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1、篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统第十五章第十五章 酵母菌基因工程酵母菌基因工程篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式进行酵母菌是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物。共有无性繁殖的单细胞真核生物。共有5656属和属和500500多个种组成。酵母是最成熟的多个种组成。酵母是最成熟的真核生物表达系统。真核生物表达系统。第一节第一节 简介简介篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的
2、计时计分系统是一种得分类型的系统篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统1发展历程发展历程1.1.19741974，Rlarck-walkerRlarck-walker和和MiklosMiklos发现发现在大多数酵母中存在质粒。在大多数酵母中存在质粒。2.2.19781978，HmnenHmnen将来自一株酿酒酵母的将来自一株酿酒酵母的leu 2leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的补了
3、后者的Leu2Leu2缺陷，标志着酵母表缺陷，标志着酵母表达系统的建立。达系统的建立。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统3.3.19811981，HinnenHinnen等用酵母基因表达系统等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。表达了人干扰素。4.4.19831983，我国首次用酵母菌表达了乙型，我国首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。肝炎病毒表面抗原基因。5.5.19961996，完成了第一个真核生物，完成了第一个真核生物酿酿酒酵母全基因组的测序。酒酵母全基因组的测序。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多
4、少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统2酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统1.优势在于：优势在于：安全无毒，不致病；安全无毒，不致病；有较清楚的遗传背景，容易进行遗有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；传操作；篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统易进行载体易进行载体DNADNA的导入。的导入。DNADNA转化技转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率；以取得较高的转化率；篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里
5、得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统培养条件简单，容易进行高密度培养条件简单，容易进行高密度发酵；发酵；能将外源基因表达产物分泌到培能将外源基因表达产物分泌到培养基中；养基中；有类似高等真核生物的蛋白质翻有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。译后的修饰功能。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统2.缺陷在于：缺陷在于：表达效率相对低；表达效率相对低；酵母常有密码子偏爱性，真核基酵母常有密码子偏爱性，真核基因在其中表达时需要人工修正。因在其中表达时需要人工修正。篮球比赛是根据运动队在规定
6、的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统3酵母基因工程的发展现状酵母基因工程的发展现状目前酵母基因工程中发展和应用较多目前酵母基因工程中发展和应用较多有酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母等，其有酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母等，其应用主要体现在以下两方面：应用主要体现在以下两方面：篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统1.酿酒酵母的自身改造：酿酒酵母的自身改造：将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母（可自身分泌葡萄糖淀粉酶）。（可自身分泌葡萄糖淀粉酶）。将外源的蛋白水解酶基因导
7、入酿酒酵将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母（可自身分泌蛋白水解酶）母（可自身分泌蛋白水解酶）篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统将将-葡聚糖酶基因导入酿酒酵母葡聚糖酶基因导入酿酒酵母（可有效降解麦芽汁中的（可有效降解麦芽汁中的-葡聚葡聚糖，改善啤酒的过滤效率）糖，改善啤酒的过滤效率）篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统将将ATPATP硫酸化酶和腺苷酸硫酸激酶硫酸化酶和腺苷酸硫酸激酶在酿酒酵母体内表达（促进在酿酒酵母体内表达（促进SOSO2 2的生的生成
