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1、大豆分子育种摘要: 不同同基因型型的大豆豆子叶节节在添加加适宜BBA 的的M SS 培养养基上培培养, 可从子子叶节诱诱导出高高频丛生生芽, 并获得得大量再再生植株株. 通过过农杆菌菌介导法法, 将深黄黄被孢霉霉6- 脂肪肪酸脱氢氢酶基因因导入到到栽培大大豆吉林林43 和黑农农37品种种中. 经过在在含5000mgg鯨 卡那霉霉素的筛筛选培养养基中连连续筛选选, 获得得一批转转基因植植株. 经PCRR 检测测和DNNA 分分子杂交交分析, 初步步证明外外源基因因已导入入并整合合到大豆豆基因组组中. 本文重重点阐述述了组培培再生系系统和基基因转化化系统的的内在联联系和不不同点.卜云萍萍，李明明春
2、，胡胡国武等等，大豆豆子叶节节组培再再生系统统与农杆杆菌介导导的基因因转化系系统的比比较研究究，南开开大学学学报(自然科科学版)，20003，36（1）：1003-1105摘要：用 RAPPD 标标记方法法对来自自中国、日日本、韩韩国、不不丹、尼尼泊尔、越越南 66 国 1663 份份小豆种种质资源源 DNNA 的的遗传多多样性进进行检测测。从 27 个引物物共检测测到 2285 条带，有有 2661 条条具多态态性（占占 922.988%），其其中野生生型多态态性带谱谱占 885.882%，栽栽培型次次之为 83.52%，半野野生型为为 800.466%，三三类型小小豆都有有其自身身特征带带
3、；遗传传离散度度大小顺顺序是：野生型型半野野生型栽培型型，其遗遗传分化化系数大大小顺序序为：野野生型半野生生型栽栽培型；从分化化系数差差异看，半半野生型型小豆更更接近野野生型小小豆；从从相似系系数平均均值来看看，半野野生型小小豆材料料之间亲亲缘关系系较近，而而处在进进化两极极的野生生型材料料之间、栽栽培型材材料之间间亲缘关关系都较较远；来来自我国国西南以以及日本本南部两两地区的的小豆材材料遗传传离散度度较大，遗遗传分化化系数、相相似系数数平均值值较低。聚聚类分析析结果表表明，1163 个小豆豆材料以以遗传相相似系数数 0.32 为截值值，可分分为 88 大类类，归类类有较明明显的地地理相关关性
4、及遗遗传类型型的趋同同性。金文林林，文自自翔，濮濮绍京等等，应用用 分析小小豆种质质资源遗遗传多样样性及遗遗传演化化趋势，中中国农业业科学 20005,338(22):2241-2499摘要本文文研究AAFLPP技术在在大豆上上的应用用,在改改进大豆豆种子DDNA提提取方法法的基础础上,比比较同位位素与银银染检测测方法的的效果,筛选适适宜于大大豆AFFLP分分析的酶酶切和引引物组合合,从而而建立了了适用于于大豆指指纹图谱谱快速鉴鉴定的AAFLPP操作程程序,并并对我国国野生大大豆和栽栽培大豆豆代表性性材料进进行了AAFLPP分析。近年来,大大豆种质质资源研研究中应应用的分分子标记记大体可可以分
5、为为两大类类。一类类是以分分子杂交交为基础础的RFFLP技技术,另另一类是是以PCCR反应应为基础础的各种种DNAA分子标标记,包包括有DDAF、AAP-PPCR、RRAPDD、SSSR、AAFLPP等技术术。作为为一种有有效的分分子标记记,RFFLP最最先被应应用到大大豆遗传传研究中中(Appuyaa等19988)1。但是是从建立立品种指指纹图谱谱来看,RFLLP技术术单个探探针信息息量少,鉴别效效率不高高2。RAAPD技技术以其其快速简简单的优优点被用用来鉴别别大豆种种质33,4,但由由于所采采用引物物Tm值值较低,扩增结结果易受受外界条条件的影影响。SSSR标标记在大大豆种质质研究中中应
