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1、基因诊断技术基基因因诊诊断断(gene diagnosis)是利利用用分分子子生生物物学学及及分分子子遗遗传传的的技技术术和和原原理理，在在DNA水水平平分分析析基基因因的的存存在在、鉴鉴定定疾疾病病所所涉涉及及基基因因的的置置换换、缺缺失失或或插插入入等等突突变变，以以诊诊断断各各种种感感染染性性疾疾病病和和遗遗传传性性疾疾病病，进进行行肿肿瘤分子水平的研究。瘤分子水平的研究。主要技术及过程主要技术及过程区分或鉴定区分或鉴定DNADNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNADNA片断片断基因探针的制备和标记基因探针的制备和标记n n基因诊断的特点基因诊断的特点基因诊断的特点基因诊
2、断的特点:n n高度的特异性高度的特异性高度的特异性高度的特异性n n高度的灵敏性高度的灵敏性高度的灵敏性高度的灵敏性n n实现早期快速诊断实现早期快速诊断实现早期快速诊断实现早期快速诊断n n被检测基因不一定活化，可检测表达差异基因。被检测基因不一定活化，可检测表达差异基因。被检测基因不一定活化，可检测表达差异基因。被检测基因不一定活化，可检测表达差异基因。n n基本技术：基本技术：基本技术：基本技术：n n（一）核酸分子杂交（一）核酸分子杂交（一）核酸分子杂交（一）核酸分子杂交n n（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应（PCRPCR）n n（三）单链构象
3、多态性检测（三）单链构象多态性检测（三）单链构象多态性检测（三）单链构象多态性检测n n（四）限制酶酶谱分析（四）限制酶酶谱分析（四）限制酶酶谱分析（四）限制酶酶谱分析n n（五）（五）（五）（五）DNADNA序列测定序列测定序列测定序列测定n n（六）（六）（六）（六）DNADNA芯片技术芯片技术芯片技术芯片技术第一节第一节 核酸的分离与纯化核酸的分离与纯化n n意义：实验的第一步工作，实验结果的基本保障意义：实验的第一步工作，实验结果的基本保障意义：实验的第一步工作，实验结果的基本保障意义：实验的第一步工作，实验结果的基本保障n n原则：原则：原则：原则：n n保证一级结构的完整性保证一级
4、结构的完整性保证一级结构的完整性保证一级结构的完整性n n排除其它大分子的污染排除其它大分子的污染排除其它大分子的污染排除其它大分子的污染要求：要求：1.不能存在对核酸结构功能有影响的物质不能存在对核酸结构功能有影响的物质2.降低蛋白、多糖、脂类分子污染降低蛋白、多糖、脂类分子污染一、首先了解核酸的存在状态及分布：一、首先了解核酸的存在状态及分布：形状：真核生物染色形状：真核生物染色形状：真核生物染色形状：真核生物染色体体体体DNADNA是双链线状，是双链线状，是双链线状，是双链线状，其细胞器其细胞器其细胞器其细胞器DNADNA以及原以及原以及原以及原核生物核生物核生物核生物DNADNA，质粒
5、，质粒，质粒，质粒DNADNA等都是双链环状。等都是双链环状。等都是双链环状。等都是双链环状。多数生物体的多数生物体的RNA分子是单链线状。而且，分子是单链线状。而且，不同类型的不同类型的RNA还有不同的结构特点。如还有不同的结构特点。如真核生物真核生物mRNA多数有多数有PolyA尾巴。至于尾巴。至于病毒、类病毒所含的病毒、类病毒所含的DNA和和RNA分子则形分子则形式多样，有双链线状、双链环状、单链线式多样，有双链线状、双链环状、单链线状、单链环状等。无论状、单链环状等。无论DNA还是还是RNA，在，在体内都形成一定的高级结构。体内都形成一定的高级结构。分布：分布：分布：分布：真核生物的真
6、核生物的真核生物的真核生物的DNADNA主要存在于细胞核中，只有约主要存在于细胞核中，只有约主要存在于细胞核中，只有约主要存在于细胞核中，只有约5%5%在线粒体、叶绿体等细胞器中。在线粒体、叶绿体等细胞器中。在线粒体、叶绿体等细胞器中。在线粒体、叶绿体等细胞器中。RNARNA则则则则75%75%左右存在于细胞质中，约左右存在于细胞质中，约左右存在于细胞质中，约左右存在于细胞质中，约15%15%在细胞器在细胞器在细胞器在细胞器中，约中，约中，约中，约10%10%在核中。原核生物在核中。原核生物在核中。原核生物在核中。原核生物DNADNA集中在核集中在核集中在核集中在核质区，质区，质区，质区，RN