8、，维持啤酒风味的稳定）成，维持啤酒风味的稳定）篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统将人血清清蛋白（将人血清清蛋白（HASHAS）基因转化）基因转化到酿酒酵母（生产出富含到酿酒酵母（生产出富含HASHAS的啤的啤酒新品种）酒新品种）篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统2.2.酵母表达异源蛋白酵母表达异源蛋白表达水平表达水平:酵母表达系统主要用酵母表达系统主要用于表达外源基因，表达水平的高于表达外源基因，表达水平的高低直接关系到其应用价值。酵母低直接关系到
9、其应用价值。酵母的高效表达从三方面实现：的高效表达从三方面实现：篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统A.A.通过开发高效的启动子提高和控制通过开发高效的启动子提高和控制外源基因的转录水平。外源基因的转录水平。B.B.提高表达载体在细胞中的稳定性。提高表达载体在细胞中的稳定性。C.C.通过多次同源重组以及通过多次同源重组以及rDNArDNA介导的介导的整合两种方式提高表达基因在细胞整合两种方式提高表达基因在细胞中的拷贝数。中的拷贝数。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一
10、种得分类型的系统表达质量：除表达水平外，外源表达质量：除表达水平外，外源基因表达质量的好坏也直接关系基因表达质量的好坏也直接关系到酵母表达系统的应用价值。到酵母表达系统的应用价值。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统3.酵母基因工程的发展趋势酵母基因工程的发展趋势解决酵母基因工程中还存在的缺解决酵母基因工程中还存在的缺陷；陷；在人类基因组计划中的应用研究在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向；是一个重要的发展方向；篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类
11、型的系统利用酵母基因工程筛选更多的制利用酵母基因工程筛选更多的制药；药；改造酿酒酵母自身，降低生产酒改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本；精的成本；酵母的生理承受极限研究将引起酵母的生理承受极限研究将引起人们的关注。人们的关注。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用
12、的突变宿主菌 内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌 第二节、酵母菌的宿主系统第二节、酵母菌的宿主系统篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统1广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想 属名属名 举例举例酵母属酵母属 酿酒酵母酿酒酵母克鲁
13、维酵母属克鲁维酵母属 乳酸克鲁维酵母乳酸克鲁维酵母毕赤酵母属毕赤酵母属 巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母裂殖酵母属裂殖酵母属 非洲酒裂殖酵母非洲酒裂殖酵母汉逊酵母属汉逊酵母属 多态汉逊酵母多态汉逊酵母篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统2提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统利用经典诱变技术筛选分离酿酒酵母的
14、核突变株或细利用经典诱变技术筛选分离酿酒酵母的核突变株或细胞质突变株，可以提高重组异源蛋白在酵母菌中的合胞质突变株，可以提高重组异源蛋白在酵母菌中的合成产率。然而，有些在表型上能提高某种特定异源蛋成产率。然而，有些在表型上能提高某种特定异源蛋白表达的突变株未必具有促进其它外源基因表达的能白表达的突变株未必具有促进其它外源基因表达的能力，因为提高一种特定异源蛋白合成和分泌的影响因力，因为提高一种特定异源蛋白合成和分泌的影响因素极其复杂，其中包括表达产物本身的生物化学和生素极其复杂，其中包括表达产物本身的生物化学和生物物理特性，只有那些能促进任何外源基因分泌表达物物理特性，只有那些能促进任何外源基
15、因分泌表达的基因型稳定突变株，才能用作理想的基因工程受体的基因型稳定突变株，才能用作理想的基因工程受体细胞。细胞。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。核心和外侧糖链两部分组成。3抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的
16、计时计分系统是一种得分类型的系统篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修饰和加工系统对来自高等动物和人的异饰和加工系统对来自高等动物和人的异源蛋白活性表达是极为有利的，但野生源蛋白活性表达是极为有利的，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。化缺陷菌株非常重要。篮球比赛是根
17、据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统突变类型突变类型 生物效应生物效应 mnn mnn 甘露糖生物合成缺陷型甘露糖生物合成缺陷型 alg alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 och och 外侧糖链添加缺陷型外侧糖链添加缺陷型这些突变菌株不能在异源蛋白的天门冬酰这些突变菌株不能在异源蛋白的天门冬酰胺侧链上延长甘露多聚糖长链，这是酿酒胺侧链上延长甘露多聚糖长链，这是酿酒酵母超糖基化的一种主要形式。酵母超糖基化的一种主要形式。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一
