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1、广州医学院免疫检验教研室广州医学院免疫检验教研室 冯健明冯健明 讲师讲师 时间分辨荧光技术时间分辨荧光技术一、回顾标记免疫学发展一、回顾标记免疫学发展标记免疫技术的检测水平标记免疫技术的检测水平放射免疫放射免疫（精度：（精度：10-12mol/L）酶联免疫酶联免疫（精度：（精度：10-9 mol/L）化学发光化学发光（精度：（精度：10-15mol/L）电化学发光电化学发光（精度：（精度：10-17mol/L）时间分辨荧光（精度：时间分辨荧光（精度：10-18mol/L）放射性免疫分析法（放射性免疫分析法（RIARIA）应应应应 用用用用放免自放免自60年代问世以年代问世以来对临床诊断起了革来
2、对临床诊断起了革命性的贡献，是一项命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。较为成熟的诊断技术。夹心法、竞争法的标夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测记原理为以后的检测技术的发展奠定了基技术的发展奠定了基础。础。问问问问 题题题题放射性（放射性（125 I），），对环对环境的污染及对身体的境的污染及对身体的危害危害125125 I 的半衰期短而导的半衰期短而导致其试剂有效期短致其试剂有效期短被标记物的稳定性差被标记物的稳定性差操作繁琐，费时操作繁琐，费时无法保存备用无法保存备用酶免疫分析法（酶免疫分析法（ELISAELISA）应应应应 用用用用酶免的最大优势在于避酶免的最大优势在于避免了对环境和人
3、体危害免了对环境和人体危害试剂有效期较长试剂有效期较长曾经一度被认为是取代曾经一度被认为是取代放免的检测手段放免的检测手段问问问问 题题题题灵敏度、重复性不及放灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳免，易造成漏检和假阳性性因酶的纯度和反应过程因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，容易受环境因素影响，导致稳定性不好导致稳定性不好化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法（chemiluminescentchemiluminescent immunoassay immunoassay）应应应应 用用用用单个样本检测速度快，适合做单个样本检测速度快，适合做急诊急诊灵敏度较高灵敏度较高自动化程度高自动化
4、程度高分类：分类：以丫啶酯直接标记以丫啶酯直接标记以以HRP标记，鲁米诺为发标记，鲁米诺为发光底物光底物Amerlite系统系统以以AP(碱性磷酸酶碱性磷酸酶)为标记为标记物，物，AMPPD为发光底物为发光底物问问问问 题题题题样品不能重复检测样品不能重复检测本底较高本底较高仪器故障率较高仪器故障率较高试剂稳定性较差试剂稳定性较差检测精度不高，在超微检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面量分析及早期诊断方面能力不足能力不足非开放性试剂；试剂价非开放性试剂；试剂价格高格高电化学发光免疫分析法电化学发光免疫分析法（ECLECL）应应应应 用用用用80年代末期问世的新型化年代末期问世的新型化学发光
5、免疫分析方法学发光免疫分析方法基本原理：根据三联吡啶基本原理：根据三联吡啶钌钌Ru(bpy)3和三丙胺在和三丙胺在电场触发下产生发光的化电场触发下产生发光的化学发光反应学发光反应本底较小、灵敏度较高、本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽线性范围较宽以罗氏为代表以罗氏为代表缺缺缺缺 点点点点非开放性试剂系统、不非开放性试剂系统、不能做科研能做科研试剂价格过高试剂价格过高二、时间分辨荧光技术二、时间分辨荧光技术 （Time-Resolved Fluorescence）时间分辨荧光发展史时间分辨荧光发展史 19791979年，年，提出提出“时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析”理理论，论，1989