7、ARNA分散在细胞质里。细胞质各种分散在细胞质里。细胞质各种分散在细胞质里。细胞质各种分散在细胞质里。细胞质各种RNARNA中，以中，以中，以中，以rRNArRNA的数量最多（约占的数量最多（约占的数量最多（约占的数量最多（约占5%5%），），），），tRNAtRNA其次（其次（其次（其次（15-20%15-20%），），），），mRNAmRNA最少（最少（最少（最少（1-1-5%5%）。）。）。）。油菜叶片总油菜叶片总油菜叶片总油菜叶片总RNARNA的非变性电泳（的非变性电泳（的非变性电泳（的非变性电泳（A A）和甲醛变性电泳（）和甲醛变性电泳（）和甲醛变性电泳（）和甲醛变性电泳（B B）结
8、果）结果）结果）结果二分离纯化核酸时的注意事项二分离纯化核酸时的注意事项 要得到具有生物活性的核酸大分子，要得到具有生物活性的核酸大分子，在分离时必须避免核酸变性，并尽可能保在分离时必须避免核酸变性，并尽可能保持分子的完整性，避免降解。因此，要注持分子的完整性，避免降解。因此，要注意下列事项：意下列事项：.尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少变性降解的机会。减少变性降解的机会。n n.减少化学因素对核酸的降解减少化学因素对核酸的降解减少化学因素对核酸的降解减少化学因素对核酸的降解，避免酸碱对核酸的磷酸二脂键的破，避免酸碱对核酸的磷酸二脂键的破坏坏3 3 ,5
9、,5 -磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键温度：温度：最适温度最适温度 防止机械剪切力的作用：防止机械剪切力的作用：基因组基因组DNA：分子细长，容易受到机械剪切：分子细长，容易受到机械剪切力的作用而断裂，所以机械剪切作用是分离力的作用而断裂，所以机械剪切作用是分离DNA时的主要危险。时的主要危险。.减少物理因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解操作时动作必须轻缓，搅拌时要操作时动作必须轻缓，搅拌时要操作时动作必须轻缓，搅拌时要操作时动作必须轻缓，搅拌时要温和，温和，温和，温和，避免让避免让避免让避免让DNADNA溶液通过狭窄的溶液通过狭
10、窄的溶液通过狭窄的溶液通过狭窄的孔道孔道孔道孔道。在提取缓冲液中加入蔗糖或山。在提取缓冲液中加入蔗糖或山。在提取缓冲液中加入蔗糖或山。在提取缓冲液中加入蔗糖或山梨糖醇等增加溶液的渗透压。梨糖醇等增加溶液的渗透压。梨糖醇等增加溶液的渗透压。梨糖醇等增加溶液的渗透压。提取分子量较小，结构又很紧提取分子量较小，结构又很紧提取分子量较小，结构又很紧提取分子量较小，结构又很紧密的密的密的密的DNADNA，如小的细菌质粒，如小的细菌质粒，如小的细菌质粒，如小的细菌质粒超螺旋超螺旋超螺旋超螺旋DNADNA等时，机械剪切等时，机械剪切等时，机械剪切等时，机械剪切力的威胁较小，操作时可不必力的威胁较小，操作时可
11、不必力的威胁较小，操作时可不必力的威胁较小，操作时可不必过于谨慎过于谨慎过于谨慎过于谨慎 核酸酶直接破坏核酸一级结构，必须抑制其活性核酸酶直接破坏核酸一级结构，必须抑制其活性对于对于DNA酶：酶：大多数大多数DNA酶作用时需要二价金属离子，如酶作用时需要二价金属离子，如Ca2+,Mg2+等。因此只要加入等。因此只要加入EDTA（乙二胺（乙二胺四乙酸），螯合剂就可以基本上抑制四乙酸），螯合剂就可以基本上抑制DNA酶的酶的活力。活力。.防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解无所不在的无所不在的无所不在的无所不在的RNARNA酶：酶：酶：酶：外源性外源性外源性外源性
12、RNARNA酶：酶：酶：酶：RNARNA制备过程中用到的玻璃和塑料制制备过程中用到的玻璃和塑料制制备过程中用到的玻璃和塑料制制备过程中用到的玻璃和塑料制品、研究人员本身尤其是研究人员的手，以及分离过程中品、研究人员本身尤其是研究人员的手，以及分离过程中品、研究人员本身尤其是研究人员的手，以及分离过程中品、研究人员本身尤其是研究人员的手，以及分离过程中用到的试剂和溶液。用到的试剂和溶液。用到的试剂和溶液。用到的试剂和溶液。内源性内源性内源性内源性RNARNA酶：组织本身所固有的，在某些组织中（如胰酶：组织本身所固有的，在某些组织中（如胰酶：组织本身所固有的，在某些组织中（如胰酶：组织本身所固有的
13、，在某些组织中（如胰腺），或者在其特定的生理状态（如快速发育期间）下的腺），或者在其特定的生理状态（如快速发育期间）下的腺），或者在其特定的生理状态（如快速发育期间）下的腺），或者在其特定的生理状态（如快速发育期间）下的含量很高。而且一当细胞破碎后即释放出来。含量很高。而且一当细胞破碎后即释放出来。含量很高。而且一当细胞破碎后即释放出来。含量很高。而且一当细胞破碎后即释放出来。对于对于对于对于RNARNA酶：酶：酶：酶：其具有高稳定性，抗酸抗碱，具很广的其具有高稳定性，抗酸抗碱，具很广的其具有高稳定性，抗酸抗碱，具很广的其具有高稳定性，抗酸抗碱，具很广的pHpH作用范围，抗作用范围，抗作用范围