18、种得分类型的系统含有含有mnn9mnn9突变的酵母菌细胞缺少能聚合外侧突变的酵母菌细胞缺少能聚合外侧糖链的糖链的a-1,6-a-1,6-甘露糖基转移酶活性，而甘露糖基转移酶活性，而och1och1突变株则不能产生膜结合型的甘露糖基转移突变株则不能产生膜结合型的甘露糖基转移酶。尽管其它类型的突变株尚未进行有效的酶。尽管其它类型的突变株尚未进行有效的鉴定，但它们却能使异源蛋白在天门冬酰胺鉴定，但它们却能使异源蛋白在天门冬酰胺侧链上进行有限度的糖基化作用，基本上杜侧链上进行有限度的糖基化作用，基本上杜绝了糖基外链无节制延长的超糖基化副反应。绝了糖基外链无节制延长的超糖基化副反应。篮球比赛是根据运动队
19、在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统4.4.减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用泛素介导的蛋白质降解作用篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统A.A.第第一一类类基基因因含含有有多多个个泛泛蛋蛋白白因因子子编编码码重重复复序序列列，各各重重复复序序列列头头尾尾相相连连形形成成多拷贝结构；多拷
20、贝结构；酵母菌的泛蛋白因子编码基因分为两大类：酵母菌的泛蛋白因子编码基因分为两大类：篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统B.B.第第二二类类基基因因为为单单一一泛泛蛋蛋白白因因子子编编码码序序列列与与另另一一个个不不相相关关的的多多肽肽编编码码序序列列的的融融合合基基因因，后后者者称称为为羧羧基基延延伸伸蛋蛋白白（CEPCEP），它它也也有有两两种种大大小小不不同同的的序序列列，其其中中CEP52CEP52由由5252个个氨氨基基酸酸残残基基组组成成，而而CEP76-80CEP76-80则由则由76-8076-80个氨基酸
21、残基组成。个氨基酸残基组成。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统在酵母菌中共有四个基因编码泛蛋白因子：在酵母菌中共有四个基因编码泛蛋白因子：UBI1UBI1和和UBI2UBI2编码融合蛋白泛蛋白编码融合蛋白泛蛋白-CEP52-CEP52UBI3UBI3编码泛蛋白编码泛蛋白-CEP76-CEP76UBI4UBI4则编码一个五聚体泛蛋白因子则编码一个五聚体泛蛋白因子篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统UBI1UBI1、UBI2UBI2和和UBI3UBI3基
22、因均能在酵母菌对基因均能在酵母菌对数生长期内表达，当菌体进入稳定期后数生长期内表达，当菌体进入稳定期后便自动关闭，便自动关闭，UBI4UBI4的表达时序与前三种的表达时序与前三种基因恰好相反，这说明四种基因编码产基因恰好相反，这说明四种基因编码产物的生物学功能并不完全相同。物的生物学功能并不完全相同。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统A.A.第一类基因包括第一类基因包括UBC4UBC4、UBC5UBC5和和UBC7UBC7，其编，其编码产物只拥有相应的保守结构域，多肽序码产物只拥有相应的保守结构域，多肽序列的其它区域并没
23、有明显的同源性，这些列的其它区域并没有明显的同源性，这些蛋白形成泛蛋白蛋白形成泛蛋白-靶蛋白共价接合物的活靶蛋白共价接合物的活性严格依赖于性严格依赖于E3E3蛋白的存在；蛋白的存在；几个编码泛蛋白因子接合酶系统的酵母菌基因（几个编码泛蛋白因子接合酶系统的酵母菌基因（UBCUBC）篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统B.B.第二类基因包括第二类基因包括UBC1UBC1、UBC2UBC2、UBC3UBC3和和UBC6UBC6，它们的表达产物具有天然的，它们的表达产物具有天然的C C端端延伸活性，不需要延伸活性，不需要E2E2蛋
24、白的参与便可蛋白的参与便可进行泛蛋白的接合反应。进行泛蛋白的接合反应。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统如果外源基因表达产物在酵母菌中如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依赖型降解作用的敏具有对泛蛋白依赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使这种降感性，则可通过下列方法使这种降解作用减少到最低程度：解作用减少到最低程度：篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统A.第一种方法是以分泌的形式表达第一种方法是以分泌的形式表达重组异源蛋白，异源蛋白在与泛重
25、组异源蛋白，异源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，蛋白因子形成共价结合物之前，迅速被转位到分泌器中，即可有迅速被转位到分泌器中，即可有效避免降解作用；效避免降解作用；篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统B.B.第二种方法是将外源基因的表达置第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的启动子控制之下，于一个可诱导的启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表达，由于异源蛋白质在短期内集中表达，分子数占绝对优势的表达产物便能分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛蛋白因子的束缚，从而减少逃脱泛蛋白因子的束缚，从而减少由降解效应
