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1、纳米稀土荧光材料与时间分辨荧光免疫分析作 者：叶志强, 谭明乾 指导教师：袁景利, 王桂兰一室1011组摘要：在油油包水型型的微乳乳液中，合合成了三三种形状状规则、尺尺寸均匀匀的硅胶胶基质纳纳米稀土土荧光材材料。与与前驱体体相比，新新型荧光光纳米微微粒具有有更强的的荧光强强度和抗抗光漂白白性能。将将纳米微微粒表面面修饰并并标记链链酶亲和和素SAA（或抗抗体）后后应用于于时间分分辨荧光光免疫分分析，建建立了人人血清中中前列腺腺特异抗抗原（PPSA）、甲甲胎蛋白白（AFFP）和和乙肝表表面抗原原（HBBsAgg）的高高灵敏度度检测方方法。关键词：荧荧光纳米米微粒；稀土配配合物；生物标标记；时时间分
2、辨辨荧光免免疫分析析。 时间分分辨荧光光生物分分析技术术是基于于稀土荧荧光化合合物特殊殊荧光性性质而建建立起来来的一种种高灵敏敏度分析析方法，现已广泛泛应用于于免疫测测定、DDNA杂杂交测定定和荧光光显微镜镜成像测测定等生生化检测测的领域域1。该技技术利用用具有荧荧光寿命命长、SStokkes 位移大大和半峰峰宽窄等等特点的的稀土荧荧光配合合物作为为标记物物，不仅仅适用于于多标记记分析，而而且可完完全消除除各种散散乱光和和短寿命命荧光对对测定的的干扰，从从而实现现超高灵灵敏度分分析。基基于这些些优点，时间分辨荧光生物分析技术在近20年来取得了重大的发展，在临床医学与生命科学的实践与研究中发挥着
3、重要的作用。近年来，纳纳米尺度度发光材材料在生生化分析析领域中中的作用用受到了了越来越越多的关关注。量量子点22、胶体体金3、核壳壳型荧光光探针44等纳米米颗粒作作为标记记物已经经开始应应用于生生化检测测领域。但是由于纳米尺度的发光粒子的瑞利、拉曼和丁达尔散射产生的背景光对测定的严重干扰,影响了检测结果的灵敏度、精密度和准确度，无法实现高灵敏的定量分析。在我们的研研究中，综综合稀土土荧光标标记物和和纳米技技术的优优势，合合成了三三种具有有长寿命命荧光的的纳米稀稀土荧光光微粒55-7。新新型纳米米荧光微微粒用于于时间分分辨荧光光生物分分子分析析，不仅仅可从根根本上彻彻底消除除各种散散乱光和和短寿
4、命命荧光对对测定的的干扰，提提高分析析方法的的灵敏度度,而且且由于荧荧光配合合物被包包覆在硅硅胶的骨骨架结构构中,基基本隔绝绝了外部部环境对对配合物物的影响响，极大大地增强强了荧光光材料的的光稳定定性。实验部分1.掺杂型型纳米荧荧光微粒粒的制备备将160mmg NN,N,N1,N1-22, 66-biis(33-amminoometthyll-1-pyyrazzolyyl)-pheenyll- ppyriidinnettetrrakiis(aacettatee)-Tbb3+（BBPTAA-Tbb3+）溶溶于1.1 mml的水水后和2200l的四四乙氧基基硅（TTEOSS）搅拌拌下加入入到100
5、0 mml的圆圆底烧瓶瓶中，然然后再分分别加入入2.337 gg Trritoon XX-1000、11.877 g 正己醇醇和7.25gg环己烷烷，制成成W/OO型微乳乳液，在在剧烈搅搅拌下向向其中加加入含有有2.337 gg Trritoon XX-1000、11.877 g正正己醇、77.255g环己己烷及2200l浓氨氨水的另另一种微微乳液。室室温搅拌拌反应224小时时后，加加入500 mll丙酮结结束反应应。将反反应液离离心后除除去上清清液，沉沉淀部分分用乙醇醇和二次次蒸馏水水各洗三三次，真真空干燥燥后得到到白色硅硅胶包裹裹BPTTA-TTb3+纳米荧荧光微粒粒。2.掺杂型型纳米荧荧