14、，抗作用范围，抗高温严寒（高温严寒（高温严寒（高温严寒（065065均具有活性）。而该酶作用时不需要均具有活性）。而该酶作用时不需要均具有活性）。而该酶作用时不需要均具有活性）。而该酶作用时不需要二价金属离子，故用螯合剂无法抑制其活力。二价金属离子，故用螯合剂无法抑制其活力。二价金属离子，故用螯合剂无法抑制其活力。二价金属离子，故用螯合剂无法抑制其活力。三核酸的分离提取三核酸的分离提取 大致步骤：大致步骤：.收集细胞收集细胞收集细胞收集细胞.破碎裂解细胞（或细胞器）裂解细胞（或细胞器）.解聚核蛋白并去除蛋白质解聚核蛋白并去除蛋白质解聚核蛋白并去除蛋白质解聚核蛋白并去除蛋白质.沉淀核酸并去除其他
15、杂质（纯化）。沉淀核酸并去除其他杂质（纯化）。沉淀核酸并去除其他杂质（纯化）。沉淀核酸并去除其他杂质（纯化）。（一）破碎细胞（一）破碎细胞（一）破碎细胞（一）破碎细胞1机械破碎法机械破碎法 通过机械运动所产生的剪切力的作用使细通过机械运动所产生的剪切力的作用使细胞破碎的方胞破碎的方 法，称为机械破碎法。法，称为机械破碎法。2 2物理破碎法物理破碎法物理破碎法物理破碎法 通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用织细
16、胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。于微生物细胞的破碎。于微生物细胞的破碎。于微生物细胞的破碎。常用的物理破碎方法有：常用的物理破碎方法有：常用的物理破碎方法有：常用的物理破碎方法有：温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞由于热温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞由于热温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞由于热温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞由于热胀胀胀胀 冷缩的作用而破碎。冷缩的作用而破碎。冷缩的作用而破碎。冷缩的作用而破碎。该法简单易行，但效率不高，需反复几
17、次才能达到预该法简单易行，但效率不高，需反复几次才能达到预该法简单易行，但效率不高，需反复几次才能达到预该法简单易行，但效率不高，需反复几次才能达到预 期的效果。期的效果。期的效果。期的效果。压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎。压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎。压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎。压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压及渗透压变化等方法。常用的有高压冲击、突然降压及渗透压变化等方法。常用的有高压冲击、突然降压及渗透压变化等方法。常用的有高压冲击、突然降压及渗透压变化等方法。如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。如红
18、血球在纯水中会发生破壁溶血现象。如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。超声波法：超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手超声波法：超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手超声波法：超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手超声波法：超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手 段，且一次处理的量较大。该方法的主要缺陷是超声段，且一次处理的量较大。该方法的主要缺陷是超声段，且一次处理的量较大。该方法的主要缺陷是超声段，且一次处理的量较大。该方法的主要缺陷是超声 空穴局部过热引起的生物大分子的变性，所以超声振空穴局部过热引起的生物大分子的变性，所以超声振空穴局部过热引起的生物大分子的变