6、1989年该技术获诺贝尔化学奖提名。年该技术获诺贝尔化学奖提名。9090年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵敏度高，操作简便，标准曲线范围宽，不受样敏度高，操作简便，标准曲线范围宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。法学研究和临床应用的发展十分迅速。时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研究中最有发展前景的分析手段究中最有发展前景的分析手段时间分辨免疫荧光技术的定义时间分辨免疫荧光技术的定义用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，标用三价稀土
7、离子及其螯合物作为示踪物，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应、当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应、核酸探针杂交等反应，经解离核酸探针杂交等反应，经解离增强作用，增强作用，用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强度度根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的的TRFTRF分析原理图（分析原理图（1 1）加样本加样本振荡、洗板振荡、洗板加入加入Eu标标VVEu标记物轻链轻链螯合剂
8、螯合剂Eu重链重链振荡、洗板振荡、洗板V加入解离增强液加入解离增强液仪器检测仪器检测标记物为稀土金属标记物为稀土金属-镧系元素镧系元素 铕铕(EuEu)、钐（钐（SmSm)、镝、镝(DyDy)、锝、锝(Tb)(Tb)镧系元素荧光特点：镧系元素荧光特点：1 1、荧光寿命极长、荧光寿命极长镧系元素螯合物（镧系元素螯合物（6060900 us)900 us)714us普通荧光免疫中荧光团：普通荧光免疫中荧光团：1 1100us100us样本中蛋白质荧光：样本中蛋白质荧光：1 110us10us，易猝灭易猝灭利用镧系元素荧光物利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后理特性，荧光激发后在固定时间段检测特在固
9、定时间段检测特异性荧光而在此时间异性荧光而在此时间之前，非特异性荧光之前，非特异性荧光已完全衰减为已完全衰减为0 0TRF分析原理图（分析原理图（2）标记物为稀土金属标记物为稀土金属-镧系元素镧系元素2 2、StokesStokes位移大位移大（大约（大约290290nmnm）铕：激发光铕：激发光340340nmnm、发射光发射光613613nmnm荧光荧光素的素的StokesStokes位移位移为为280280nmnm3 3、荧光特异性强荧光特异性强（发射光谱带很窄：（发射光谱带很窄：615 615 5 5nmnm）4 4、解离解离-增强技术增强技术可使其荧光性提高可使其荧光性提高10010
10、0万万倍倍巨大巨大StokesStokes位移位移发射光谱与激发发射光谱与激发光谱间存在的巨光谱间存在的巨大大StokesStokes位移。位移。可以通过干涉滤可以通过干涉滤光片将发射光谱光片将发射光谱与激发光谱完全与激发光谱完全分离分离TRFIATRFIA为临床检测带来的先进性为临床检测带来的先进性技术技术特点特点检验先进性检验先进性时间分辨时间分辨光谱分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧特异性荧光与非特异性荧光分离光分离发射荧光与激发光分离发射荧光与激发光分离零背景、高特异性零背景、高特异性高灵敏度高灵敏度解离解离-增强增强荧光性大大提高荧光性大大提高稳定的荧光螯合物稳定的荧光螯合物线性范围