6、用也也较多5,66,其其多态性性远远高高于RFFLP标标记,但但一次性性检测的的位点也也有限。因因此,发发展一种种既能高高度揭示示遗传变变异多样样性,又又相对操操作简单单的分子子标记,对于大大豆指纹纹图谱研研究具有有重要的的意义。分子标记AAFLPP(ammpliifieed ffraggmennt llenggth pollymoorphhismm)是由由Zabbeauu和Voos(119933)发明明的77,8。它基基于对基基因组DDNA进进行双酶酶切,片片段末端端连接上上一个接接头,经经一个与与接头和和邻接酶酶切位点点相匹配配的引物物进行PPCR选选择性扩扩增,而而后用变变性聚丙丙烯酰胺
7、胺凝胶分分离扩增增产物。这这种方法法结合了了RFLLP可靠靠性和PPCR高高效性的的优点,已经成成功地应应用于大大豆遗传传图谱构构建与遗遗传多样样性研究究中99,100,111。但但是该方方法受专专利保护护,分析析试剂盒盒十分昂昂贵,还还需要同同位素操操作,用用叶片提提取DNNA手续续较多,也影响响到分析析的效率率,因此此有必要要建立适适用于大大豆的优优化操作作程序。本研究旨在在探索大大豆种子子提取DDNA并并用于AAFLPP分析的的可能性性,比较较银染与与同位素素技术在在检测效效率上的的相对效效果,筛筛选适用用于大豆豆的酶切切和引物物组合,完善大大豆指纹纹分析的的AFLLP技术术,为大大豆材
8、料料真实性性和纯度度检验、种种质亲缘缘关系的的研究提提供方法法。1.2.11DNNA的提提取关于于大豆DDNA的的提取,前人多多采用叶叶片提取取的方法法。MccDonnaldd等(119944)112对对DNAA提取法法进行了了改进,从玉米米、大豆豆、棉花花等种子子中提出出质量较较高的DDNA。但但是,作作者在用用该法提提取大豆豆样品,尤其野野生大豆豆时,由由于色素素及酚类类、醌类类等多糖糖类杂质质较多,得到的的DNAA呈淡红红、红色色,十分分粘稠,溶解困困难,2260/2800比值较较低,而而且降解解严重,这样会会影响DDNA样样品的酶酶切效果果。因此此,本研研究在MMcDoonalld等基
9、基础上作作了改进进,详见见结果部部分。2.1 大豆种子DDNA提提取方法法的改进进本研究在MMcDoonalld等(19994)12提取DDNA方方法的基基础上,作了以以下改进进:(1) 栽培大豆取取半粒或或单粒种种子,野野生大豆豆可取11-2粒粒种子,以确保保DNAA样品的的纯度(2) 取干种子,无须在在液氮条条件下研研磨,即即可保证证DNAA的完整整性；(3) 尽可能除尽尽种皮,减少种种皮中所所含杂质质对DNNA质量量的影响响(4) 提高SDSS提取液液的浓度度,由112%提高到到4%,以增加加DNAA产量；(5) 第一次离心心采用110,0000转转/秒,以后离离心速度度降为330000
10、转/秒秒,以防防止DNNA的降降解；(6) 加入高浓度度(3MM)的盐盐离子(KACC),以以去除多多糖类及及色素等等杂质,对于野野生大豆豆,还加加入PVVP或巯巯基乙醇醇,以防防止酚类类、醌类类物质对对DNAA的降解解；(7) 增加酚/氯氯仿抽提提步骤,而后再再用氯仿仿进一步步抽提,以除去去杂质和和多余的的酚；(8) 加0.2l的110g/lRNNaseeA,在在4下过夜夜,以除除去RNNA,并并进一步步抽提,防止RRNA对对酶切的的影响。本研究单粒粒野生大大豆提取取的DNNA量约约为3-20g,单单粒栽培培大豆提提取的DDNA量量约为110-2200g,而而一次预预扩增仅仅需DNNA100
11、0ngg左右,所以完完全满足足测定所所需。与与叶片提提取方法法相比较较,直接接从种子子中提取取DNAA,不需需发芽、光光照培养养、液氮氮研磨等等过程,可以提提高种子子的检验验效率。银染法和同同位素法法检测的的总带数数相近,但同位位素法多多态性条条带、多多态性百百分率较较高,而而银染法法平均遗遗传多样样度(HHavv)和有有效等位位基因的的数目和和略高于于同位素素法。鉴鉴于银染染法结果果与同位位素基本本相似,可以避避免放射射性同位位素使用用,而且且经济快快速,因因而银染染法AFFLP是是可以广广泛应用用的。不同的酶切切组合和和引物组组合,扩扩增结果果不相同同,本实实验通过过比较不不同酶切切组合,