19、性，所以超声振空穴局部过热引起的生物大分子的变性，所以超声振 荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处 理，尽量减小热效应引起的酶的失活。理，尽量减小热效应引起的酶的失活。理，尽量减小热效应引起的酶的失活。理，尽量减小热效应引起的酶的失活。.化学破碎法化学破碎法化学破碎法化学破碎法 通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方 法
20、，称为化学破碎法。常用的化学试剂有甲苯、丙法，称为化学破碎法。常用的化学试剂有甲苯、丙法，称为化学破碎法。常用的化学试剂有甲苯、丙法，称为化学破碎法。常用的化学试剂有甲苯、丙 酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和TritonTriton，TweenTween等表等表等表等表 面活性剂。面活性剂。面活性剂。面活性剂。.酶促破碎法酶促破碎法酶促破碎法酶促破碎法 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催
21、化作用，使细 胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的目的。胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的目的。胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的目的。胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的目的。（二）核蛋白的解聚和蛋白质的去除（二）核蛋白的解聚和蛋白质的去除（二）核蛋白的解聚和蛋白质的去除（二）核蛋白的解聚和蛋白质的去除 1酚抽提法酚抽提法 酚和氯仿是蛋白质变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水酚和氯仿是蛋白质变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水酚和氯仿是蛋白质变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水酚和氯仿是蛋白质变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质充分接触氯仿和苯酚而变性，溶液一起振
22、摇时形成乳状液，蛋白质充分接触氯仿和苯酚而变性，溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质充分接触氯仿和苯酚而变性，溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质充分接触氯仿和苯酚而变性，与核酸分开。离心后分为两相，一般上层为含有核酸的水相，下与核酸分开。离心后分为两相，一般上层为含有核酸的水相，下与核酸分开。离心后分为两相，一般上层为含有核酸的水相，下与核酸分开。离心后分为两相，一般上层为含有核酸的水相，下层为有机相，相界处则是变性凝聚的蛋白质层。层为有机相，相界处则是变性凝聚的蛋白质层。层为有机相，相界处则是变性凝聚的蛋白质层。层为有机相，相界处则是变性凝聚的蛋白质层。用有机溶剂处理核酸溶液时，既要使水溶液与有机
23、溶剂充分用有机溶剂处理核酸溶液时，既要使水溶液与有机溶剂充分用有机溶剂处理核酸溶液时，既要使水溶液与有机溶剂充分用有机溶剂处理核酸溶液时，既要使水溶液与有机溶剂充分接触，又要注意防止剪切力对接触，又要注意防止剪切力对接触，又要注意防止剪切力对接触，又要注意防止剪切力对DNADNA的破坏。的破坏。的破坏。的破坏。有机溶剂处理以去除蛋白质的次数视蛋白质的含量和制剂纯有机溶剂处理以去除蛋白质的次数视蛋白质的含量和制剂纯有机溶剂处理以去除蛋白质的次数视蛋白质的含量和制剂纯有机溶剂处理以去除蛋白质的次数视蛋白质的含量和制剂纯度要求而定，一般要处理到中间变性蛋白质层消失为止。度要求而定，一般要处理到中间变
24、性蛋白质层消失为止。度要求而定，一般要处理到中间变性蛋白质层消失为止。度要求而定，一般要处理到中间变性蛋白质层消失为止。2表面活性剂法表面活性剂法 破细胞时所用的破细胞时所用的SDS等阴离子去污剂除了可等阴离子去污剂除了可以溶解膜蛋白和脂肪外，还可解聚核蛋白。以溶解膜蛋白和脂肪外，还可解聚核蛋白。3蛋白酶水解法蛋白酶水解法 用蛋白酶水解去除蛋白质的方法比较温和，用蛋白酶水解去除蛋白质的方法比较温和，可避免剪可避免剪 切力的破坏。切力的破坏。（三）核酸的沉淀（三）核酸的沉淀（三）核酸的沉淀（三）核酸的沉淀沉淀的目的：改变核酸溶解缓冲液；调整核酸浓度；去沉淀的目的：改变核酸溶解缓冲液；调整核酸浓度