11、宽线性范围宽高灵敏度高灵敏度原子标记原子标记 标记位点多，可达标记位点多，可达20个个 对标记物结构及活性影对标记物结构及活性影响小响小 无衰变无衰变 受环境影响小受环境影响小高稳定性，高精确度高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长标准曲线保留时间长同一批次可两点定标同一批次可两点定标多标记多标记单，双，三，四标记单，双，三，四标记同一试剂盒可同时测同一试剂盒可同时测多个项目多个项目灵敏度更高，检测范围更广灵敏度更高，检测范围更广 以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书 试剂试剂 DELFIA（WALLC）Immu
12、lite（DPC化学发光）化学发光）ACS-180(拜拜尔）尔）AFP0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/mlCEA0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/mlHCG0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L TSH0.005-100U/ml 0.002-75U/ml 0.03-150U/mlFSH0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/mlProg0.08-120nmol/L 无无 0.1-40ng/ml Prolactin0.04-250ng/ml 0.5-150
13、ng/ml 0.3-200ng/ml时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500 U/L 51002000Cps.10 3DELFIA hFSHN=6标准曲线稳定，试剂保质期时间长标准曲线稳定，试剂保质期时间长时间分辨荧光与化学发光方法学比较时间分辨荧光与化学发光方法学比较 时间分辨荧光时间分辨荧光时间分辨荧光时间分辨荧光 化学发光化学发光化学发光化学发光发光效率发光效率 95%1%重复检测重复检测 可无数次可无数次 不可重复不可重复本底噪声本底噪声 零本底零本底 干扰大干扰大灵敏级数灵敏级数
14、 10-18 10-15标记物标记物 原子原子 大分子化合物大分子化合物标记位点标记位点 可达可达20个个/抗体抗体 1个个/抗体抗体标准曲线标准曲线 稳定达一年以上稳定达一年以上 稳定稳定 2 到到 4周周多标记多标记 有，最多可达四标记有，最多可达四标记 无无科研开发科研开发 有有 无无时间分辨荧光和电化学发光的比较时间分辨荧光和电化学发光的比较 时间分辨荧光时间分辨荧光时间分辨荧光时间分辨荧光 电化学发光电化学发光电化学发光电化学发光标记物标记物四种原子四种原子:Eu,Sm,Tb,Dy一种原子一种原子:钌钌多标记技术多标记技术 有有 无无做科研做科研能能(1000多种科研项目多种科研项目
15、)无无 试剂种类试剂种类58种临床种临床,24种科研种科研,28种临床种临床,无科研试剂无科研试剂 共共82种种试剂价格试剂价格 低低 高高时间分辨荧光免疫时间分辨荧光免疫-突出优点突出优点零本底、灵敏度高零本底、灵敏度高线性范围宽线性范围宽试剂有效期长试剂有效期长标准曲线稳定性好标准曲线稳定性好易于自动化易于自动化对环境及人体没有任何影响对环境及人体没有任何影响TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。三、时间分辨荧光免疫技术三、时间分辨荧光免疫技术的临床应用的临床应用 (临床检测
16、试剂盒简介临床检测试剂盒简介)内分泌科检查 1、甲状腺功能系列、甲状腺功能系列 T3 三碘甲状原氨酸三碘甲状原氨酸T4 甲状腺素甲状腺素FT3 游离三碘甲状原氨酸游离三碘甲状原氨酸FT4 游离甲状腺素游离甲状腺素TSH-U 促甲状腺素促甲状腺素(超敏感超敏感)TBG Ab 甲状腺结合球蛋白甲状腺结合球蛋白TPO Ab 甲状腺过氧化物酶甲状腺过氧化物酶时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍临床意义概述临床意义概述：甲甲状状腺腺是是人人体体一一个个重重要要的的内内分分泌泌腺腺，也也是是最最大大的的内内分分泌泌腺腺体体，甲甲状状腺腺疾疾病病也也是是目目前前最最常常见见最最多