12、发现EEcoRR -MMse 酶切时时较容易易找到多多态性引引物组合合,而且且具有较较高的多多态性。本本研究还还证实“3+33”引物组组合用于于大豆AAFLPP分析较较为理想想,同时时找到了了多对理理想的引引物组合合,可以以用于大大豆种质质的指纹纹分析研研究。通通常AFFLP检检测需要要使用放放射性同同位素标标记,而而且,一一般认为为,同位位素法比比银染法法更灵敏敏,尤其其使用333P标标记效果果较好14。本研研究证实实,用同同位素333P检检测所得得到的带带型上下下较为均均匀,分分辨率较较高;银银染法带带型较粗粗,对不不同分子子量的条条带染色色深浅不不甚一致致,容易易出现分分辨率上上高下低低
13、的情况况,因而而需要更更多的技技巧。本本研究通通过比较较还证实实,银染染法与同同位素法法除在一一些弱带带判别上上有一定定出入外外,所得得到的带带型基本本一致。在在实际应应用中,不同方方法的检检测效率率是与研研究者所所掌握的的技术水水平和熟熟练程度度紧密联联系的。只只要充分分掌握各各个技术术环节,银染法法可以在在避免放放射性污污染、降降低成本本的同时时,同样样得到分分辨率较较高的指指纹图谱谱。田清震震，盖钧钧镒，喻喻德跃，大大豆DNNA扩增增片段长长度多态态性(AAFLPP)研究究，大豆科科学，220000,199(3)：2110-2217摘要:利用用大豆栽栽培品种种科丰11号和南南农11138
14、-2杂交交得到的的重组近近交系,通过、和44种分子子标记的的遗传连连锁分析析,构建建了包含含24个个连锁群群、由7792个个遗传标标记组成成的大豆豆较高密密度连锁锁图谱,该图谱谱覆盖223200.7,平平均图距距2.99。标标记的多多态性较较高,在在基因组组中的位位置相对对稳定,可以作作为锚定定标记,有利于于连锁群群的归并并和不同同图谱的的比较整整合;而而标记记对于增增加图谱谱密度效效率较高高,但其其容易出出现聚集集现象,从而造造成连锁锁群上有有很大的的空隙()。另另外,在在连锁群群中有221.77%的分分子标记记出现偏偏分离。该该图谱为为基因定定位、比比较基因因组学和和重要农农艺性状状的定位
15、位等研究究打下了了基础。分子标记连连锁图为为进行植植物基因因组的结结构分析析和比较较提供了了有力的的工具。较较高密度度的分子子图谱已已有效地地应用于于数量性性状基因因定位()、图图位克隆隆基因、比比较基因因组学研研究和分分子标记记辅助育育种等研研究中。因因此,对对于具有有重要经经济价值值并得到到广泛研研究的大大豆作物物来说,发展一一张高密密度的遗遗传连锁锁图将具具有重大大意义。遗遗传作图图中最常常用的分分子标记记有、和标记。然然而,对对大豆而而言,有两个个缺点:一是的多态态性程度度不高,二是大大豆的大大多数标记为为多个位位点。标记虽虽然过程程简单,但多态态性低且且重复性性较差。微微卫星标标记(
16、)多样性性高而位位点基本本单一稳稳定,所所以利用用标记作作为锚定定标记,则有助助于图谱谱的连锁锁群或染染色体的的归并和和不同连连锁群的的整合。技术结结合了和的的特点,在一次次反应中中能同时时检测多多个遗传传位点,在大豆豆中平均均一个泳泳道有5501120条条带,信信息量非非常丰富富,并且且标记记能够填填补其他他标记之之间的空空隙。所所以适合合用于构构建饱和和的分子子遗传图图谱研究究。大豆遗传图图谱的发发展已经经有了110多年年的历史史。19988年年等等首次用用标记记构建大大豆遗传传图谱,但是此此图谱的的标记记仅为111个,组成44个连锁锁群11。随随后,等用.种间杂杂交作为为构图群群体,构构
17、建了一一个图图谱,包包括由1130个个标记记组成的的26个个连锁群群,覆盖盖大豆基基因组1120002。和和将来源源于不同同群体的的各种标标记整合合到一张张连锁图图谱上3。他他们用栽栽培大豆豆杂交交的近等等基因系系再杂交交的22代群体体构建了了含有113个经经典标记记、7个个同工酶酶标记、1110个个标记记和8个个标记记的遗传传图谱。通通过使用用一套锚锚定的探针,根据这这些位位点在和.作图群群体中的的分离情情况,确确定分子子标记和和经典标标记图谱谱间的连连锁群同同源性。后后来等等利用 10114437.6544构建的的含有3300个个单株的的群体,构建了了饱和度度较高的的遗传图图谱,该该连锁图