25、；去沉淀的目的：改变核酸溶解缓冲液；调整核酸浓度；去沉淀的目的：改变核酸溶解缓冲液；调整核酸浓度；去除部分杂质及某些盐离子。除部分杂质及某些盐离子。除部分杂质及某些盐离子。除部分杂质及某些盐离子。实验室常用的核酸沉淀剂为乙醇和异丙醇。实验室常用的核酸沉淀剂为乙醇和异丙醇。实验室常用的核酸沉淀剂为乙醇和异丙醇。实验室常用的核酸沉淀剂为乙醇和异丙醇。n n异丙醇：所用的体积小（一般为异丙醇：所用的体积小（一般为异丙醇：所用的体积小（一般为异丙醇：所用的体积小（一般为2/32/3体积），一般不需体积），一般不需体积），一般不需体积），一般不需要在低温下长时间的放置。但异丙醇不易挥发除去。要在低温下长
26、时间的放置。但异丙醇不易挥发除去。要在低温下长时间的放置。但异丙醇不易挥发除去。要在低温下长时间的放置。但异丙醇不易挥发除去。乙醇：很易挥发除去，但所需的体积大（一般为乙醇：很易挥发除去，但所需的体积大（一般为乙醇：很易挥发除去，但所需的体积大（一般为乙醇：很易挥发除去，但所需的体积大（一般为2 2倍体倍体倍体倍体积），且需要在低温下长时间放置（如沉淀积），且需要在低温下长时间放置（如沉淀积），且需要在低温下长时间放置（如沉淀积），且需要在低温下长时间放置（如沉淀RNARNA时一时一时一时一般要般要般要般要-20-20至少放置至少放置至少放置至少放置2 2小时）。小时）。小时）。小时）。沉淀核
27、酸时，一般还要加入一定浓度的盐溶液，如沉淀核酸时，一般还要加入一定浓度的盐溶液，如沉淀核酸时，一般还要加入一定浓度的盐溶液，如沉淀核酸时，一般还要加入一定浓度的盐溶液，如NaAcNaAc或或或或NaClNaCl。这是因为在。这是因为在。这是因为在。这是因为在pHpH为为为为8 8左右的溶液中，核左右的溶液中，核左右的溶液中，核左右的溶液中，核酸分子是带有负电荷的，加一定浓度的酸分子是带有负电荷的，加一定浓度的酸分子是带有负电荷的，加一定浓度的酸分子是带有负电荷的，加一定浓度的NaAcNaAc或或或或NaClNaCl，使，使，使，使NaNa+中和中和中和中和DNADNA分子上的负电荷，减少分子上
28、的负电荷，减少分子上的负电荷，减少分子上的负电荷，减少DNADNA分子之分子之分子之分子之间的同性电荷斥力，易于互相聚合而形成核酸的盐沉淀。间的同性电荷斥力，易于互相聚合而形成核酸的盐沉淀。间的同性电荷斥力，易于互相聚合而形成核酸的盐沉淀。间的同性电荷斥力，易于互相聚合而形成核酸的盐沉淀。加入的盐溶液浓度太低：只有部分核酸形成钠盐而加入的盐溶液浓度太低：只有部分核酸形成钠盐而加入的盐溶液浓度太低：只有部分核酸形成钠盐而加入的盐溶液浓度太低：只有部分核酸形成钠盐而聚合，这样就造成核酸的沉淀不完全。聚合，这样就造成核酸的沉淀不完全。聚合，这样就造成核酸的沉淀不完全。聚合，这样就造成核酸的沉淀不完全
29、。加入的盐溶液浓度太高时：核酸沉淀中有较高浓度加入的盐溶液浓度太高时：核酸沉淀中有较高浓度加入的盐溶液浓度太高时：核酸沉淀中有较高浓度加入的盐溶液浓度太高时：核酸沉淀中有较高浓度的盐的存在，会影响到下游操作，例如的盐的存在，会影响到下游操作，例如的盐的存在，会影响到下游操作，例如的盐的存在，会影响到下游操作，例如DNADNA的限制性的限制性的限制性的限制性酶切反应。此时必须要进行洗涤或重沉淀。酶切反应。此时必须要进行洗涤或重沉淀。酶切反应。此时必须要进行洗涤或重沉淀。酶切反应。此时必须要进行洗涤或重沉淀。沉淀核酸时的温度、所需时间以及沉淀后沉淀核酸时的温度、所需时间以及沉淀后离心的速度和时间，
30、取决于核酸分子的大小，离心的速度和时间，取决于核酸分子的大小，浓度以及有无助沉淀物存在。核酸分子越小、浓度以及有无助沉淀物存在。核酸分子越小、浓度越稀，沉淀时所需温度越低，时间也越长，浓度越稀，沉淀时所需温度越低，时间也越长，离心时要求速度高、时间长。离心时要求速度高、时间长。（三）核酸的洗涤（三）核酸的洗涤离心沉淀得到的核酸一般还要用离心沉淀得到的核酸一般还要用70%的乙醇洗涤以去除盐分及一些小分子的杂的乙醇洗涤以去除盐分及一些小分子的杂质，真空抽干或室温晾干后溶于适当的溶质，真空抽干或室温晾干后溶于适当的溶液中。液中。n n（四）（四）（四）（四）核酸的浓缩核酸的浓缩n n如果核酸溶液中如
31、果核酸溶液中DNA含量低，体积较大，不易含量低，体积较大，不易进行乙醇沉淀时，可采用固体聚乙二醇吸水浓缩进行乙醇沉淀时，可采用固体聚乙二醇吸水浓缩法或正丁醇抽提浓缩法进行浓缩。法或正丁醇抽提浓缩法进行浓缩。n n固体聚乙二醇吸水浓缩法：将待浓缩的固体聚乙二醇吸水浓缩法：将待浓缩的DNA溶溶液装入透析袋中，在透析袋外加适量的固体聚乙液装入透析袋中，在透析袋外加适量的固体聚乙二醇，使二醇，使DNA脱水达到浓缩效果。脱水达到浓缩效果。n n正丁醇抽提浓缩法：利用部分水分子可分配于有正丁醇抽提浓缩法：利用部分水分子可分配于有机溶液中，使溶液的体积减少，有机溶剂则不吸机溶液中，使溶液的体积减少，有机溶剂
