毕业答辩模板暨南大学.ppt

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1、Jason WangTechnical Account Manager,Qualicon ChinaEHEC O104:H42肠杆菌科肠杆菌科(Enterobacteriaceae)一大群居住在人和动物肠道中一大群居住在人和动物肠道中生物学性状近似的革兰阴性短小杆菌生物学性状近似的革兰阴性短小杆菌广布于自然界广布于自然界 多数是肠道的正常菌群，但当宿主免疫力降低或细菌移位至多数是肠道的正常菌群，但当宿主免疫力降低或细菌移位至肠道外部位时可成为条件致病菌肠道外部位时可成为条件致病菌至少有至少有3030个菌属，个菌属，120120个以上的菌种个以上的菌种少数为致病菌，是肠道传染病的最重要病原菌少数

2、为致病菌，是肠道传染病的最重要病原菌3肠杆菌科中与医学有关的常见菌属肠杆菌科中与医学有关的常见菌属 埃希菌属埃希菌属 大肠杆菌大肠杆菌 志贺菌属志贺菌属 痢疾志贺菌痢疾志贺菌 爱德华菌属爱德华菌属 迟钝爱德华菌迟钝爱德华菌 沙门菌属沙门菌属 伤寒沙门菌伤寒沙门菌 枸橼酸菌属枸橼酸菌属 弗氏枸橼酸杆菌弗氏枸橼酸杆菌 克雷伯菌属克雷伯菌属 肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌 肠杆菌属肠杆菌属 产气肠杆菌产气肠杆菌 哈夫尼亚菌属哈夫尼亚菌属 蜂窝哈夫尼亚菌蜂窝哈夫尼亚菌 沙雷菌属沙雷菌属 粘质沙雷菌粘质沙雷菌 变形杆菌属变形杆菌属 普通变形杆菌普通变形杆菌 摩根菌属摩根菌属 摩氏摩根菌摩氏摩根菌 普罗威登斯菌

3、属普罗威登斯菌属 雷氏普罗威登斯菌雷氏普罗威登斯菌 耶尔森菌属耶尔森菌属 鼠疫耶尔森菌鼠疫耶尔森菌 欧文菌属欧文菌属 草原居民欧文菌草原居民欧文菌 菌属菌属 代表种代表种4H H抗原抗原(鞭毛鞭毛)OO抗原抗原(LPS(LPS侧链侧链)K K抗原抗原或或ViVi(荚膜荚膜)F F抗原抗原(菌毛菌毛)复杂的抗原构造 5肠杆菌科的细菌引起不同部位感染中枢神经系统（埃希菌属）中枢神经系统（埃希菌属）下呼吸道（克雷伯菌属、肠杆菌下呼吸道（克雷伯菌属、肠杆菌属、埃希菌属属、埃希菌属）血液（埃希菌属血液（埃希菌属、克雷伯菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属）肠杆菌属）胃肠道（埃希菌属胃肠道（埃希菌属、沙门菌属、志、

4、沙门菌属、志贺菌属、耶尔森菌属）贺菌属、耶尔森菌属）泌尿道（埃希菌属泌尿道（埃希菌属、变形杆菌属、变形杆菌属、克雷伯菌属、摩根菌属）克雷伯菌属、摩根菌属）6埃希氏菌属Escherichia 是人类和动物肠道中的正常菌群是人类和动物肠道中的正常菌群 出生后数小时就进入肠道，并终生伴随出生后数小时就进入肠道，并终生伴随 以大肠埃希菌（以大肠埃希菌（E.coliE.coli）最为重要，是最常见的临床分离株）最为重要，是最常见的临床分离株大肠埃希菌7正常菌群，一般不致病正常菌群，一般不致病条件致病条件致病某些带有致病基因的血清型，引起肠道感染某些带有致病基因的血清型，引起肠道感染细菌居住部位改变引起的