17、多发发一一种种内内分分泌泌疾疾病病，对对人人体体的的正正常常功功能能可可产产生生明明显显影影响响，甚至危及生命。甚至危及生命。以以上上各各项项目目的的联联合合检检测测，为为临临床床医医生生对对病病患患者者甲甲状状腺功能的评价提供更基础、全面的依据。腺功能的评价提供更基础、全面的依据。时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍2、糖尿病系列、糖尿病系列 InS 胰岛素胰岛素 CP C肽肽 临床意义概述：临床意义概述：了解残留胰岛了解残留胰岛细胞的功能，特别是用于区分胰细胞的功能，特别是用于区分胰岛素依赖型糖尿病岛素依赖型糖尿病(IDDM)IDDM)和非胰岛素依赖型糖尿和非胰
18、岛素依赖型糖尿病病(NIDDM);NIDDM);用于胰岛素瘤的诊断等。用于胰岛素瘤的诊断等。时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍 时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍3、生长激素、生长激素 hGH 生长激素生长激素 临床意义概述：临床意义概述：对诊断肢端肥大症是一项特异的方法；对诊断肢端肥大症是一项特异的方法；hGH低低下下还还见见于于侏侏儒儒症症和和垂垂体体前前叶叶功功能能减减退退症症如如席席汉综合征等。汉综合征等。妇产科检查（性激素）hCG 绒毛膜促性腺激素绒毛膜促性腺激素 LH-Spec 黄体生成素黄体生成素(特异性特异性)FSH
19、促卵泡激素促卵泡激素 PRL 催乳素催乳素 E2 雌二醇雌二醇 Testo 睾酮睾酮 Prog 孕酮孕酮 SHBG 性激素结合球蛋白性激素结合球蛋白时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍临床意义概述临床意义概述性激素是由性器官或肾上腺皮质分泌的，维持和调性激素是由性器官或肾上腺皮质分泌的，维持和调节机体内正常生命，生理活动和生殖功能的一类甾节机体内正常生命，生理活动和生殖功能的一类甾体激素。体激素。检测这些激素的含量对于生殖生理的研究、疾病的检测这些激素的含量对于生殖生理的研究、疾病的诊断、治疗、随访及计
20、划生育工作的开展具有重要诊断、治疗、随访及计划生育工作的开展具有重要的意义。的意义。肿瘤科检查 AFP 甲胎蛋白甲胎蛋白 PSA 前列腺特异抗原前列腺特异抗原 B2-M Beta 2微球蛋白微球蛋白 NSE 神经元烯醇化酶神经元烯醇化酶 PAP 前列腺酸性磷酸酶前列腺酸性磷酸酶 CEA 癌胚抗原癌胚抗原 PSA Free/total 前列腺特异抗原前列腺特异抗原/总量总量时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍临床意义概述：临床意义概述：肿瘤标志物（肿瘤标志物（Tumor Markers,TM)是指示体内肿瘤存是指示体内肿瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物质。通过测定
21、其在并反映其一定的生物特性的生化物质。通过测定其存在或含量，对于肿瘤可辅助诊断，分析病情，指导存在或含量，对于肿瘤可辅助诊断，分析病情，指导治疗，监测复发或转移及判断预后等。对现有治疗，监测复发或转移及判断预后等。对现有TM项目项目进行综合分析、多元分析，筛选出有价值的进行综合分析、多元分析，筛选出有价值的TM，确定确定一个最佳组合方式具有极大的临床意义。一个最佳组合方式具有极大的临床意义。时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍遗传科检查1、产前筛查产前筛查 PAPP-A 妊娠相关血浆蛋妊娠相关血浆蛋 Free hCGBeta 游离绒毛膜促性腺激素游离绒毛膜促性腺激素
22、 亚单位亚单位 AFP 甲胎蛋白甲胎蛋白 E3 游离雌三醇游离雌三醇h AFP/Free hCG 甲胎蛋白甲胎蛋白/游离绒毛膜促性腺激素游离绒毛膜促性腺激素 亚单位亚单位 临床意义概述：临床意义概述：是是预预防防患患有有严严重重遗遗传传性性疾疾病病和和先先天天畸畸形形胎胎儿儿出出生生的的一一项项有有效效措措施施。随随着着产产前前诊诊断断技技术术的的不不断断完完善善，产产前前诊诊断断不不仅仅为为患患儿儿的的出出生生提提供供了了客客观观依依据据，也也使使医医师师能能在在分分娩娩过过程中和分娩后给予合适的处理。程中和分娩后给予合适的处理。时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介