32、则不吸取溶液中的取溶液中的DNA和其盐类分子。和其盐类分子。（五）核酸制剂的保存（五）核酸制剂的保存 分离提取到的核酸制品在保存过程中要防止变性和降分离提取到的核酸制品在保存过程中要防止变性和降分离提取到的核酸制品在保存过程中要防止变性和降分离提取到的核酸制品在保存过程中要防止变性和降解。因此，溶解核酸的溶液必须含有螯合剂以抑制解。因此，溶解核酸的溶液必须含有螯合剂以抑制解。因此，溶解核酸的溶液必须含有螯合剂以抑制解。因此，溶解核酸的溶液必须含有螯合剂以抑制DNADNA酶，溶液的酶，溶液的酶，溶液的酶，溶液的pHpH为为为为7878，防止酸碱变性，同时该，防止酸碱变性，同时该，防止酸碱变性，同
33、时该，防止酸碱变性，同时该溶液要有一定的盐浓度，因为在纯水中核酸双链（或双溶液要有一定的盐浓度，因为在纯水中核酸双链（或双溶液要有一定的盐浓度，因为在纯水中核酸双链（或双溶液要有一定的盐浓度，因为在纯水中核酸双链（或双链区）的两条链上磷酸根负离子互相排斥，使双链分开链区）的两条链上磷酸根负离子互相排斥，使双链分开链区）的两条链上磷酸根负离子互相排斥，使双链分开链区）的两条链上磷酸根负离子互相排斥，使双链分开而变性，而变性，而变性，而变性，NaNa+等正离子可中和磷酸根的电负性，保持双等正离子可中和磷酸根的电负性，保持双等正离子可中和磷酸根的电负性，保持双等正离子可中和磷酸根的电负性，保持双链结
34、构。现在较普遍是将链结构。现在较普遍是将链结构。现在较普遍是将链结构。现在较普遍是将DNADNA溶于溶于溶于溶于TETE溶液（溶液（溶液（溶液（10 10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,pH 8.0mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,pH 8.0），），），），-20 -20保存。而保存。而保存。而保存。而RNARNA则通常溶于则通常溶于则通常溶于则通常溶于DEPCDEPC水中。水中。水中。水中。（六）核酸制剂纯度的初步鉴定（六）核酸制剂纯度的初步鉴定 纯净的核酸制品在纯净的核酸制品在纯净的核酸制品在纯净的核酸制品在260 nm260 nm波长处有吸收高峰
35、，波长处有吸收高峰，波长处有吸收高峰，波长处有吸收高峰，230 230 nmnm为吸收低谷。为吸收低谷。为吸收低谷。为吸收低谷。核酸核酸的紫的紫外吸外吸收曲收曲线线 纯度：纯度：纯度：纯度：A260/A280 A260/A280：双链：双链：双链：双链DNADNA为为为为1.81.8，而，而，而，而RNARNA为为为为2.02.0。含量：含量：含量：含量：n n 50A260样本样本稀释倍数稀释倍数1000双链双链DNAug/uln n 40A260样本样本稀释倍数稀释倍数1000单链单链DNARNA ug/uln n 33A260样本样本稀释倍数稀释倍数1000单链寡单链寡聚核苷酸聚核苷酸u
36、g/ulDNA第二节第二节 酚氯仿抽提法分离基因组酚氯仿抽提法分离基因组DNA 酚氯仿抽提酚氯仿抽提DNA的原理的原理n n去除蛋白质最经典的方法是酚氯仿抽提法，也是最常用的方法。n n酚氯仿抽提法的原理是：利用核酸与蛋白质对苯酚的变性作用具有的不同反应性分离核酸与蛋白质。在细胞破碎步骤后的样品混合液中用苯酚抽提和高速离心后，样品中的蛋白质成分被变性，或者变成不溶性物质，而核酸则溶解在水相中。n n苯酚抽提通常采用苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液。这种混合溶液比单纯的苯酚更有效地使蛋白质变性，并且有助于稳定RNA，随后氯仿、异戊醇抽提，将残留苯酚从水相中（含核酸）除去。最后用乙醇沉淀DNA，同时也
37、可去除残留的氯仿试剂配制要求及作用试剂配制要求及作用n n酚的重蒸馏和平衡酚的重蒸馏和平衡n n酚易氧化，其氧化产物对酚易氧化，其氧化产物对DNADNA有破坏作用，使用有破坏作用，使用前需要将酚进行重蒸馏。苯酚前需要将酚进行重蒸馏。苯酚6565熔化后，用空熔化后，用空气冷凝管进行重蒸馏，气冷凝管进行重蒸馏，183183收集纯净酚。收集纯净酚。n n由于酚是中强酸使用前要进行酚的平衡，在纯净由于酚是中强酸使用前要进行酚的平衡，在纯净酚中加入等体积的酚中加入等体积的1mol/lTris-HCl1mol/lTris-HCl缓冲液缓冲液(pH8.0)(pH8.0)并加入固体并加入固体TrisTris，
