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1、胆汁酸抗艰难类梭菌感染作用机制和应用前景艰难类梭菌(Clostridioides difficile，C.difficile)是一种革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，属于条件致病菌，毒素A和毒素B是其主要致病因子，可损伤患者肠壁，诱发炎症反应。艰难类梭菌感染(Clostridioides difficileinfection，CDI)的常见临床症状为腹泻，也可伴有发热和腹痛等，严重者可表现为伪膜性肠炎、中毒性巨结肠、肠穿孔和脓毒血症等，甚至死亡。抗生素的使用是引起CDI的主要原因，抗生素可引起肠道菌群紊乱，从而导致耐药C.difficile过度增殖。胆汁酸作为肠道菌群衍生的代谢物，被认为是肠道菌群与宿主
2、沟通的关键信号分子，其对宿主的正常生理和免疫功能起着重要作用。目前，粪便菌群移植是复发性CDI最有效的治疗方法，其主要的作用机制之一即通过恢复肠道菌群、调节胆汁酸代谢抑制C.difficile生长。因此，探索胆汁酸在CDI发病机制中的作用及其作为CDI新疗法的潜在价值尤为重要。本文通过总结胆汁酸在CDI发病机制中的作用，探讨胆汁酸对CDI新的治疗选择的潜在影响。一、胆汁酸对CDI的直接作用1胆汁酸抑制C.difficile菌体生长和芽孢萌发：人类结肠管腔满足厌氧条件，C.difficile等专性厌氧细菌能在其中生存。C.difficile形成的芽孢对恶劣环境的抵抗力较强，在高温、有氧和常用消毒
3、剂条件下可以存活，更便于传播。芽孢形成转录因子Spo0A(stage 0 sporulation protein A)对C.difficile芽孢的产生过程至关重要，其失活可导致C.difficile失去芽孢形成能力。Spo0A的表达水平受鸟苷三磷酸-感应转录多效性抑制因子(guanosine triphosphate-sensing transcriptional pleiotropic repressor，CodY)和代谢物调控蛋白A(catabolite control protein A，CcpA)调控，其中营养调节蛋白CodY是一个转录抑制因子，能够显著抑制C.difficile芽孢
4、形成相关操纵子的转录；多效调控因子CcpA是碳水化合物代谢抑制剂，当C.difficile在含有葡萄糖条件下培养时，CcpA可直接抑制Spo0A的表达，进而使其产生的毒素减少。一般情况下，C.difficile芽孢的萌发和菌体的生长只发生在下消化道，肠道内容物中尤其是胆汁酸会诱导C.difficile芽孢萌发成营养细胞，这一过程由CspBAC基因位点调控。C.difficile芽孢上存在的胆汁酸受体梭菌丝氨酸蛋白酶(clostridial serine protease，Csp)C主要由CspBAC基因位点编码，该基因位点还编码另一种由枯草杆菌蛋白酶家族蛋白中CspB和CspA组成的杂合蛋白C
5、spB-CspA，并且CspBAC基因与芽孢萌发所必需的皮质层裂解酶SleC的激活有关。培养基中加入初级结合胆汁酸牛磺胆酸可极大地促进粪便中C.difficile菌体生长和芽孢萌发，这一过程主要是由牛磺胆酸与C.difficile表面的CspC结合后将信号传递给CspB，CspB激活SleC使C.difficile芽孢皮质层退化，最终导致新的营养细胞生长(图1)。游离的初级胆汁酸对C.difficile有不同的作用，胆酸可促进C.difficile芽孢萌发和菌体生长，而鹅去氧胆酸抑制C.difficile芽孢萌发的能力明显强于胆酸诱导C.difficile芽孢萌发的能力，该过程主要由CspC受