6、光微粒粒用于测测定人血血清样品品中的PPSA将含抗人PPSA单单克隆抗抗体（110 g/mml）的的pH值值为9.6的00.1 moll/L的的碳酸钠钠缓冲溶溶液500 l分注注于966微孔板板的各孔孔中，44 oC, 24小小时包被被后，将将PSAA标准溶溶液（用用5% BSAA-0.9% NaCCl-00.1% NaaN3的pHH值7.8的00.055 mool/LL Trris-HCll溶液制制备）或或血清样样品455 l注入入上述包包被后的的微孔板板中。337 00C，11小时反反应后，用用含有00.055% TTweeen 220 的的pH值值7.88的0.05 moll/L Tri
7、is-HHCl缓缓冲溶液液（缓冲冲溶液11）洗两两次，再再用pHH值7.8的00.055 mool/LL Trris-HCll缓冲溶溶液（缓缓冲溶液液2）洗洗一次，然然后加入入45 l生物物素标记记的抗PPSA抗抗体溶液液，377 0C，11小时反反应后，用用缓冲溶溶液1洗洗两次，缓缓冲溶液液2洗一一次，再再加入445 l 纳纳米微粒粒标记的的SA溶溶液，337 00C，11小时反反应后，用用缓冲溶溶液1洗洗4次，然然后进行行固相时时间分辨辨荧光测测定。 3.共聚合合型纳米米荧光微微粒的制制备将160mmg BBPTAA-Tbb3+溶于11.1 ml的的水后和和2000l的TTEOSS搅拌下下
8、加入到到1000 mll的圆底底烧瓶中中，然后后再分别别加入22.377 g Triitonn X-1000、1.87 g正辛辛醇及77.255g环己己烷，制制成W/O型微微乳液，在在剧烈搅搅拌下向向其中加加入含有有2.337 gg Trritoon XX-1000、11.877 g正正辛醇、77.255g环己己烷及2200l浓氨氨水的另另一种微微乳液。室室温搅拌拌反应55小时后后，加入入6 l的33-22-(22-amminooethhylaaminno)eethyylamminooprropyyl- triimetthoxxysiilanne（AAEPSS），继继续搅拌拌19小小时后，加加
9、入500 mll丙酮结结束反应应。将反反应液离离心后除除去上清清液，沉沉淀部分分用乙醇醇和二次次蒸馏水水分别洗洗三次，真真空干燥燥后得到到白色的的共聚合合型硅胶胶包裹BBPTAA-Tbb3+纳米米荧光微微粒。4.共聚合合型荧光光纳米微微粒用于于测定人人血清样样品中的的AFPP将含抗人AAFP单单克隆抗抗体（110 g/mml）的的pH值值为9.6的00.1 moll/L碳碳酸钠缓缓冲溶液液50 l分注注于966微孔板板的各孔孔中，44 0C, 24小小时包被被后将AAFP标标准溶液液或血清清样品445 l注入入上述包包被后的的微孔板板中，337 00C，11小时反反应后，用用缓冲溶溶液1洗洗两
10、次，缓缓冲溶液液2洗一一次。加加入455 l纳米米荧光微微粒标记记的抗AAFP多多抗溶液液，377 0C，11小时反反应后，用用缓冲溶溶液1洗洗4次，然然后进行行固相时时间分辨辨荧光测测定。5. 共价价键合型型荧光纳纳米微粒粒的制备备将10.44mg氨氨丙基三三乙氧基基硅 (APSS，477 mmoll)，77.1mmmoll4,44-biis(11, 1,1,2,2,3,3-hepptaffluooro-4,6-hexxaneedioon-66-yyl)-chlloroosullfo-o- tterpphennyl (BHHHCTT)及33.555mmollEuCCl36H2O 加加入300
11、 l环己己烷中，超超声振荡荡反应115分钟钟后，反反应液加加入到含含有1.1 mml水，44.744 g Triitonn X-1000、3.64 g正辛辛醇及114.550 gg环己烷烷的W/O型微微乳液中中，搅拌拌0.55小时后后，加入入2000 l的TTEOSS和2000 l的浓浓氨水。室室温搅拌拌反应224小时时后，加加入400 mll丙酮结结束反应应。将反反应液离离心后除除去上清清液，沉沉淀部分分用乙醇醇和二次次蒸馏水水分别洗洗三次后后悬浮于于水中备备用。6. 共价价键合型型纳米微微粒用于于人血清清中乙肝肝表面抗抗原（HHBsAAg）测测定使用抗HBBsAgg单抗和和多抗进进行测定定