18、图谱含有有28个个连锁群群,长度度为34441,共共有1665个标记、225个标记和和6500个标标记。尽尽管经经常成簇簇排列,相对于于其他分分子标记记,更更均匀地地分布在在所有连连锁群中中4。等将将6066个单一一位点的的标记整整合到连连锁图谱谱上,这这套标记记作为锚锚定标记记,将33个不同同群体的的连锁图图谱整合合为一个个公共图图谱55。该该图谱包包括14423个个不同类类型的分分子标记记,其中中有6006个标标记、6689个个标记记、799个标标记、111个标记、110个同同工酶标标记和226个经经典标记记。由于于标记是是单一位位点,不不仅增加加了遗传传图谱中中分子标标记的数数目,同同时
19、根据据不同图图谱上的的公共的的标记,使连锁锁群数目目减少到到20个个,这与与大豆染染色体数数目相吻吻合。如如今在所所有图谱谱上共检检测出229500个位点点。3.1图图谱构建建构建高密度度遗传图图谱是大大豆基因因组研究究的重要要内容之之一。等等5应用6606个个标记补补充已构构建的33张图谱谱使其所所包含的的单一位位点的总总数达到到14223个,包括6606个个,6889个,799个,11个个,110个同同工酶和和26个个经典性性状标记记,建立立20个个保守连连锁群,但仍有有几个小小连锁群群( ,54,224)不不能整合合进去。我我们在构构建高密密度大豆豆遗传图图谱时,主要借借助于标标记进行行
20、锚定连连锁群,利用标记加加密图谱谱。标记记由于其其优点是是可以用用来进行行连锁群群的锚定定,使图图谱间的的比较易易于进行行。虽然然构建建遗传图图谱的效效率比较较高,但但是由于于平均均每对引引物在两两个亲本本间可以以检测到到65条条带,平平均可产产生100.6条条多态带带,在进进行不同同图谱比比较或者者用于筛筛选分子子标记时时,应用用起来比比较不便便。最近近,由于于分析析软件的的出现和和配套技技术的完完善已经经可以做做到在11周的时时间内,对7000000条带带进行基基因型分分析112。如如果将不不同的群群体的亲亲本同时时进行标标定,这这样可以以准确地地将信息息量非常常大的整合到到公共连连锁图谱
21、谱上,这这对于建建立高密密度的公公共连锁锁图谱是是非常有有益的,也有利利于基因因的精细细定位。目目前番茄茄和大麦麦等作物物的整合合的图图谱密度度已经低低于1113,114。本本研究构构建的大大豆分子子遗传图图谱有224个连连锁群,共计7792个个标记,是国内内最为致致密的图图谱。目目前大豆豆遗传图图谱构建建的缺憾憾是还没没有将大大豆的连连锁群与与对应的的染色体体联系起起来。这这主要是是因为大大豆的基基因组是是复杂的的古四倍倍体起源源。大豆豆多基因因家族含含有两个个独立亚亚组的发发现也证证明了这这一点15。不过过随着大大豆全套套(200个)初初级三体体的应用用,这220个连连锁群与与大豆220条
22、染染色体的的对应关关系将很很快能够够确定。3.2偏偏分离现现象偏分离现象象普遍存存在117。高高密度分分子连锁锁图谱的的构建,为在整整个基因因组中调调查表现现偏分离离的位点点提供了了可能18。有人人认为由由于遗传传搭车效效应,与与影响偏偏分离的的遗传因因子紧密密连锁的的分子标标记则表表现有严严重偏分分离116。目目前还有有另外两两种假说说解释偏偏分离现现象,一一种认为为是配子子体选择择的结果果,22群体中中偏分离离的比例例为021(亲亲本1正常亲本22)。另另外一种种观点认认为是花花粉选择择的结果果,这种种模式的的偏分离离位点在在群体中中以011的比比例分离离133。张张德水等等6利用栽栽培品