26、带来的损失；由降解效应带来的损失；篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统C.C.第三种方法是使用泛蛋白因子生物第三种方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突变株作为外源基因表合成缺陷的突变株作为外源基因表达的受体细胞。达的受体细胞。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统A.A.UBI4UBI4缺缺陷陷型型：在在酿酿酒酒酵酵母母菌菌中中，泛泛素素主主要要由由UBI4UBI4基基因因表表达达，UBI4-UBI4-突突变变株株正正常常生生长长，但但细细胞胞内内游游离
27、离泛泛素素分分子子的的浓浓度度比比野野生生株株要要低低的的多多，因因此此UBI4UBI4缺缺陷陷突变株是外源基因表达理想的受体。突变株是外源基因表达理想的受体。减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌：减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌：泛素降解途径衰减的酿酒酵母泛素降解途径衰减的酿酒酵母篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统B.B.UBA1UBA1缺缺陷陷型型：UBA1UBA1编编码码泛泛素素激激活活酶酶E1E1，UBA1UBA1突突变变株株式式致致死死性性的的，但但其其等等位位基基因因缺缺陷陷是是非非致致死
28、死性性的的，而而且且也能削弱泛素介导的蛋白降解。也能削弱泛素介导的蛋白降解。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统C.C.Ubc4-ubc5Ubc4-ubc5双双 突突变变型型：七七个个泛泛素素连连接接酶酶基基因因的的突突变变对对衰衰减减蛋蛋白白降降解作用同样有效。解作用同样有效。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统5内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌
29、内源性蛋白酶缺陷型的突变受体菌 酿酒酵母拥有二十多种蛋白酶，酿酒酵母拥有二十多种蛋白酶，尽管不是所有的蛋白酶都能降解外源尽管不是所有的蛋白酶都能降解外源基因表达产物，但实验结果表明有些基因表达产物，但实验结果表明有些蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳蛋白酶缺陷有利于重组异源蛋白的稳定表达。定表达。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统将将大大肠肠杆杆菌菌的的lacZlacZ作作为为报报告告基基因因分分别别导导入入两两株株具具有有相相同同遗遗传传背背景景的的酿酿酒酒酵酵母母菌菌中中，其其中中一一株株含含有有编编码码空空泡泡蛋蛋白
30、白酶酶基基因因PEP4PEP4的的野野生生型型菌菌株株，另另一一株株则则为为pep4-3pep4-3突突变变株株，比比较较这这两两株株菌菌中中b-b-半半乳乳糖糖苷苷酶酶的的活活性性，在在同同等等试试验验条条件件下下pep4-3pep4-3突突变变株株中中的的b-b-半半乳乳糖糖苷苷酶酶活活性性明明显显高高于于PEP4+PEP4+的的野野生生菌菌，而而且且在在间间歇歇式式发发酵酵罐罐中中，pep4-3pep4-3突突变变株也能长到相当高的密度。株也能长到相当高的密度。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统PEP4PEP4蛋白
31、酶除了具有降解蛋白质的功能外，还蛋白酶除了具有降解蛋白质的功能外，还能对某些重组异源蛋白进行加工。例如，能对某些重组异源蛋白进行加工。例如，MFa1-MFa1-人神经生长因子（人神经生长因子（hNGFhNGF）原前体的融合蛋白只能）原前体的融合蛋白只能在在pep4pep4突变株细胞中进行正确的加工剪切，这说突变株细胞中进行正确的加工剪切，这说明明PEP4PEP4蛋白酶或者细胞内其它一些被蛋白酶或者细胞内其它一些被PEP4PEP4蛋白酶蛋白酶激活和修饰的蛋白酶系统与重组异源蛋白的正确激活和修饰的蛋白酶系统与重组异源蛋白的正确加工剪切过程有关。加工剪切过程有关。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间
32、里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统第三节、酵母菌的载体系统第三节、酵母菌的载体系统载体的一般结构：载体的一般结构：选择标记选择标记复制子复制子表达盒表达盒启动子启动子先导序列先导序列终止子终止子有用的蛋白结构域有用的蛋白结构域篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统1酵母菌种的野生型质粒酵母菌种的野生型质粒1.1.酿酒酵母中的酿酒酵母中的22环状质粒环状质粒几乎所有的酿酒酵母都含有几乎所有的酿酒酵母都含有22双链双链环状质粒，拷贝数维持环状质粒，拷贝数维持50-10050-100个。个。篮
33、球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统IrsIrs反向重复序列反向重复序列600bp600bp，重组，重组FLPFLP编编码产物驱动码产物驱动IrsIrs的同源重组，的同源重组，REPREP编编码产物控制质粒的稳定性，码产物控制质粒的稳定性，STBSTB是是REPREP的结合位点。的结合位点。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统接合酵母属中的接合酵母属中的pSRIpSRI、pSR1pSR1、pSB2pSB2和和pSR1pSR1以及克鲁维酵母属中的以及克鲁维
34、酵母属中的pKD1pKD1质粒等，均有类似的结构。质粒等，均有类似的结构。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统 2.乳酸克鲁维酵母中的线性质粒乳酸克鲁维酵母中的线性质粒乳乳酸酸克克鲁鲁维维酵酵母母中中含含有有两两种种不不同同的的双双链链线线性性质质粒粒pGKL1pGKL1和和pGKL2pGKL2，拷拷贝贝数数为为50-10050-100个个，分分别别携携带带K1K1和和K2K2两两种种能能致致死死宿宿主主细细胞胞的的