23、绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍2、新生儿筛查、新生儿筛查 Neoneotal hTSH 新生儿筛查促甲状腺素新生儿筛查促甲状腺素 Neoneotal T4 新生儿筛查甲状腺素新生儿筛查甲状腺素 Neoneotal 17-OH-Prog 17-羟基酮羟基酮 Neoneotal PKU 新生儿筛查苯丙氨酸新生儿筛查苯丙氨酸临床意义概述：临床意义概述：通通过过先先进进的的实实验验室室检检测测及及早早发发现现某某些些危危害害严严重重的的先先天天性性遗遗传传代代谢谢性性疾疾病病，从从而而早早期期诊诊断断、早早期期治治疗疗，避避免免宝宝宝宝因因脑脑、肝肝、肾肾等等损损害
24、害导导致致智智力力、体体力力发发育育障碍甚至死亡。障碍甚至死亡。血液科检查1、贫血检查贫血检查 Ferritin 铁蛋白铁蛋白 Vit B12 维生素维生素B12 folate 叶酸叶酸2、白白血血病病分分型型、免免疫疫细细胞胞分分型型、细细胞胞毒毒试试验等验等其它科研时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍传染科检查 乙肝系列乙肝系列 HBsAg 表面抗原表面抗原 HBsAb 表面抗体表面抗体 HBeAg e抗原抗原 HBeAb e抗体抗体 HBcAb 核心抗体核心抗体 开发中：抗开发中：抗HBcIgM
25、临床意义概述：临床意义概述：为为乙乙型型肝肝炎炎临临床床早早期期诊诊断断和和治治疗疗提提供供病病原原学学依依据据。能能动动态态观观察察疗疗效效和和监监测测病病情情，对对乙乙肝肝疫疫苗苗免免疫疫力力的的评评价和高危人群预防免疫具有重要意义。价和高危人群预防免疫具有重要意义。泰莱泰莱-I I型时间分辨系统型时间分辨系统泰莱泰莱-型时间分辨系统型时间分辨系统使用使用TRFIATRFIA的理由的理由一、专为中国医院量身定制一、专为中国医院量身定制仪仪器器、试试剂剂的的国国产产化化，更更适适应应我我国国国国情情，为为各各级级医医院院开开展展高高灵灵敏敏度度的的特特种种检检验验提提供供可可行行、低低成本的
26、方案。成本的方案。二、先进的方法学二、先进的方法学TRF因因其其更更灵灵敏敏、方方法法更更特特异异，技技术术更更简简单单、操作更方便、成本更低所以更具生命力。操作更方便、成本更低所以更具生命力。使用使用TRFIATRFIA的理由的理由三、可测项目多三、可测项目多开开放放性性试试剂剂系系统统；试试剂剂多多达达72种种，其其中中临临床床48种种，科科研研24种种，能能做做1000多多项项科科研研项项目目，比比美美大大型型免免疫疫分分析析仪仪。有有助助于于推推进进我我国国基基础础医医学学与与临临床床医医学学的的发发展展，并并为为提提高高人人民民的的健健康水平和改善人民的生活质量做出贡献。康水平和改善
27、人民的生活质量做出贡献。四、对操作人员没有伤害四、对操作人员没有伤害使用使用TRFIATRFIA的理由的理由五、试剂有效期长、标准曲线稳定五、试剂有效期长、标准曲线稳定低低分分子子量量原原子子标标记记，标标记记位位点点可可达达20个个/抗抗体体对对标标记记物物的的结结构构与与活活性性影影响响小小，无无衰衰变变，决决定定了了试试剂剂的的高高稳稳定定性性。减减少少了了因因定定标标和和试试剂剂保保存存期期短短而而造成的试剂浪费。造成的试剂浪费。六、结果可靠六、结果可靠方方法法学学的的优优异异性性、高高灵灵敏敏度度、可可重重复复测测试试，更更宽宽的检测线性范围，受环境因素影响更少。的检测线性范围，受环境因素影响更少。专家评价专家评价 主主要要技技术术性性能能已已达达到到国国外外同同类类型型半半自自动动测测试试仪仪的的先先进进水水平平。具具有有国国内内领领先先水水平平，特特别别是是其其操操作作系系统统实实现现了了全全中中文文WindowsWindows界界面面下下的的操操作作与与数数据据处处理理，更更为为适适应应国国内医院使用，为国内首创。内医院使用，为国内首创。谢谢！谢谢！