38、激烈震荡使酚的，激烈震荡使酚的pHpH值值平衡到平衡到8.08.0。酚中常加入抗氧化作用的。酚中常加入抗氧化作用的8-8-羟基喹羟基喹咛，咛，8-8-羟基喹咛使酚呈现黄色，可作为指示颜色。羟基喹咛使酚呈现黄色，可作为指示颜色。将酚保存于棕色瓶中，表面覆盖一层将酚保存于棕色瓶中，表面覆盖一层0.1mol/lTris-HCl(pH8.0)0.1mol/lTris-HCl(pH8.0)防止氧化。防止氧化。n n酚氯仿异戊醇混合液配制酚氯仿异戊醇混合液配制n n氯仿为挥发性有机溶剂，可使蛋白质变性，加氯仿为挥发性有机溶剂，可使蛋白质变性，加入氯仿可以入氯仿可以:n n1.1.减少酚的用量；减少酚的用量
39、；n n2.2.使蛋白质变性更为彻底；使蛋白质变性更为彻底；n n3.3.同时可抑制核酸酶的活性。同时可抑制核酸酶的活性。n n异戊醇可消除抽提时有机相和水相之间产生的异戊醇可消除抽提时有机相和水相之间产生的气泡，有利于分层。气泡，有利于分层。n n通常按酚通常按酚 氯仿氯仿 异戊醇异戊醇2525 2424 1 1比例将三种试比例将三种试剂混合，要求用时临时配制。剂混合，要求用时临时配制。主要所需的试剂及消耗品主要所需的试剂及消耗品主要所需的试剂及消耗品主要所需的试剂及消耗品:TESTES溶液溶液蔗糖蔗糖-TES-TES溶液溶液溶菌酶溶菌酶(50mg/ml)(50mg/ml)EDTAEDTA溶
40、液溶液(0.25mmol/ml)(0.25mmol/ml)SDSSDS溶液溶液(10g/l)(10g/l)饱和酚饱和酚:氯仿氯仿:异戊醇异戊醇(PH8.0)(PH8.0)NaAcNaAc（3mol/l3mol/l）无水乙醇，无水乙醇，70%70%的乙醇的乙醇n n实例：实例：实例：实例：n n原核生物（大肠杆菌）基因组原核生物（大肠杆菌）基因组原核生物（大肠杆菌）基因组原核生物（大肠杆菌）基因组DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化过程过程过程过程n n1.1.吸取已培养好的大肠杆菌液体吸取已培养好的大肠杆菌液体吸取已培养好的大肠杆菌液体吸取已培养好的大肠杆菌液体5.0ml5.0
41、ml于中号于中号于中号于中号试管中试管中试管中试管中,4000,4000转转转转/min/min离心离心离心离心15min15min，弃去上清，弃去上清，弃去上清，弃去上清，加入一定体积的加入一定体积的加入一定体积的加入一定体积的TESTES液，洗菌体液，洗菌体液，洗菌体液，洗菌体1212次，如上次，如上次，如上次，如上述方法收集菌体，将培养细菌的一些营养物的述方法收集菌体，将培养细菌的一些营养物的述方法收集菌体，将培养细菌的一些营养物的述方法收集菌体，将培养细菌的一些营养物的清洗干净。清洗干净。清洗干净。清洗干净。n n2.2.弃去弃去弃去弃去TESTES液后，管底菌体大约液后，管底菌体大约
42、液后，管底菌体大约液后，管底菌体大约200ul200ul，加，加，加，加入五倍体积的预冷蔗糖入五倍体积的预冷蔗糖入五倍体积的预冷蔗糖入五倍体积的预冷蔗糖-TES-TES液约液约液约液约1ml1ml，在冰浴，在冰浴，在冰浴，在冰浴中充分混匀，加入溶菌酶（中充分混匀，加入溶菌酶（中充分混匀，加入溶菌酶（中充分混匀，加入溶菌酶（50mg/ml50mg/ml）至终）至终）至终）至终浓度浓度浓度浓度1mg/ml1mg/ml，（计算方法，（计算方法，（计算方法，（计算方法，50 x=11,x=0.02ml50 x=11,x=0.02ml）充分混匀后，在）充分混匀后，在）充分混匀后，在）充分混匀后，在0 0
43、处理处理处理处理15min15minn n 该步骤作用为破坏细胞壁，为了防止酶的变该步骤作用为破坏细胞壁，为了防止酶的变该步骤作用为破坏细胞壁，为了防止酶的变该步骤作用为破坏细胞壁，为了防止酶的变性，需低温处理，同时加性，需低温处理，同时加性，需低温处理，同时加性，需低温处理，同时加EDTAEDTA抑制抑制抑制抑制DNADNA酶。酶。酶。酶。n n3.3.加入加入加入加入EDTAEDTA（0.25mol/l0.25mol/l）至终浓度为）至终浓度为）至终浓度为）至终浓度为0.1mol/l 0.1mol/l(计算为计算为计算为计算为0.25X=0.10.25X=0.1（1+X1+X）约取）约取）
44、约取）约取0.25mol/lEDTA 0.25mol/lEDTA 600700ul600700ul轻轻混匀后，轻轻混匀后，轻轻混匀后，轻轻混匀后，0 0处理处理处理处理10min10min。充分抑制。充分抑制。充分抑制。充分抑制DNADNA酶的活性，再加入酶的活性，再加入酶的活性，再加入酶的活性，再加入SDSSDS或（蛋白酶或（蛋白酶或（蛋白酶或（蛋白酶KK）溶液至终浓度）溶液至终浓度）溶液至终浓度）溶液至终浓度为为为为10g/l10g/l，混匀，于，混匀，于，混匀，于，混匀，于3737裂解裂解裂解裂解30min30min，9494裂解裂解裂解裂解1min1min。n n 该步骤为裂解细胞膜：
