨基酸。对于对于ESI LC/MS，不管采用阳离子还是阴离，不管采用阳离子还是阴离子模式，灵敏度都提高子模式，灵敏度都提高24倍。倍。由上可知，由上可知，L-FDLA不仅适用于不仅适用于HPLC分析，分析，也适用于也适用于LC/MS分析。分析。使用使用
42、frit-FAB 和和ESI LC/MS的检测限分别为的检测限分别为10和和5pmol。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去通常，天然存在的氨基酸都是由通常，天然存在的氨基酸都是由D-或或L-构构型的氨基酸组成的，每种氨基酸只能在色型的氨基酸组成的，每种氨基酸只能在色谱图上显示一个峰谱图上显示一个峰,绝对构型不能通过其绝对构型不能通过其他方法来解决。因此，为了从他方法来解决。因此，为了从D/L氨基酸氨基酸获得一对对映体，进行外消旋化是很有必获得一对对映体，进行外消旋化是很有必要的。要的。最初使用的外消旋化方法为：最初使用的
43、外消旋化方法为：水解产物水解产物+醋酐醋酐+三乙胺三乙胺 唑酮中间体唑酮中间体 外消旋化的外消旋化的N-乙酰基氨基酸乙酰基氨基酸 水解水解 目标产目标产物物火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去优点：对于肽中少数氨基酸来说是简单可行的。优点：对于肽中少数氨基酸来说是简单可行的。缺点：缺点：耗时；耗时；难于终止外消旋化作用；难于终止外消旋化作用；当氨基酸中含两个不对称碳原子（如苏氨酸、当氨基酸中含两个不对称碳原子（如苏氨酸、亮氨酸）时，就不能给出对映异构体的混合物，亮氨酸）时，就不能给出对映异构体的混合物，而是非对映体的混合物
44、。而是非对映体的混合物。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去如上图所示，如上图所示，D-氨基酸的氨基酸的L-FDLA衍生物（衍生物（DL型）和型）和L-氨基酸的氨基酸的L-FDLA（LL型）衍型）衍生物是非对映异构体，在色谱图上给出不同的生物是非对映异构体，在色谱图上给出不同的保留时间；保留时间；另一方面，另一方面，LD和和DL型、型、DD和和LL型型是对映异构体，每一对都显示相同的保留时间，是对映异构体，每一对都显示相同的保留时间，即某氨基酸的即某氨基酸的D-FDLA衍生物与该氨基酸的对衍生物与该氨基酸的对映异构体的映异
45、构体的L-FDLA衍生物有相同的保留时间。衍生物有相同的保留时间。据此，有望以据此，有望以D-和和L-FDLA的等量混合物代替的等量混合物代替只以只以L-FDLA做衍生化试剂，来得到前述的外做衍生化试剂，来得到前述的外消旋化作用。消旋化作用。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去上图还表明，用上图还表明，用D/L-FDLA进行衍生化是可行进行衍生化是可行的，该方法用于含两个不对称碳原子的氨基酸的，该方法用于含两个不对称碳原子的氨基酸时，所得两个峰对应于原氨基酸和其对映异构时，所得两个峰对应于原氨基酸和其对映异构体的体的L-F
46、DLA衍生物。衍生物。此外，化学外消旋化和此外，化学外消旋化和D/L-FDLA衍生化相结衍生化相结合用于含两个不对称碳原子的氨基酸时，可能合用于含两个不对称碳原子的氨基酸时，可能在在HPLC谱中产生四个异构体峰。谱中产生四个异构体峰。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去小小 结结 至此，LC/MS联用的三个问题已得到解决：问题一：采用什么色谱技术来分离氨基酸。我们采用Marfey法作为色谱技术。问题二：怎样有效地将Marfey法与质谱联系起来。我们采用ESI和Frit-FAB作为接口。问题三：怎样能得到D-或L-氨基酸的对
47、映体。使用了用来衍生化的L-FDLA和用来外消旋化的D/L-FDLA代替FDAA。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去这样就建立了一个运用这样就建立了一个运用LC/MS，称作，称作“advanced Marfeys method”的非经验性方的非经验性方法，该法有三部分组成：法，该法有三部分组成：用于分离氨基酸的色谱技术：用于分离氨基酸的色谱技术：Marfey法；法；通过质谱方法检验氨基酸；通过质谱方法检验氨基酸；从从L-或或D-氨基酸得到相应的对映异构体的过氨基酸得到相应的对映异构体的过程。程。本法的突出优点是：本法的突
48、出优点是：可以在没有标准品的情况下确定绝对构型；可以在没有标准品的情况下确定绝对构型；可以同时分析肽链中的任何氨基酸。可以同时分析肽链中的任何氨基酸。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去应应 用用 举举 例例该法已经成功运用于肽链中氨基酸的结构确定。该法已经成功运用于肽链中氨基酸的结构确定。还用于研究伯胺类化合物、仲醇类化合物和含噻还用于研究伯胺类化合物、仲醇类化合物和含噻唑环的氨基酸等的绝对构型。唑环的氨基酸等的绝对构型。下面简要介绍一下运用该法对藻青菌下面简要介绍一下运用该法对藻青菌（cyanobacteria）所产生
49、的）所产生的microcystin LR中中的氨基酸的结构研究。的氨基酸的结构研究。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去Microcystin LR是一种毒性环肽，由七个氨基酸是一种毒性环肽，由七个氨基酸片段组成，其中片段组成，其中-甲基天冬氨酸（甲基天冬氨酸（-MeAsp）分子中有两个不对称中心。如下图分子中有两个不对称中心。如下图火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去Microcystin LR的水解产物被分成两部分，一的水解产物被分成两部分，一部分
50、与部分与L-FDLA进行衍生化，另一部分与进行衍生化，另一部分与D/L-FDLA进行衍生化，衍生物先经过进行衍生化，衍生物先经过HPLC的二的二极管阵列检测器检测其极管阵列检测器检测其UV谱，然后以阴离子谱，然后以阴离子模式进行模式进行ESI LC/MS分析。分析。火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂拥而出或留恋财物，要当机立断，披上浸湿的衣服或裹上湿毛毯、湿被褥勇敢地冲出去如如Figure5a所示为谷氨酸、所示为谷氨酸、-甲基天冬氨酸（甲基天冬氨酸（-MeAsp）、丙氨酸和亮氨酸的）、丙氨酸和亮氨酸的L-FDLA衍生衍生物以物以M-H值监测的质量色谱图，其中精氨值监测的质量色谱图，其中精氨酸的酸