35、毒毒素素蛋白基因。蛋白基因。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统2酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建能在大肠杆菌中克隆，并且具有能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数，可使外源基因转较高的拷贝数，可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增；中扩增；1.酵母克隆表达质粒的特点：酵母克隆表达质粒的特点：篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统含有在酵母中便于选择的遗传标记，含有在酵母中便于选择的遗传标记，这些标
36、记一般能和酵母相应的突变体这些标记一般能和酵母相应的突变体互补，如互补，如Leu+Leu+、His+His+、Ura+Ura+、Trp+Trp+等，等，有些还携带用于大肠杆菌的抗生素抗有些还携带用于大肠杆菌的抗生素抗性标记；性标记；篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统含有合适的限制酶切位点，以便外源含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。基因的插入。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统ARSARS为酵母菌中的自主复制序列，大为酵母菌中的自主复制序列
37、，大小在小在0.8-1.5Kb,0.8-1.5Kb,染色体上每染色体上每30-40bp30-40bp就有一个就有一个ARSARS元件。元件。2.2.含有含有ARSARS的的YRpYRp和和YEpYEp质粒及其构建质粒及其构建篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统由染色体由染色体ARSARS构成的质粒称为构成的质粒称为YRpYRp，而，而由由22质粒构建的杂合质粒为质粒构建的杂合质粒为YEpYEp。上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达最高可达200200个，但是经过几代培养个，但是经过几代培
38、养后，质粒丢失率达后，质粒丢失率达50%-70%50%-70%，主要由，主要由于分配不均匀所致。于分配不均匀所致。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统CENCEN为酵母菌染色体为酵母菌染色体DNADNA上与染色体上与染色体均匀分配有关的序列。将均匀分配有关的序列。将CENCEN插入到插入到ARSARS质粒中，获得的新载体称为质粒中，获得的新载体称为YCpYCp。YCpYCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数通常只有但拷贝数通常只有1-51-5个。个。3.3.含有含有CENCEN的的YCpY
39、Cp质粒的构建质粒的构建篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统利用酵母菌的端粒利用酵母菌的端粒TEL.CEN.ARSTEL.CEN.ARS等等DNADNA元件构建人工酵母染色体，可以克隆元件构建人工酵母染色体，可以克隆扩增大片段的外源扩增大片段的外源DNADNA，这是构建，这是构建YACYAC载体的基本思路载体的基本思路YACYAC载体的装载量可高达载体的装载量可高达800kb800kb，适用，适用于构建人的基因组文库。于构建人的基因组文库。4.4.含有含有TELTEL的的YACYAC质粒的构建质粒的构建篮球比赛是根据运动队
40、在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统5.5.整合型质粒载体整合型质粒载体YIPYIP及其构建及其构建YIP YIP 载载体体由由大大肠肠杆杆菌菌质质粒粒和和酵酵母母的的 DNA DNA 片片段段组组成成，可可与与受受体体或或宿宿主主的的染染色色体体 DNA DNA 同同源源重重组组，整整合合进进入入宿宿主主染染色色体体中中，酵酵母母片段只提供选择性标志，没有复制起点。片段只提供选择性标志，没有复制起点。转转化化率率低低（只只有有1-101-10转转化化子子/微微克克DNADNA），但转化子遗传性稳定，多用于遗传分析。但转化子遗传性稳定，多用于
41、遗传分析。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统6.6.复制型质粒载体复制型质粒载体YRPYRP及其构建及其构建同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，又称穿梭载体；因，又称穿梭载体；带有选择标记和复制子的酵母的带有选择标记和复制子的酵母的DNADNA片片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。段插入到大肠杆菌质粒中构成的。优缺点：转化率高，拷贝也高，但不稳优缺点：转化率高，拷贝也高，但不稳定，易丢失。定，易丢失。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是
42、一种得分类型的系统篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统7.7.附加体型质粒载体附加体型质粒载体YEPYEP及其构建及其构建由大肠杆菌质粒、由大肠杆菌质粒、2u2u质粒以及酵母染色质粒以及酵母染色体的选择标记构成。体的选择标记构成。2u2u质粒含有自主复制起始区（质粒含有自主复制起始区（OriOri）和）和STBSTB区，区，STBSTB序列能够使质粒在供体细胞序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。中维持稳定。对酵母基因很高的转化活性，比对酵母基因很高的转化活性，比YRPYRP型载型载体更稳定，拷贝数也高，是基因克隆中体更稳定