45、裂解胞膜可以用蛋白酶该步骤为裂解细胞膜：裂解胞膜可以用蛋白酶该步骤为裂解细胞膜：裂解胞膜可以用蛋白酶该步骤为裂解细胞膜：裂解胞膜可以用蛋白酶KK，由，由，由，由于蛋白酶于蛋白酶于蛋白酶于蛋白酶KK价格较高，所以常用价格较高，所以常用价格较高，所以常用价格较高，所以常用SDSSDS（胞膜双脂层。（胞膜双脂层。（胞膜双脂层。（胞膜双脂层。SDSSDS为十二烷基磺酸钠，为一种表面活性剂，能破坏双脂层）为十二烷基磺酸钠，为一种表面活性剂，能破坏双脂层）为十二烷基磺酸钠，为一种表面活性剂，能破坏双脂层）为十二烷基磺酸钠，为一种表面活性剂，能破坏双脂层）常配制的常配制的常配制的常配制的SDSSDS为为为为
46、100g/l100g/l，加入时据体系中的总体积进行，加入时据体系中的总体积进行，加入时据体系中的总体积进行，加入时据体系中的总体积进行计算（计算（计算（计算（100 x=101.8,x=180ul100 x=101.8,x=180ul200ul200ul）n n4.4.在在在在3737裂解后，呈现为高粘稠性半透明溶液，将试管内裂解后，呈现为高粘稠性半透明溶液，将试管内裂解后，呈现为高粘稠性半透明溶液，将试管内裂解后，呈现为高粘稠性半透明溶液，将试管内的裂解液分装在两个的裂解液分装在两个的裂解液分装在两个的裂解液分装在两个1.5mlEP1.5mlEP管中，约管中，约管中，约管中，约0.7ml0
47、.7ml。取其中。取其中。取其中。取其中一管进行下一步试验，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇一管进行下一步试验，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇一管进行下一步试验，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇一管进行下一步试验，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（2525：2424：1 1）抽提（由黄色变为乳白色），于）抽提（由黄色变为乳白色），于）抽提（由黄色变为乳白色），于）抽提（由黄色变为乳白色），于1200012000转转转转/min/min离心离心离心离心10min10min，将上层水相抽一入另一个，将上层水相抽一入另一个，将上层水相抽一入另一个，将上层水相抽一入另一个EPEP管中，管中，管中，管中，重复上述抽提
48、一次，吸取上层水相于另一个重复上述抽提一次，吸取上层水相于另一个重复上述抽提一次，吸取上层水相于另一个重复上述抽提一次，吸取上层水相于另一个EPEP管中，加入管中，加入管中，加入管中，加入等体积的氯仿：异戊醇等体积的氯仿：异戊醇等体积的氯仿：异戊醇等体积的氯仿：异戊醇=24=24：1 1，抽提一次，操作同前，抽提一次，操作同前，抽提一次，操作同前，抽提一次，操作同前 n n5.小心吸取上层水相，转移至另一个1.5mlEp管中，加入1/10倍体积的NaAc及2倍体积的无水乙醇。-20 静置10min后观察沉淀（DNA）挑取出DNA沉淀加入70%的乙醇1ml洗涤一次。12000转离心2min.n
49、n6.弃去乙醇，在室温下挥发干剩余乙醇，加入10mmol/l的TE溶液50ul。溶解乙醇。n n7.-20 保存。保存。离心机离心机 水浴锅水浴锅EPEP管管微量移液器微量移液器仪器用具仪器用具第三节第三节 碱裂解法抽提质粒碱裂解法抽提质粒DNA n n原理：原理：原理：原理：n n在的碱性环境中，线性的大分在的碱性环境中，线性的大分在的碱性环境中，线性的大分在的碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体子量细菌染色体子量细菌染色体子量细菌染色体DNADNA变性，而变性，而变性，而变性，而共价闭环（共价闭环（共价闭环（共价闭环（CCCC）质粒）质粒）质粒）质粒DNADNA仍仍仍仍为自然状态。将为自然
50、状态。将为自然状态。将为自然状态。将PHPH调至中性并调至中性并调至中性并调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染有高盐浓度存在的条件下，染有高盐浓度存在的条件下，染有高盐浓度存在的条件下，染色体色体色体色体DNADNA之间交联形成不溶性之间交联形成不溶性之间交联形成不溶性之间交联形成不溶性网状结构。大部分网状结构。大部分网状结构。大部分网状结构。大部分DNADNA和蛋白和蛋白和蛋白和蛋白质在去污剂质在去污剂质在去污剂质在去污剂SDSSDS的作用下形成的作用下形成的作用下形成的作用下形成沉淀，而质粒沉淀，而质粒沉淀，而质粒沉淀，而质粒DNADNA仍然为可溶仍然为可溶仍然为可溶仍然为可溶状态。通过离