6、体介导。相反，次级胆汁酸如去氧胆酸能够通过下调Spo0A的表达降低C.difficile产生芽孢的效率，其余的次级胆汁酸如石胆酸、异石胆酸、熊去氧胆酸和猪去氧胆酸在生理浓度下也能够抑制牛磺胆酸介导的C.difficile芽孢萌发，这种抑制作用呈剂量依赖性，抑制程度和抗性程度因菌株和核型不同而存在差异(图2)。注：背景浅蓝色为艰难类梭菌芽孢形成阶段，浅黄色为艰难类梭菌芽孢萌发阶段。P为磷酸化修饰；Spo0A为芽孢形成转录因子；CspC为梭菌丝氨酸蛋白酶C；SleC为皮质层裂解酶；CspB为梭菌丝氨酸蛋白酶B图1艰难类梭菌芽孢的形成和萌发过程注：CYP27A1为胆固醇27羟化酶1；CYP7A1为胆
7、固醇7羟化酶1；CYP7B1为氧固醇7羟化酶1；CDCA为鹅去氧胆酸；CYP8B1为胆固醇12羟化酶1；CA为胆酸；TCDCA为牛磺鹅去氧胆酸；GCDCA为甘氨鹅去氧胆酸；TCA为牛磺胆酸；GCA为甘氨胆酸；BSH为胆盐水解酶；HSDH为羟基类固醇脱氢酶；UDCA为熊去氧胆酸；isoalloLCA为石胆酸衍生物；5AR为5-还原酶；3HSDH为3-羟基类固醇脱氢酶；LCA为石胆酸；DCA为去氧胆酸；FXR为法尼酯X受体；TNF-为肿瘤坏死因子-；IL为白细胞介素；IFN-为干扰素；TGR5为G蛋白偶联胆汁酸受体5图2胆汁酸的体内代谢及其代谢产物对艰难类梭菌芽孢萌发、菌体生长和毒素产生的作用2胆
8、汁酸抑制C.difficile毒素产生：毒素的产生对C.difficile导致感染至关重要。为了应对有限的营养环境，C.difficile会产生针对肠上皮细胞的毒素，导致肠道屏障的完整性破坏，使宿主暴露于肠道微生物中从而诱发宿主炎症反应。一项多中心研究表明，在小鼠CDI模型中，毒素B是介导肠上皮损伤、炎症和死亡的主要毒力因子，而毒素A在介导小鼠炎症中是相对次要的毒力因子。肠道胆汁酸既能在C.difficile芽孢萌发和菌体生长中发挥作用，也可直接结合和抑制C.difficile的主要毒力因子毒素B，次级胆汁酸相较于相应的初级胆汁酸有更强的毒素结合能力。胆汁酸结合会导致毒素B构象发生改变，从而阻
9、止毒素B与肠上皮细胞表面受体结合或被肠上皮细胞摄取，进而减轻毒素B导致的肠上皮细胞损伤。此外，牛磺胆酸能够抑制毒素B和毒素A在上皮细胞中的毒性作用，但并不会影响C.difficile的菌体生长和总毒素产生；去氧胆酸主要通过抑制毒素B表达调节营养体生长条件下的毒素产生，同样石胆酸、熊去氧胆酸、猪去氧胆酸等次级胆汁酸也均对多株临床C.difficile分离株的毒素活性具有抑制作用(图2)。二、胆汁酸在肠道炎症和免疫调节中的作用Cdifficile与宿主免疫系统的相互作用是CDI发病机制和病原体清除的关键，且已有研究表明宿主因子在CDI的免疫病理学中发挥重要作用。次级胆汁酸作为一种强有力的核受体配体
10、，能与法尼酯X受体(farnesoid X receptor，FXR)、维生素D受体和孕烷X受体结合，还可作为G蛋白偶联胆汁酸受体5(G protein-coupled bile acid receptor 5，TGR5)的内源性激动剂，在机体营养代谢和天然免疫中发挥重要的稳态功能(图2)。FXR是一种在胃肠道和肝组织中表达的核受体，能够调节胆汁酸稳态。在体内，鹅去氧胆酸是FXR最有效的内源性配体，去氧胆酸和石胆酸也可作为FXR温和的激动剂。葡聚糖硫酸钠或三硝基苯磺酸诱导的结肠炎FXR缺陷小鼠主要表现为促炎细胞因子和促纤维化细胞因子大量产生，包括肿瘤坏死因子-(tumor necrosis f