12、，测定定步骤与与掺杂型型纳米荧荧光微粒粒测定人人血清中中PSAA相同。结果和讨论论 1. 掺杂杂型纳米米荧光微微粒的制制备及时时间分辨辨荧光免免疫测定定PSAA掺杂型纳米米荧光微微粒的制制备原理理见图11。在表表面活性性剂和助助表面活活性剂的的作用下下，含有 TEOOS,BBPTAA-Tbb3+的水水溶液在在油相中中形成均均匀的小小液室，每一个个小液室室相当于于一个微微反应器器，TEOOS的水水合化和和聚合化化的过程程都被限限制在微微反应器器内。微反应应器的体体积主要要由水和和表面活活性剂的的比值所所决定，而微反反应器的的体积大大小又决决定了纳纳米颗粒粒的尺寸寸大小。我们用用这种方方法制备备了
13、直径径在422 33 nmm的纳米米颗粒(图2)，由电镜镜照片可可以看出出纳米颗颗粒形状状规则、尺尺寸均匀匀。图1 在微微乳液中中制备纳纳米微粒粒的原理理 图22 硅胶胶包裹BBPTAA-Tbb3+纳米米微粒的的电镜照照片纳米荧光微微粒表面面的硅胶胶经过修修饰后可可与生物物分子相相连。将将纳米荧荧光微粒粒与SAA共价结结合后，可可用于时时间分辨辨荧光免免疫测定定。PSSA是前前列腺癌癌诊断的的一个重重要指标标，现用用于临床床检测的的方法主主要有放放射性免免疫法和和酶联免免疫法，它它们的检检测灵敏敏度大约约在1000pgg/ml左右。而而最近的的研究表表明，如如果方法法的检测测灵敏度度可达到到2
14、0 pg/ml以下，那那么至少少可以提提前一年年诊断出出治疗后后前列腺腺癌患者者是否复复发。所所以发展展高灵敏敏度的血血中PSSA的检检测方法法显得十十分重要要。使用用BPTTA-TTb3+纳米微微粒标记记SA的的时间分分辨荧光光免疫分分析法测测定PSSA的工工作曲线线如图33所示，方方法的最最低检测测限为77 pgg/mll（用本本底信号号标准偏偏差的33倍计算算）。使使用本方方法对224个人人血清样样品的PPSA浓浓度进行行了测定定，并与与临床测测定的结结果进行行了比较较，两者者的相关关性见图图4。两两种方法法对244个人血血清样品品中PSSA浓度度测定结结果的相相关性方方程式为为y11.
15、011x00.0008，相相关系数数为0.9988，说明明使用纳纳米微粒粒作为标标记物的的测定方方法的结结果是完完全可信信的。图3用硅胶胶包裹BBPTAA-Tbb3+纳米微微粒标记记SA 图44 新方方法和临临床检测测法用于于24个个人血清清的时间分辨辨荧光免免疫测定定PSAA的工作作曲线 样品中中PSAA浓度测定定的相关关性2. 共聚聚合型纳纳米荧光光微粒的的制备及及时间分分辨荧光光免疫测测定AFFPAEPS和和TEOOS一样样，都可可以在氨氨水存在在的条件件下发生生水解和和聚合反反应。而而且它具具有的活活性基团团-NHH2在聚合合后会存存在于纳纳米微粒粒的表面面，为后后续标记记生物分分子提
16、供供极大的的方便。所所以，在在我们的的研究中中利用将将AEPPS和TTEOSS共聚合合的方法法在微乳乳液中制制备出了了表面带带有活性性氨基的的功能性性硅胶包包裹铽配配合物纳纳米荧光光微粒。其其电镜测测定结果果（见图图5）显显示这种种纳米微微粒不仅仅形状规规则，而而且粒径径分布范范围窄(453nm)。聚合后后存在于于纳米微微粒表面面的-NNH2基团使使得生物物标记更更加容易易。通过过简单的的方法将将纳米微微粒与抗抗AFPP抗体结结合后，建建立了一一种以纳纳米微粒粒为标记记物的时时间分辨辨荧光免免疫分析析方法用用于人血血清中AAFP的的测定，其其工作曲曲线见图图6。本本方法的的最低检检测限为为0.