23、种种(.)长农农4和半半野生种种(.)新新民6的的2代代群体以以及刘峰峰等77利用用同一对对亲本的的群体进进行了大大豆分子子图谱构构建和基基因组分分析,研研究表明明绝大多多数偏分分离标记记都偏向向于栽培培品种长长农4,雄配子子体选择择是标标记偏分分离的主主要影响响因素。在在本研究究中,虽虽然偏分分离的标标记数高高达211.7%,但没没有发现现明显偏偏向于某某一亲本本的趋势势。这里里的偏分分离可能能主要与与遗传搭搭车效应应有关,当然也也不排除除个别配配子体选选择现象象。3.3 标记聚集()和和标记空空隙()构建遗传图图谱都期期望标记记间距尽尽可能小小,并且且标记在在基因组组上应均均匀分布布。但是
24、是,我们们构建的的连锁图图谱上的的分子标标记,在在每个连连锁群上上的分布布并不是是均匀的的,很多多标记记聚集在在一起,形成112个个集聚区区,相应应地增加加了聚集集区以外外的标记记间距,从而形形成比较较大的空空隙区域域()。分分子标记记的聚集集现象在在番茄13、大麦麦144、玉玉米119、甜甜菜220、马马铃薯21和大豆豆4等作物物中都有有报道。据据推测在在番茄、大大麦和玉玉米上+标记记的聚集集区域是是着丝点点附近的的异染色色质区,但是在在大豆、甜甜菜和马马铃薯上上还不能能肯定这这种聚集集区是在在异染色色质区。和222发现现异染色色质区的的联会丝丝复合体体上的重重组节频频率比常常染色质质的低。
25、等13发现番番茄图谱谱上+标记记在聚集集区中的的比例与与异染色色质区中中的比例例(777%)是是一致的的。在我我们构建建的连锁锁图谱上上,699%的标记存存在于聚聚集区中中。+标记记的聚集集现象可可能与异异染色质质区重组组率低有有关。所所以利用用对甲基基化敏感感的限制制性内切切酶代替,可以以在非甲甲基化的的常染色色质区识识别酶切切位点,而不是是在异染染色质区区。这样样虽然+标记记虽然少少,但是是要比+标记记分布均均匀,+标记记在水稻稻群群体中分分布比较较均匀23。因此此,要根根据不同同研究目目的选择择的限限制性内内切酶。在在大多数数研究中中,特别别是定位位,+标记记更合适适。但是是这种标标记系
26、统统往往受受基因型型和植株株发育的的影响,因为基基因组甲甲基化程程度随着着基因型型和植株株发育状状态不同同而变化化。在基基因精细细定位和和图位克克隆基因因时,要要根据基基因处于于异染色色质区还还是常染染色质区区,来选选择合适适的标标记。例例如番茄茄抗病基基因 9位位于常染染色质区区,精细细定位采采用+标记记244。而而位于异异染色质质区的番番茄抗病病基因图位位克隆采采用了+标记记255。在等等5构建的的大豆图图谱上,也发现现了若干干标记记和标记记的密集集区,如如:.图谱中中的11连锁锁群,上上部166个标记记中,113个为为标记记,相邻邻的有111个和和18个个标记组组成的两两个密集集区,中中
27、间被88个标记记(其中中包括77个标标记)隔隔开。由由于标标记均来来自基因组组克隆,因为是对甲甲基化敏敏感的内内切酶,这些克克隆大多多为单拷拷贝或低低拷贝,可能并并不是随随机分布布于整个个基因组组中,因因此他们们推测,标记密密集区很很有可能能与位位点而不不是位点点有关。在在本图谱谱中有些些连锁群群仍存在在分子标标记分布布不均匀匀现象,甚至有有的存在在大于220的空隙隙。这主主要与图图谱上的的大多数数标记记聚集现现象有关关。另外外,也可可能是因因为所用用亲本之之间在某某些染色色体区段段缺乏多多态性,某些染染色体结结构发生生了大的的变异,导致在在这一段段染色体体上分子子标记不不能用连连锁规律律定位
28、。等等5在构建建高密度度大豆遗遗传图谱谱时也遇遇到同样样的问题题,为了了在空隙隙间找到到标记,他们利利用空隙隙两边的的作探探针,筛筛选库,但是在在空隙间间很难找找到合适适的标记记。因此此发展来来源于不不同杂交交组合的的作图群群体,以以及发展展包括微微卫星标标记,标记,标记记等新型型分子标标记都是是填补图图谱中的的缺口,构建覆覆盖整个个基因组组的遗传传图谱的的有效手手段。3.4基基因定位位构建高密度度的遗传传图谱和和筛选与与基因紧紧密连锁锁的分子子标记是是图位克克隆基因因的前提提。大豆豆连锁锁群上含含有多个个抗性基基因,如如抗花叶叶病毒病病基因11、抗花花生斑点点病基因因1和抗抗蚜虫根根腐病基基
