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1、实验七 氨基酸的分离鉴定纸层析法 一 目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法二 原理 纸层析法是利用各物质不同的分配系数，使混合物随流动相时而得 到分离的方法。纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的。滤纸纤维与水亲和力较强，而与有机溶剂亲和力弱，所以纸层析以滤纸纤维和结合水为固定相，以有机溶剂为流动相。当有机相沿滤纸流动经过样品点时，样品点上的溶液在水相和有机相之间进行分配，样品移动速率与样品的极性及水亲和力有关，因此，极性氨基酸移动较慢，而非极性氨基酸移动较快。物质被分离后在纸层析图上的位置用Rf值表示 Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿距离 在一定条件下某种物质的Rf
2、值是常数 溶液前沿层析点 原点 溶剂前沿 苯丙氨酸 丙氨酸 天冬氨酸 一器材 1 层析缸 2 毛细管 3 喷雾器 4 培养皿 5 层析滤纸四操作步骤五 1 取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘2-3处用铅笔划一条直 六 线，在直线上约每隔3-4做一次记号，共记四次。七 2 用毛细管将各种氨基酸样品分别点在4个记号点上，干后再点八 一次。尽量点成圆形，并在各点表上样品名。九 3 手通过纸将滤纸卷成圆筒形，并用针缝，共3针。每缝一针打十 个结，第三针的线留长一点。十一 4 将缝好的纸（装入）垂直放入装有扩展剂的层析缸内（点样的十二 一端朝下，滤纸不应碰到缸壁）十三 5 约2个小时后，将滤纸取出，拆掉线
3、后，放入烘干机内烘干，约10分 钟后取出即显色。十四 6 画出溶液前沿线，确立个层析点中心，计算各氨基酸的Rf值 实验结果:丙氨酸苯丙氨酸天冬氨酸 L/d/Rf原点到溶剂前沿距离为L，原点到层析点中心距离为d 氨基酸的定量分析 甲醛滴定法一、目的：初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点 水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。甲醛可与氨基酸上的N+H3结合，形成NHCH2OH、N(CH2OH)2 等羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。二、实验原理若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法
4、滴定的结果算出氨基酸的含量。若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。三、材料、试剂与器具（一）试剂1、0.5%酚酞酒精溶液 称0.5g酚酞溶于100ml50%酒精中。2、0.1mol/L甘氨酸溶液 取3.75g甘氨酸溶于500ml蒸馏水。3、标准0.0200mol/L 氢氧化钠溶液4、中性甲醛溶液 取甲醛溶液50ml，加0.5%酚酞指示剂约3ml，滴加0.01mol/LNaOH溶液，使溶液呈微红色，临用前中和。（二）实验器具 锥形瓶、碱式滴定管、移液管洗耳球、天平 容
5、量瓶、试剂瓶、量筒、玻棒与烧杯四、操作步骤 1、取5只50ml锥形瓶，按下表加入试剂。锥形瓶编号 试剂123450.1mol/L甘氨酸溶液/mL01100中性甲醛溶液/mL11111水/mL322220.5%酚酞酒精溶液（滴）44444未知浓度的氨基酸混合溶液/mL000112、用0.0200mol/L NaOH溶液滴定至溶液变微红色 注意：滴定管中溶液的初始位置和滴定结束时的位置；滴定管的使用方法3、用0.0200mol/L NaOH溶液滴定至溶液变微红色4、记录每次滴定所用的0.0200mol/L NaOH溶液的 体积五、计算标准甘氨酸氨基氮的回收率=VNaoH*0.0200mol/L理论计算值*14.008理论计算值:取用氨基酸的体积乘以浓度,再乘以14.008VNaoH 两次测定所用氨基酸的体积的平均值每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为式中：V1为滴定样品消耗氢氧化钠的体积（ml）；V2为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）；MNaOH 标准NaOH溶液的摩尔浓度1、甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么？2、根据滴定结果，总结分析此法在实际应用中的 优缺点。3、为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的N+H3基上 的H+，不能用一般的酸碱指示剂？思考题