5、肠外感染：细菌居住部位改变引起的肠外感染：尿路感染最常见尿路感染最常见致病菌株致病菌株大肠埃希菌8分类可引起腹泻的大肠杆菌称为肠道致病性大肠杆菌或致泻可引起腹泻的大肠杆菌称为肠道致病性大肠杆菌或致泻性大肠杆菌。目前根据毒力因子、致病机理和流行病学性大肠杆菌。目前根据毒力因子、致病机理和流行病学特征，特征，通常通常将致泻性大肠杆菌分为将致泻性大肠杆菌分为5 5类类：肠产毒性大肠杆菌（肠产毒性大肠杆菌（ETECETEC）肠侵袭性大肠杆菌（肠侵袭性大肠杆菌（EIECEIEC）肠致病性大肠杆菌（肠致病性大肠杆菌（EPECEPEC）肠黏附性大肠杆菌（肠黏附性大肠杆菌（EAECEAEC）肠出血性大肠杆菌（

6、肠出血性大肠杆菌（EHECEHEC）9致泻性大肠杆菌引起的腹泻致泻性大肠杆菌引起的腹泻10肠致病性大肠杆菌（EnteropathogenicEscherichia coli,EPEC）代表菌株：代表菌株：E2348/69E2348/69，血清型，血清型O127:H6O127:H6测序菌株：测序菌株：E2348/69E2348/69 EPECEPEC是是流流行行病病学学研研究究中中最最早早发发现现的的引引起起腹腹泻泻的的大大肠肠杆杆菌菌，不不产产生生肠肠毒毒素素及及其其他他外外毒毒素素，无无侵侵袭袭力力。病病原原菌菌在在十十二二指指肠肠、空空肠肠和和回回肠肠上上段段粘粘膜膜表表面面大大量量繁繁殖

7、殖，粘粘附附于于微微绒绒毛毛，导导致致刷刷状状缘缘被被破破坏坏、微微绒绒毛毛萎萎缩缩、上上皮皮细细胞胞排排列列紊紊乱乱和和功功能能受受损损，造造成成严严重重腹腹泻泻。EPECEPEC对对细细胞胞的的粘粘附附有有两两种种类类型型。局局限限性性粘粘附附是是指指病病原原菌菌呈呈块块状状粘粘附附在在肠肠粘粘膜膜细细胞胞表表面面的的某某一一部部分分，弥弥散散性性粘粘附附是是病病原原菌菌主主要要以以单单个个分分散散粘粘附附在在细细胞胞表表面面。由由于于两两者者在在生生物物学学特特性性、致致病病性性等等方方面面存存在在较较大大差差异异，有有学学者者称称弥弥散散粘粘附附的的EPECEPEC为为EPECEPEC

8、 型型或或者者弥弥散粘附性大肠杆菌（散粘附性大肠杆菌（DiffuselyAdherentDiffuselyAdherentEscherichia coliEscherichia coli,DAEC,DAEC）。）。11肠致病性大肠杆菌（EnteropathogenicEscherichia coli,EPEC）12肠致病性大肠杆菌（EnteropathogenicEscherichia coli,EPEC）典典典典型型型型EPECEPEC（typicaltypicalEPECEPEC，含含有有LEELEE和和70100kb70100kb的的大大毒毒力力质质粒粒EAFEAF）是是发发展展中中国国

9、家家引引起起婴婴幼幼儿儿特特别别是是0606个个月月婴婴儿儿腹腹泻泻的的主主要要病病原原菌菌，在在某某些些发发展展中中国国家家EPECEPEC引引起起的的婴婴儿儿腹腹泻泻可可达达3040%3040%，甚甚至至超超过过轮轮状状病病毒毒所所占占的的比比例例。上上世世纪纪40504050年年代代之之前前，EPECEPEC常常引引起起发发达达国国家家婴婴幼幼儿儿腹腹泻泻的的暴暴发发，但但目目前前典典型型EPECEPEC在在发发达达国国家家却却很很少少见见。而而非非非非典典典典型型型型EPECEPEC（atypicalatypicalEPECEPEC，含含有有LEELEE但但不不含含毒毒力力质质粒粒EA

10、FEAF）是是发发达达国国家家引引起起腹腹泻泻的的重重要要病病原原菌菌，并并能能引引起起发发达达国国家家婴婴幼幼儿儿和和成成人人的的腹腹泻泻暴暴发发。非非典典型型EPECEPEC感感染染引引起起的的腹腹泻泻通通常常持持续续时时间间更更长长，可可超超过过1414天天。典典型型EPECEPEC的的储储存存宿宿主主主主要要是是人人，而而非非典典型型EPECEPEC人人和和动动物物都都可可作为储存宿主。作为储存宿主。13肠产毒性大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichia coli,ETEC）代表菌株：代表菌株：1040710407测序菌株：测序菌株：E24377AE24377A E