43、，拷贝数也高，是基因克隆中的常用载体。的常用载体。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统YEp13质粒篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统载体载体PYF92PYF92：酵母的酵母的2 2质粒质粒pBR322pBR322质粒质粒酵母的酵母的His+His+基因基因篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统
44、是一种得分类型的系统8.8.酵母人工染色体载体（酵母人工染色体载体（YAC YAC）YAC YAC 载载体体是是由由酵酵母母染染色色体体中中分分离离出出来来的的 DNA DNA 复复制制起起始始序序列列、着着丝丝点点、端端粒粒以以及及酵酵母母选选择择性性标标记记组组成成的的能能自自我我复复制制的的线线性性克克隆隆载载体体。YAC YAC 载载体体是是以以质质粒粒的的形形式式出出现现，长长度度约约 11.4kb 11.4kb，带带有有人人工工染染色色体体所所需需的的一一切切元元件件。每每个个 YAC YAC 载载体体可可以以装装进进 100 100 万万碱碱基基以以上上的的大大片片段段 DNA
45、DNA，比比柯柯斯斯质质粒粒的的装装载载能能力力要要大大得多。得多。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统复制元件：复制元件：YAC YAC 载体的复制元件是其核心组成成分载体的复制元件是其核心组成成分自主复制序列自主复制序列用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒两个端粒两个端粒标标记记基基因因：主主要要采采用用营营养养缺缺陷陷型型基基因因，Trp+Trp+、Leu+Leu+、His+His+、Ura+Ura+等等篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计
46、分系统是一种得分类型的系统篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统第四节、酵母菌的转化系统第四节、酵母菌的转化系统1酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序2转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运3用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统1酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序1.1.酵母菌原生质体转化法酵
47、母菌原生质体转化法早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质球转化法。在稳定的原生质球转化法。在CaCa2+2+和和PEGPEG的的存在下，转化细胞可达存活的原生质球总存在下，转化细胞可达存活的原生质球总数的数的1%-5%1%-5%。但是操作周期长，而且转化。但是操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。效率受到原生质再生率的严重制约。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统酿酒酵母的碱金属细胞经碱金属离子酿酒酵母的碱金属细胞经碱金属离子（如（如Li+Li+等）、等）、PEG
48、PEG热休克处理后，也热休克处理后，也可高效吸收质粒可高效吸收质粒DNADNA。2.2.碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统酵酵母母菌菌原原生生质质体体和和完完整整细细胞胞均均可可在在电电击击条条件件下下吸吸收收质质粒粒DNADNA，但但在在此此过过程程中中应应避避免免使使用用PEGPEG，它它对对受受电电击击的的细细胞胞具具有有较较大大的的负负作作用用。其其优优势势在在于于不不依依赖赖于于受受体体细细胞胞的的遗遗传传特特征征及及培培养养条条件件适适用
49、用范范围围广，而且转化率高达广，而且转化率高达10105 5转化子转化子/gDNA/gDNA。3.3.酵母菌电击转化酵母菌电击转化篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统2转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运1.单双链单双链DNA均可高效转化酵母菌，但均可高效转化酵母菌，但单链单链DNA的转化率是双链的的转化率是双链的1030倍。倍。2.含有酵母复制子的单链质粒进入细胞含有酵母复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制。后，能准确地转化为双链并复制。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定
50、胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统3.3.不含复制子的单链质粒进入细胞后，不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体，这对能高效地同源整合入染色体，这对于体内定点突变酵母基因组极为有于体内定点突变酵母基因组极为有利。利。篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统4.4.同源重组的频率取决于整合型质粒同源重组的频率取决于整合型质粒与受体菌基因组之间的同源程度以与受体菌基因组之间的同源程度以及同源区域长度，一般来说，整合及同源区域长度，一般来说，整合子占转化子总数的子占转化子总数的5080%。篮球