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1、DNA重组技术目的基因与载体 的连接及重组体转入受体细胞 第一部分 黏端连接 平端连接 DNA重组技术 目的基因与载体的连接 黏-平端连接 连接利用DNA连接酶把目的基因与载体共价连接成一个完整的重组体分子。T4 DNA连接酶 从噬菌体T4感染的大肠杆菌中分离纯化获得。大肠杆菌DNA连接酶 直接从大肠杆菌中分离纯化的连接酶。DNADNA重组技术目的基因与载体的连接 ATP依赖的T4 DNA连接酶 黏性末端连接单一相同黏端连接 目的DNA序列两端和线性化载体两端由同一RE（或同切点酶、同尾酶）切割所致 单一相同黏端的产生：单一相同黏端 连接结果 载体自连（载体自身环化）目的DNA片段自连 载体与
2、目的DNA 连接 黏性末端连接单一相同黏端连接 举例：T4 DNA连接酶 16 C Bam H切割反应 GGATCC CCTAGG GATCC G G CCTAG+目的基因用 Bam H切割 GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体DNA用Bam H切割 GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体 GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连 目的基因自连 黏性末端连接不同黏端连接 用两种不同的RE分别切割载体和目的
3、DNA，可使载体和目的DNA两端均形成两个不同的黏端。不同黏端的产生：不相同黏端 连接结果 载体与目的DNA 连接 使目的基因按特定方向插入载体的克隆方法。定向克隆（directed cloning）：黏性末端连接不同黏端连接 举例：GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点 GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点 AATTCGATCTAGEcoR+Bg l 双酶切 AATTCGGATCTAAATTCGATCTAG+EcoR+Bg l 双酶切 GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶 16 C 重组体 黏性末端连接其他
4、措施产生黏端 化学合成法获得含所需RE位点的平端双链寡核苷酸接头（adaptor/linker）人工接头法：CCGAATTCG GGCTTAAGC 5-3-EcoR 人工接头与目的基因连接 相同RE切割带有人工接头的目的基因及载体 连接切割后的目的基因及载体 黏性末端连接其他措施产生黏端 末端转移酶将某核苷酸（dT）逐一加到目的基因3端，形成同聚物尾（poly dT）加同聚物尾法：互补核苷酸（dA）同聚物（poly dA）加到载体3端 互补同聚物尾高效连接 重组体 黏性末端连接其他措施产生黏端 设计目的基因特异引物，引入所需RE位点 PCR法：PCR扩增，获得两端带有RE位点的目的DNA片段
5、相应RE切割目的DNA及载体 T-A克隆：连接带有相同黏性末端的目的基因及载体 平末端连接 目的基因 载体 平末端RE 平末端RE T4 DNA连接酶 16C 重组体 载体自连 目的基因 自连 连接效率低 平端连接缺点：增加连接酶用量；解决办法：延长连接时间；降低反应温度；增加目的DNA/载体。黏-平末端连接 黏-平末端连接 指目的DNA和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。属于定向克隆。连接效率 介于黏端连接与平端连接之间，可采用提高平端连接效率的方式提高该方式的连接效率。第二部分 DNA重组技术 重组DNA转入受体细胞 受体细胞条件 重组DNA导入受体细胞 的常用方法 重组DNADNA转入受体细胞受体细胞条件 处于感受态（competent）基因工程细胞：具有较强的接纳外源DNA的能力，可保证外源DNA长期、稳定的遗传或表达。安全的宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 重组DNADNA转入受体细胞重组DNA导入受体细胞的常用方法 重组DNA导入受体细胞的常用方法 转化(transformation)将质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染(transfection)将外源DNA导入真核细胞的方法。感染(infection)利用噬菌体或病毒将外源DNA导入宿主细胞的方法。感谢您的耐心观看