11、TECETEC是是5 5岁岁以以下下婴婴幼幼儿儿和和旅旅游游者者腹腹泻泻的的重重要要病病原原菌菌。ETECETEC的的致致病病物物质质主主要要是是肠肠毒毒素素和和定定植植因因子子。肠肠毒毒素素有有不不耐耐热热肠肠毒毒素素（heatheat labilelabile enterotoxin,enterotoxin,LTLT）和和 耐耐 热热 肠肠 毒毒 素素（heatheat stablestableenterotoxin,enterotoxin,STST）两两种种。LTLT与与腺腺苷苷环环化化酶酶作作用用，使使胞胞内内cAMPcAMP水水平平增增高高，导导致致肠肠粘粘膜膜细细胞胞内内水水、钠钠

12、、氯氯等等过过度度分分泌泌至至肠肠腔腔，导导致致腹腹泻泻；而而STST通通过过激激活活肠肠粘粘膜膜细细胞胞上上的的鸟鸟苷苷环环化化酶酶，使使胞胞内内cGMPcGMP升升高而导致腹泻。高而导致腹泻。14肠产毒性大肠杆菌（EnterotoxigenicEscherichia coli,ETEC）菌菌毛毛粘粘附附素素（adhesinadhesin）是是ETECETEC致致病病的的另另一一重重要要因因素素。能能形形成成肠肠毒毒素素而而无无菌菌毛毛的的菌菌株株，不不会会引引起起腹腹泻泻。菌菌毛毛粘粘附附素素常常被被称称之之为为定定植植因因子子（colonizationcolonizationfactor

13、factor，CFCF）。与与ETECETEC致致病病有有关关的的定定植植因因子子主主要要包包括括K88K88、K99K99、987P987P、F41F41、CFA/ICFA/I（colonizationcolonizationfactorfactorantigenantigentypetypeI I）和和CFA/IICFA/II等等；其其中中CFA/ICFA/I和和CFA/IICFA/II只只在在人人源源性性ETECETEC中中发发现现；ETECETEC菌菌毛毛的的粘粘附附作作用用具具有有高高度度专专一一性性，如如CFACFA其其作作用用不不被被甘甘露露糖糖所所抑抑制制，与与大大肠肠埃埃希希

14、菌菌 型型菌菌毛毛的的受受体体完完全全不不同同。大大肠肠埃埃希希菌菌第第一一个个被被认认识识的的定定植植因因子子是是猪猪大大肠肠埃埃希希菌菌的的表表面面抗抗原原K88K88，菌菌毛毛性性质质，由由转转移移性性质质粒粒控控制制。定定植植因因子子具具有有很很强强的的抗抗原原性性，能能刺刺激激宿宿主主产产生生特特异异性性抗抗体体。在在兽兽医医界界已已制制成成口口饲饲菌菌毛毛疫苗，在猪群中人工免疫后，可抵抗猪疫苗，在猪群中人工免疫后，可抵抗猪ETECETEC的侵袭。的侵袭。15肠集聚性大肠杆菌（EnteroaggregativeEscherichia coli,EAEC）代表菌株：代表菌株：Ec042

15、Ec042，血清型，血清型O44:H18O44:H18测序菌株：测序菌株：5598955989 EAECEAEC不不侵侵袭袭细细胞胞，可可产产生生毒毒素素和和粘粘附附素素。毒毒素素包包括括肠肠集集聚聚耐耐热热毒毒素素（enteroaggregativeenteroaggregativeheat-stableheat-stabletoxin,toxin,EASTEAST）和和不不耐耐热热毒毒素素（plasmidplasmidencodingencodingtoxintoxin，PetPet）。EASTEAST抗抗原原上上与与ETECETEC的的STST有有关关，可可导导致致大大量量液液体体分分泌

16、泌。另另一一毒毒素素似似大大肠肠杆杆菌菌的的 溶溶血血素素。EAECEAEC有有 4 4种种 不不 同同 形形 态态 的的 菌菌 毛毛，其其 中中 集集 聚聚 性性 粘粘 附附 菌菌 毛毛I I（aggregativeaggregativeadherenceadherencefimbriaefimbriaeI I，AAF/IAAF/I）与与EPECEPEC中中bfpbfp基基因因编编码码的的菌菌毛毛很很相相似似。细细菌菌通通过过菌菌毛毛粘粘附附于于肠肠粘粘膜膜上上皮皮细细胞胞，在在细细胞胞表面聚集，形成砖状排列。表面聚集，形成砖状排列。16肠集聚性大肠杆菌（EnteroaggregativeE