11、actor-，TNF-)、白细胞介素(interleukin，IL)-1、干扰素、转化生长因子-1和1型胶原，但使用有效的合成配体奥贝胆酸(INT-747)激活FXR后可以防止肠道炎症的进展。TGR5主要表达于单核细胞和巨噬细胞上，单核巨噬细胞可以分泌多种炎症介质，在调节炎症反应中发挥重要作用。去氧胆酸和石胆酸是TGR5最有效的天然胆汁酸配体，对结肠炎小鼠模型具有保护作用，能够抑制促炎因子TNF-和IL-17的产生，减轻肠道炎症程度，而这种保护作用在TGR5缺陷小鼠模型中消失。此外，BAR501作为TGR5的选择性激动剂，能够使肠道巨噬细胞从M1型极化为M2型，从而保护小鼠免受结肠炎侵袭，由此
12、可见，M2型巨噬细胞在肠道微环境中积聚似乎是恢复肠道组织内稳态的关键。综上所述，肠道菌群-胆汁酸-FXR/TGR5轴在调节性T淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞的调节中发挥明显作用，也再次证明了次级胆汁酸作为CDI新疗法的潜在价值。三、依赖胆汁酸治疗CDI的方法1靶向菌群：胆汁酸作为宿主与肠道菌群沟通的重要信号分子，由宿主合成，并由肠道微生物进行化学转化。胆汁酸的转化主要由肠道微生物产生的2种关键酶参与完成：一种是胆盐水解酶，能够水解结合胆汁酸中的甘氨酸或牛磺酸基团；另一种是7-脱羟基酶，能够将未结合的初级胆汁酸转变成次级胆汁酸。已有研究发现，经抗生素干预后，肠道菌群和胆汁酸代谢组的改变会导致肠道对
13、C.difficile的定植抗性丧失，使得具有调节肠道胆汁酸谱能力的肠道菌群得以恢复，特别是其产生次级胆汁酸，可能对CDI的治疗有益。辛氏梭菌属(Clostridium scindens)主要来自梭状芽孢杆菌簇a、和，已被证实具有较强的7-脱羟基酶的活性，该酶由胆汁酸诱导的操纵子编码。肠道胆酸会诱导辛氏梭菌属胆汁酸诱导的操纵子表达增加，导致次级胆汁酸去氧胆酸的产生增加，从而抑制C.difficile芽孢萌发、菌体生长和毒素产生。益生菌作为治疗CDI的一种替代方法，是一种极具潜力的替代抗生素的疗法。多形拟杆菌属(Bacteroides thetaiotaomicron)已被证明对C.diffic
14、ile具有抑制作用，能够改善胆汁酸谱，使小鼠模型中-鼠胆酸、-鼠胆酸和去氧胆酸增加，从而减弱C.difficile的定植并抑制结肠内炎症。多形拟杆菌属还可以通过增强肠道黏膜屏障功能防止病原体入侵，显著减缓结肠炎进展，并恢复动物肠系膜淋巴结辅助性T淋巴细胞1/辅助性T淋巴细胞2与辅助性T淋巴细胞17/调节性T淋巴细胞的平衡，同时促进抗炎因子IL-10分泌，抑制促炎因子干扰素和IL-17分泌。双歧杆菌属(Bifidobacterium)益生菌可分泌胆盐水解酶和羟基类固醇脱氢酶2种酶，在防止C.difficile定植中也起着重要作用。在婴幼儿自身防御系统不成熟的脆弱时期，双歧杆菌属可通过防止病原体在