29、因326,最近近又报道道大豆抗抗细菌枯枯病基因因1也定定位在这这个区域域5。因此此,大豆豆连锁锁群的构构建和抗抗性基因因密集区区的精细细作图对对于图位位克隆抗抗性基因因将具有有重要意意义。另另外,我我们将抗抗大豆花花叶病毒毒基因的的标记记定位在在连锁锁群、控控制花色色的基因因和绒绒毛有无无基因定位位于11连锁群群。抗花花叶病毒毒基因和和定位正正在进行行中。吴晓雷雷，贺超超英，王王永军等等，大豆豆遗传图图谱的构构建和分分析，遗遗传学报报，20001，228(111):10551110611王晓丹丹，吕慧慧颖，张张敬等，以以PCRR为目的的的大豆豆叶片DDNA提提取方法法的比较较研究，分分子植物物
30、育种，220044,2(6)：8911-8994PCR 反反应的性性质决定定其对模模板DNNA 的的纯度要要求不十十分严格格。因此此, 许许多实验验室发展展了适合合于不同同作物的的模板DDNA 快速分分离法1- 。用叶叶盘PCCR 法法筛选转转化体, 省去去不必要要的报告告基因序序列, 以减少少有害的的变异, 是植植物转化化实用化化的发展展趋势4 。我我们用花花粉管通通道法进进行大豆豆基因转转移获得得了大量量待筛选选的种子子, 用用特异引引物通过过 PCCR 技技术初步步筛选转转化体, 具有有简便、快快速、经经济等优优点。但但由于样样品数量量大, 模板DDNA 的分离离成了决决定筛选选效率的的
31、关键环环节。尤尤其是如如何解决决大批量量小样品品的研磨磨问题至至关重要要。经过过反复探探索, 用自动动螺钉旋旋具改制制成微量量样品研研磨器, 在 1. 5m l的微微量离心心管内研研样, 解决了了大豆鲜鲜组织的的大批量量小样品品的无损损耗快速速研磨问问题, 并简化化了DNNA 提提取的程程序, 收到了了很好的的效果。本本文报道道具体的的操作程程序和结结果。1. 微量样品研研磨器的的改制用中国机械械进出口口总公司司生产的的自动螺螺丝批(螺旋棘棘轮螺钉钉旋具)改制微微量样品品研磨器器。将产产品配带带的三个个十字花花形的转转头在砂砂轮上磨磨一下, 使之之与微量量离心管管的下部部形状(圆锥形形) 相相
32、吻合。2. 样品的制备备 取取单株收收获的大大豆种子子, 每每株 44- 55 粒, 放入入 500m ll 离心心管内发发芽(将将离心管管挤牢在在饭盒等等容器内内, 每每次可处处理数十十份), 288两到三三天。取取下胚轴轴和胚根根 0. 1- 0. 2gg(或生生长在大大田的大大豆幼苗苗的未展展开叶 0. 1- 0. 2g)放入 1. 5m l微量量离心管管内, 将离心心管放入入液氮中中冻几秒钟后后置工作作台上, 将微微量研样样器的转转头放入入离心管管并迅速速按动手手柄数次次。样品品研好后后将转头头取出, 用镊镊子或硬硬毛刷剔剔出转头头沟槽中中的样品品, 用用蒸馏水水涮洗两两次, 然后用用
33、干净纱纱布擦净净转头(或更换换转头)可进行行下一个个样品的的操作。研研好的样样品放入入冰中或或- 220备用。3. 提取缓冲液液成分 试试验采用用两种提提取缓冲冲液: SSDS: 1000mMM T riss- HHCl(pH 8. 0) , 5500mmM NN aCCl, 50mmM EEDTAA , 1. 25% SDDS。 CCTABB: 11. 00% WW V CTAAB, 0. 7M N aaCl, 100mM EDTTA , 500mM T rris- HCCl(ppH 88. 00) ,0. 1% 巯基乙乙醇。4. DNA 提提取程序序 aa. 每每管加入入 5000ull