17、scherichia coli,EAEC）Localized adherenceLocalized adherenceAggregative adherenceAggregative adherenceDiffuse adherenceDiffuse adherence17肠集聚性大肠杆菌（EnteroaggregativeEscherichia coli,EAEC）肠肠集集聚聚性性大大肠肠杆杆菌菌可可引引起起人人类类特特别别是是小小儿儿急急性性或或顽顽固固性性腹腹泻泻，EAECEAEC感感染染的的典典型型症症状状包包括括水水样样，粘粘液液样样，分分泌泌性性腹腹泻泻，通通常常无无呕呕吐吐或或很

18、很少少出出现现呕呕吐吐，不不伴伴有有发发热热或或仅仅有有低低热热。部部分分病病人人粪粪便便中中可可以以检检测测到到血血细细胞胞。肠肠集集聚聚性性大大肠肠杆杆菌菌感感染染是是发发展展中中国国家家腹腹泻泻的的重重要要病病因因。巴巴西西的的研研究究数数据据表表明明，EAECEAEC感感染染是是小小儿儿腹腹泻泻最最常常见见的的病病因因。在在美美国国，EAECEAEC是是继继ETECETEC之之后后导导致致成成人人旅旅游游者者腹腹泻泻的的第第二二大大病病原原菌菌，同同时时EAECEAEC也也是是导导致致美美国国儿儿童童腹腹泻泻最最常常见见的的病病原原菌。菌。EAECEAEC除除引引起起散散发发感感染染外

19、外，在在日日本本、意意大大利利、英英国国、墨墨西西哥哥、塞尔维亚等国均有塞尔维亚等国均有EAECEAEC引起暴发的报道引起暴发的报道。18肠侵袭性大肠杆菌（EnteroinvasiveEscherichia coli,EIEC）代表菌株：代表菌株：4482544825测序菌株：测序菌株：5363853638（尚未测完）（尚未测完）EIECEIEC较较少少见见，主主要要侵侵犯犯较较大大儿儿童童和和成成人人。所所致致疾疾病病很很像像细细菌菌性痢疾，腹泻呈脓血便，有里急后重。性痢疾，腹泻呈脓血便，有里急后重。EIECEIEC不不产产生生肠肠毒毒素素，能能侵侵袭袭结结肠肠粘粘膜膜上上皮皮细细胞胞并并在

20、在其其中中生生长长繁繁殖殖。细细菌菌经经消消化化道道进进入入大大肠肠后后，穿穿过过粘粘液液层层，粘粘附附到到肠肠上上皮皮细细胞胞上上，引引起起细细胞胞内内吞吞，被被带带入入细细胞胞内内空空泡泡中中。其其毒毒力力主主要要表表现现在在能能使使空空泡泡破破坏坏，细细菌菌进进入入上上皮皮细细胞胞胞胞浆浆中中增增殖殖，最最后后杀杀死死细细胞胞，再再扩扩散散到到邻邻近近细细胞胞，导导致致组组织织破破坏坏和和随随后后的的炎炎症症发发生生。EIECEIEC的的侵侵袭袭与与一一种种大大质质粒粒（120MD120MD140MD140MD）有有关关，该该质质粒粒与与编编码码志志贺贺菌菌侵侵袭袭力力的的大大质质粒粒高

21、高度度同同源源，分分子子量量也也相相近近，丢丢失失了了质质粒粒的的菌菌株毒力也随之丧失，成为无毒株。株毒力也随之丧失，成为无毒株。19肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicEscherichia coli,EHEC）代表菌株：代表菌株：EDL933EDL933、SakaiSakai，血清型，血清型O157:H7O157:H7测序菌株：测序菌株：EDL933EDL933、SakaiSakai等等 19821982年年在在美美国国的的俄俄勒勒冈冈州州和和密密执执安安州州的的一一起起出出血血性性肠肠炎炎暴暴发发中中首首次次分分离离到到大大肠肠杆杆菌菌O157:H7O157:H7，并并被