15、肠道上皮黏附，从而对宿主起保护作用；在C.difficile相关性腹泻患者中，双歧杆菌属还可以有效地防止抗生素治疗后C.difficile的增殖。值得关注的是，最新研究表明臭菌科(Odoribacteraceae)的多个菌株能够在体内外诱导isoalloLCA(一种石胆酸衍生物)的产生。isoalloLCA对包括C.difficile和屎肠球菌在内的革兰氏阳性多重耐药病原菌具有很强的抗菌活性(图2)。5-还原酶和3-羟基类固醇脱氢酶作为产生isoalloLCA的关键酶，在臭菌科中具有较高的活性。给予小鼠CDI模型外源性臭菌科菌株后，小鼠粪便中isoalloLCA水平显著增高，从而维持肠道内环境
16、稳态。此外，Koopen等研究发现另一种含有编码胆汁酸-钠同向转运蛋白(EHLA-2286)和胆盐水解酶(EHLA-1602和EHLA-2245)基因的革兰氏阳性厌氧菌Anaerobutyricum soehngeniiL2-7(A.soehngeniiL2-7)，并发现在给代谢综合征患者肠内补充A.soehngeniiL2-7后，牛磺鹅去氧胆酸、牛磺石胆酸、甘氨去氧胆酸和熊去氧胆酸等次级胆汁酸的水平显著提高，同时与胆汁酸代谢/运输相关基因的表达增加，从而改善血糖水平，这一机制可能与胆汁酸作用于TGR5相关。目前尚未见相关研究证明A.soehngeniiL2-7可直接影响CDI，未来还需进一步
17、发掘该菌治疗CDI的潜力。故通过调整肠道菌群的组成来恢复宿主免疫稳态，可能成为未来治疗肠道相关疾病的有效方法。2多酚类化合物：肠道健康很大程度上受饮食影响，食物为宿主和肠道菌群提供底物，调节肠道菌群的组成，肠道菌群的改变又会进一步影响胆汁酸代谢，进而调节肠道免疫屏障功能。茶是全球第二大最常饮用的饮料，酚类物质约占茶叶干重的30%，尤其是儿茶素和没食子酸，该茶酚类物质能够显著抑制C.difficile菌体生长。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是绿茶中含量最丰富的多酚类儿茶素，具有抗菌、抗炎和抗氧化等多种生物学功能。研究表明，口服EGCG能够显
18、著增加肠道拟杆菌门的丰度，并通过增加肝脏氧固醇7羟化酶1的表达使胆汁酸合成途径由经典途径转变成替代途径，从而导致-鼠胆酸、鹅去氧胆酸和牛磺石胆酸增加；并且给予小鼠高脂饮食模型EGCG后，疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)尤其是阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)的丰度显著增加，该改变主要通过激活TGR5途径实现，这些结果表明EGCG在改变肠道菌群和胆汁酸合成途径方面发挥了突出作用。此外，预防性服用EGCG可显著改善健康小鼠肠道的抗炎状态和抗氧化状态，表明EGCG具有改善肠道屏障的潜力和治疗CDI的潜在价值。多酚类化合物茶褐素在调节肠道菌群和胆汁酸代谢方面也显示出绝对优势，但目前尚未有研究证明其对C.difficile具有直接抑制作用，故有必要进一步评估茶褐素通过影响肠道菌群和胆汁酸代谢对CDI的治疗效果。四、小结与展望目前研究发现胆汁酸与CDI的发病机制相关，包括直接作用机制和免疫调节机制，且胆汁酸作为一种新的靶向治疗手段在治疗干预CDI方面已取得快速进展，然而仍有许多不确定和复杂的领域需要进一步研究。CDI的治疗目前仍以药物治疗为主，包括甲硝唑、万古霉素和非达霉素。充分发掘胆汁酸在CDI治疗中的潜力，以及深刻剖析C.difficile、胆汁酸、肠道菌群与宿主之间的相互作用，或许能使依赖胆汁酸的疗法成为治疗CDI的新方法。