34、在 65水浴中中预热的的 SDDS 提提取缓冲冲液, 混匀; bb. 放放入 665- 80水浴中中, 颠颠倒离心心管数次次, 放放出管内内冷气, 保温温 5- 200 分钟钟; cc. 每每管加入入 1550ull 5MM KAAC, 混匀, 冰浴浴 100 分钟钟并不断断混匀; dd. 44, 1100000 RRPM , 离离心 110 分分钟; ee. 将将上清移移入另一一离心管管内, 加入等等体积的的氯仿异异戊醇(24 : 11) , 快速速颠倒离离心管直直至形成成乳状液液不再很很快分层层; ff. 44, 880000 RPPM 离离心 55 分钟钟; gg. 小小心将上上清移入入
35、另一离离心管中中, 加加入 22 倍体体积的冷冷乙醇, 混匀匀, 放放置 55- 110 分分钟; hh. 44, 1100000 RRPM 离心 10 分钟; ii 倒掉掉上清, 用 70% 乙醇醇洗管壁壁和沉淀淀两次, 将离离心管倒倒置在纸纸巾上, 干燥燥 200- 330分钟钟; jj. 每每管加入入 2000ull TEE 缓冲冲液溶解解沉淀。1微量样样品研磨磨器的效效果中国机械进进出口总总公司出出品的螺螺旋棘轮轮螺钉旋旋具的转转头的直直径和长长度与 1. 5m l的离离心管最最为匹配配, 用用其改制制的微量量样品研研磨器效效果最好好。快速速按动手手柄, 转头的的转速可可达3000 R
36、RPM 左右, 转头头上的十十字沟槽槽与离心心管壁形形成较大大研磨力力, 使使经液氮氮冷冻的的样品很很容易被被研碎。研研磨一个个样品只只需 00. 55- 11 分钟钟。大豆豆下胚轴轴经液氮氮冷冻后后较硬, 如用用国产离离心管容容易破裂裂, 需需用进口口离心管管进行研研磨。叶叶片、幼幼苗等不不太硬的的样品可可用国产产离心管管,以降降低成本本。 本文的大大豆模板板DNAA 分离离程序, 只用用氯仿异异戊醇抽抽提一次次, 并并且提取取时间可可缩短到到5 分分钟, 是目前前最简单单、快速速的方法法。用该该程序每每天可处处理近百百个样品品(取决决于离心心机转头头的孔数数)。程程序中两两个关键键步骤是是
37、: 氯仿抽抽提时应应反复颠颠倒离心心管(330 秒秒钟以上上)直至至停止时时形成的的乳浊液液不很快快分层; 最后一一步DNNA 溶溶解时, 体积积不能太太小(1100- 2000ull)。体体积太小小, 溶溶解困难难, 并并影响 PCRR 扩增增的效果果。我们们用 00. 11- 00. 22g 的的样品量量, 最最后溶解解体积为为 2000ull, 再再稀释 10- 500 倍用用作模板板, PPCR 扩增的的效果很很好。周思君君，小样样品大批批量大豆豆模板DDNA 快速分分离法，大大豆科学学，19999，118(44)：3318-3211应用从60000多多份大豆豆种质资资源中筛筛选出的的
38、21个个抗大豆豆花叶病病毒病的的品种或或品系及及7个感感病的品品种或品品系,选选用200个随机机引物,对总DDNA进进行了随随机扩增增。有118个引引物扩增增得到了了稳定的的RAPPD图谱谱,OPPH-006和OOPH-10未未能扩增增到RAAPD产产物。扩扩增出的的片段分分子量在在0.66-4.6Kbb之间。随随机引物物扩增出出的条带带数在55-177条之间间,共扩扩增出1165个个条带,品种间间相同的的条带有有1044个,多多态性条条带有661个,多态性性条带占占37%。这220个引引物可分分为1无无扩增产产物的引引物;22扩增产产物无多多态性的的引物;3扩增增产物多多态性低低于155%的
39、引引物;44扩增产产物多态态性在115%-30%之间的的引物;5扩增增产物多多态性在在30%-500%之间间的引物物;6扩扩增产物物多态性性超过550%的的引物。依依据遗传传距离进进行聚类类分析的的结果表表明,这这些材料料可以明明确地聚聚成5组组。各组组内姊妹妹系衍生生出的品品种或品品系首先先聚在了了一起,其次有有一定血血缘关系系的聚在在了亚组组里。另另外,各各组内或或亚组内内的品种种或品系系在地理理分布上上具有一一定相关关性。3 RAPD反反应20个100-meer随机机引物购购自Opperoon公司司,所用用引物的的编号为为OPHH-011-OPPH-220,其其碱基序序列参见见Opeer