22、被确确认认为为病病原原菌菌。大大肠肠杆杆菌菌O157:H7O157:H7是是 EHECEHEC中中 最最 主主 要要 的的 血血 清清 型型，EHECEHEC也也 包包 括括 其其 它它 如如O111:H8O111:H8、O26:H11O26:H11、O103:H2O103:H2等血清型的部分菌株。等血清型的部分菌株。大大 肠肠 杆杆 菌菌 O157:H7O157:H7感感 染染 可可 引引 起起 轻轻 度度 腹腹 泻泻、出出 血血 性性 结结 肠肠 炎炎（HCHC）、溶溶血血性性尿尿毒毒综综合合症症（HUSHUS），血血栓栓性性血血小小板板减减少少性性紫紫癜（癜（TTPTTP）等。其中）等。

23、其中HUSHUS病程凶险，易造成急性肾衰竭乃至死亡。病程凶险，易造成急性肾衰竭乃至死亡。20肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicEscherichia coli,EHEC）EHECEHEC的的致致病病因因子子主主要要有有菌菌毛毛和和毒毒素素。病病菌菌进进入入消消化化道道后后，由由紧紧密密粘粘附附素素介介导导与与宿宿主主末末端端回回肠肠、盲盲肠肠和和结结肠肠上上皮皮细细胞胞结结合合，然然后释放毒素，引起血性腹泻。后释放毒素，引起血性腹泻。EHECEHEC产产生生的的毒毒素素能能使使verovero细细胞胞（非非洲洲绿绿猴猴肾肾细细胞胞系系）产产生生病病变变，故故称称verover

24、o毒毒素素；又又因因同同志志贺贺菌菌的的毒毒素素在在生生物物学学特特性性、物物理理特特性性和和抗抗原原性性等等方方面面相相似似，亦亦称称志志贺贺样样毒毒素素（shiga-likeshiga-liketoxintoxin，SLTSLT）或或志志贺贺毒毒素素StxStx；EHECEHEC的的StxStx分分两两型型，Stx1Stx1与与痢痢疾疾志志贺贺菌菌的的STST基基本本相相同同，可可被被抗抗志志贺贺菌菌抗抗毒毒素素中中和和。Stx2Stx2则则与与STST有有60%60%的的同源。两型毒素均由溶原性噬菌体介导。同源。两型毒素均由溶原性噬菌体介导。eaeAeaeA基因编码紧密粘附素，它与基因编

25、码紧密粘附素，它与EPECEPEC的的eaeAeaeA高度相似。高度相似。pO157pO157质粒编码的肠溶血素。质粒编码的肠溶血素。21肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicEscherichia coli,EHEC）自自19821982年年美美国国首首次次报报道道因因该该菌菌引引起起的的食食物物中中毒毒以以来来，大大肠肠杆杆菌菌O157:H7O157:H7疫疫情情报报道道日日渐渐增增多多，相相继继在在英英国国、加加拿拿大大等等多多个国家发生暴发流行。个国家发生暴发流行。19961996年日本报告病例逾万例，死亡年日本报告病例逾万例，死亡9 9例。例。19991999年年我我国

26、国部部分分地地区区发发生生了了大大肠肠杆杆菌菌O157:H7O157:H7感感染染性性腹腹泻泻的的暴暴发发，我我国国遭遭受受肠肠出出血血性性大大肠肠杆杆菌菌O157:H7O157:H7感感染染性性腹腹泻泻威威胁的形势亦很严峻。胁的形势亦很严峻。最最近近一一次次较较大大的的暴暴发发流流行行发发生生在在20062006年年美美国国。此此次次暴暴发发的的由由受受到到污污染染的的包包装装菠菠菜菜造造成成的的食食源源性性传传播播，波波及及5 5个个州州，报报告告病人病人7171例。例。22肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicEscherichia coli,EHEC）二二十十世世纪纪90

27、90年年代代后后，报报告告发发生生大大肠肠杆杆菌菌O157:H7O157:H7暴暴发发和和散散发发病病例例的的国国家家和和地地区区不不断断增增多多，而而既既往往已已发发生生过过O157:H7O157:H7感感染染发发生生的的国国家家和和地地区区病病例例数数量量也也在在不不断断上上升升，且且逐逐年年呈呈上上升升趋趋势势。O157:H7O157:H7大大肠肠杆杆菌菌感感染染已已成成为为一一个个全全球球性性的的公公共共卫卫生生问问题题，无无论论在在发发达达国国家家还还是是发发展展中中国国家家，都受到广泛关注。都受到广泛关注。23肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicEscherichi

28、a coli,EHEC）STECSTEC，Shiga toxin producing Shiga toxin producing E.coliE.coli 人人们们把把产产生生VTVT毒毒素素的的大大肠肠杆杆菌菌统统称称为为STECSTEC。相相对对来来说说，STECSTEC的的范范围围大大一一些些,EHECEHEC覆覆盖盖的的范范围围小小一一些些。STECSTEC包包括括EHEC,EHECEHEC,EHEC只是只是STECSTEC的一部分的一部分。并并不不是是所所有有的的产产StxStx毒毒素素的的大大肠肠杆杆菌菌都都能能引引起起出出血血性性肠肠炎炎或或溶溶血性尿毒综合症血性尿毒综合症。24

29、EHEC O104:H425EHEC O104:H4检测程序检测程序1.根据标本的种类，按照公布标准的方法，进行标本的预处理。2.使用EHEC增菌液增菌6小时。3.对增菌液提取核酸，进行PCR检测，包括毒力基因（stx1、stx2）。或可使用DuPontPCRReagentKit(D14128299)直接加入增菌液进行荧光定量PCR检测。4.对PCR检测stx1,stx2基因阳性的标本，进行eae、ehx、aatA、aggR、aap毒力基因和O104和H4的抗原特异性基因检测。同时进行大肠杆菌的分离培养鉴定，对单个菌落进行生化、血清型鉴定。26EHEC O104:H4检测程序检测程序27EHE

30、C O104:H4毒力基因检测毒力基因检测1、stx1slt-1-aCAGTTAATGTGGTGGCGAAGG348bpslt-1-bCACCAGACAATGTAACCGCTG针对Shigatoxin1subunitA2、stx2slt-2-aATCCTATTCCCGGGAGTTTACG589bpslt-2-bGCGTCATCGTATACACAGGAGC针对Shigatoxin2subunitA28EHEC O104:H4毒力基因检测毒力基因检测3、eaeAeaeA-a ATTACCATCCACACAGACGGT 397bpeaeA-b ACAGCGTGGTTGGATCAACCT4、ehxAM

31、FS-1F ACGATGTGGTTTATTCTGGA167bp/369bpMFS-1RCTTCACGTCACCATACATATMFS-1FbCCAGGAGAAGAAGTTAGAG29EHEC O104:H4毒力基因检测毒力基因检测5、aatAaatA-F:5-tgaaatgcttagtgagag-3510bpaatA-R:5-gatacccagactagcact-36、aggRaggR-F：5-GTATGAAATTAAAACAAACATCG-3800bpaggR-R:5-GTTTATTGGCTTTTAAAATAGTC-37、aapaap-F：5-ATGAAAAAAATTAAGTTTGTTATC

32、TT-3356bpaap-R：5-TTATTTAACCCATTCGGTTAGAGC-330EHEC O104:H4毒力基因检测毒力基因检测wzy-1agttcattagatcgaggtt450bpwzy-2ctccttgcaaatgtgcaaO104O104检测检测检测检测PCRPCR引物引物引物引物31EHEC O104:H4毒力基因检测毒力基因检测H4H4检测检测检测检测PCRPCR引物引物引物引物H4H4特异特异引物：引物：fliC-5fliC-5(5-TGAGTGACCAGACGATAACAGGG-3)(5-TGAGTGACCAGACGATAACAGGG-3)fliC-6fliC-6(5-GGACGATTAGTGGGTGAAATGAGG-(5-GGACGATTAGTGGGTGAAATGAGG-3)3)PCRPCR产物大小产物大小1243bp.1243bp.32EHEC O104:H4毒力基因检测（杜毒力基因检测（杜邦试剂盒）邦试剂盒）荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR反应体反应体反应体反应体系：系：系：系：将Forward Primer和Reverse Primer混合后用试剂盒提供的PCR buffer稀释至终浓度，取25ul取PCR buffer裂解后的增菌液25uL总反应体系50uL，直接加入带有PCR药片的反应管中。3334