40、onn10-merrkittsprooducctinnforrmattionn。所用用随机引引物的GG+C含含量为660-770%。扩扩增反应应在255l体积积中进行行,其中中模板DDNA22l(55ng/l),随机引引物2l(550moll/L),2.5mMMdNTTPs22l,110xbbufffer22.5l,TTaqDDNA聚聚合酶11u,超超纯水116.55l,上上面覆盖盖20-30l液体体石蜡。热热循环条条件为:94变性11分钟,35退火22分钟,72延伸22分钟,5个循循环。接接着9440.55分钟,351分钟钟,7221.55分钟,40个个循环,然后772延伸110分钟钟。扩增
41、增产物在在1.44%琼脂脂糖凝胶胶,1TAEE缓冲液液中电泳泳,经EEB染色色,在紫紫外灯下下观察结结果并照照相。RAPD技技术方法法简单,耗费少少,效率率高,已已应用于于生物学学研究的的各个领领域。如如:染色色体组图图谱分析析(Wiilliiam等等,19990);基因因定位(Parran等等,19991;Marrtinn等19991;Upooff等等,19992);染色色体标定定(Quuiroos等,19991),品种鉴鉴定(HHu等119911),遗遗传变异异性分析析及系统统进化研研究(KK.G.Larrk等,19992,119933;I.Terrry等等,19995;T.MMillla
42、n等等,19996)。一般般而言,理想的的标记应应具备以以下几个个特点:1高度度的多态态性;22容易使使用;33数目丰丰富;44确切可可靠。对对于RAAPD,前三点点是其引引起人们们注意并并予以广广泛应用用的突出出属性。至至于可靠靠性,RRAPDD确实很很敏感,反应体体系及条条件稍有有变化,便会对对其结果果产生影影响。所所以应保保持DNNA模板板浓度,引物浓浓度,MMg+22浓度,热循环环反应条条件相同同,TaaqDNNA聚合合酶批次次一致。就就本实验验而言,试验均均进行22-3次次重复,重复性性很好,结果是是可靠的的。就某类特异异种质资资源,在在栽培品品种(或或品系)间,应应用RAAPD进进
43、行遗传传变异性性分析,这方面面的报道道很罕见见。本研研究聚类类分析结结果与亲亲缘关系系,地理理分布的的吻合性性,证实实了RAAPD用用于种内内品种间间遗传变变异性分分析的可可行性。利用聚类分分析不同同组间的的,遗传传距离较较大的广广谱抗源源做为杂杂交亲本本,利于于拓宽遗遗传基础础,在育育成品种种中积聚聚抗性基基因,形形成持久久抗性。而而利用不不同组间间的遗传传距离较较大同时时抗性表表现差异异又大的的材料做做为杂交交亲本、配配制杂交交组合,形成的的分离群群体中,分子标标记多态态性表现现的水平平将较高高,利于于构建分分子标记记框架图图谱,定定位抗性性基因。张志永永，陈受受宜，盖盖钧镒等等，栽培培大
44、豆品品种间RRAPDD标记的的多态性性分析及及聚类分分析，大大豆科学学，19998，117(11)：11-8大豆属(GGlyccinee)中有有2个一一年生种种:野生生大豆(Glyycinne ssojaa Siieb.et Zuccc.)和栽培培大豆GGlyccinee maax (L.) Meerr.。普普遍认为为一年生生野生大大豆是栽栽培大豆豆的祖先先,在野野生大豆豆向栽培培大豆的的演化过过程中,其形态态、生理理性状发发生了明明显的变变化,植植株由蔓蔓生变为为直立,籽粒由由小变大大。这些些性状的的变化是是在人工工选择的的作用下下向着有有利于人人类的方方向发展展的。关关于大豆豆的演化化、起源源问题,前人在在形态、农农艺性状状等方面面进行了了大量研研究。近近年来一一些研究究者运用用生化、分分子标记记研究大大豆的遗遗传演化化和多样样性问题题3,4,88,9,11。但由由于方法法和材料料的局限限性,尚尚未能得得出全面面结论。为为此,本本研究在在扩大样样本代表表性的基基础上,分析了了中国野野生大豆豆和栽培培大豆的的等位酶酶标记、细细