17、11 ngg/mll，相对对标准偏偏差（CCV%）小于于9.00%，血清清添加回回收率在在84.0-98.0%范围，说说明该法法具有较较高的精精密度和和准确度度，可以以用于人人血清样样品的测测定。图5功能性性铽纳米米荧光微微粒的电电镜照片片 图图6 测定AAFP的的工作曲曲线3. 共价价键合型型纳米荧荧光微粒粒的制备备及时间间分辨荧荧光免疫疫测定HHBsAAgBHHCTT-Euu3+是一一种强荧荧光性铕铕配合物物，只是是它的水水溶性较较差，所所以在用用掺杂型型方法制制备纳米米微粒时时只有少少量的配配合物被被包进纳纳米微粒粒中，导导致制得得的纳米米微粒荧荧光很弱弱。而采采用共价价键合的的方法则则
18、不但可可以增加加每个纳纳米微粒粒中所包包含BHHHCTT-Eu3+分子的的个数，从而使得纳米微粒的荧光强度得到大幅度提高，而且一次性地在纳米微粒表面导入了自由氨基。电镜测定结果（见图7）显示该法制得的纳米微粒大小均匀，粒径为373nm。图7 共价价键合型型纳米微微粒的电电镜照片片 图88. 纳纳米微粒粒标记SSA（aa）和BBHHCCT-EEu3+标记SSA-BBSA（bb）测定定人血清清中HBBsAgg的工作作曲线将纳米微粒粒与SAA结合后后，用于于时间分分辨荧光光免疫测测定人血血清中的的HBssAg，其其工作曲曲线见图图8a。本本法的最最低检测测限为223pg/ml，证证明其灵灵敏度要要高
19、于直直接使用用BHHHCT-Eu3+为标记记物的测测定方法法（图88b，最最低检测测限为884pgg/mll）。该该法用于于人血清清样品测测定的相相对标准准偏差小小于100%，添加回回收率在在80-1100%范围，说说明该法法具有较较高的精精密度和和准确度度。结论本研究利用用微乳液液法制备备了三种种硅胶基基质纳米米稀土荧荧光微粒粒，制备备方法简简单且重重复性好好。所制备备的纳米米微粒形形状规则则、尺寸寸均匀，在在对其进进行表面面修饰后后用于生生物标记记及时间间分辨荧荧光免疫疫测定，建建立了人人血清中中PSAA、AFPP及HBsAAg的高高灵敏度度定量测测定方法法。由于于新型稀稀土荧光光微粒具具
20、有强荧荧光、强强抗光漂漂白性能能及易用用于生物物标记等等优点，预预计其在在荧光显显微镜生生物成像像测定及及生物芯芯片等领领域也有有重要的的应用前前景，这这部分的的研究工工作将在在近期展展开。注：本文系系由中国国科学院院领域前前沿项目目大连连化物所所青年基基金资助助参考文献：1. Soinii, EE.; Lvvgreen, T.CCRC Criit. Revv. AAnall. CChemm. 19987, 188, 1105-1544.2. Tayloor, J. R.;Fanng, M. M.;Niee, SS. AAnall. CChemm. 20000. 72. 19779-11986
21、6.3. Schrooedtter, A.;Weelleer, H. Anggew. Chhem. Innt. Ed.20002, 17, 32118-332211.4. Santrra, S.;Zhaang, P.;Waang, K.;Taapecc, RR.;TTan, W. Annal. Chhem. 20001, 733, 449888-49993.5. Ye, ZZ., Tann, MM., Wanng, G. andd Yuuan, J.Anaalytticaal CChemmisttry.20004，76, 5133-5118.6. Ye, ZZ., Tann, MM., Wan
22、ng, G. andd Yuuan, J.Tallantta.220044In preess. 7. Hai, X., Taan, M., Waang, G., YYe, Z., Yuuan, J. annd MMatssumooto, K.Anaalytticaal SScieencees 220044，20, 2445-2246.Fluorresccentt Laanthhaniide Nanno-mmateeriaals andd Tiime-Ressolvved FluuorooimmmunooasssayZhiqiiangg Yee annd MMinggqiaan TTanDire
23、cctedd byy Jiinglli YYuann annd GGuillan Wanng101 ggrouup, Depparttmennt oof AAnallytiicall ChhemiistrryAbstrractt: TThreee kkindds oof ssiliica-bassed fluuoreesceent lannthaanidde nnanooparrticcless haavinng rreguularr shhapee annd uunifformm siize havve bbeenn prrepaaredd annd ccharractteriizedd.
24、TThe novvel nannopaartiiclees aare strronggly fluuoreesceent andd hiighlly pphottosttablle ccomppareed wwithh laanthhaniide cheelattes. Thhe nnanooparrticcless weere useed ffor strrepttaviidinn orr anntibbodyy laabellingg. UUltrraseensiitivve ttimee-reesollvedd flluorroimmmunnoasssayys ffor proostaa
25、te speeciffic anttigeen (PSAA), a-feetopprotteinn (AAFP) annd hhepaatittis B ssurffacee anntiggen(HBssAg) inn huumann seerumm saamplles werre ddeveelopped by usiing thee naanoppartticlles as thee flluorresccencce pprobbes.Keywoordss: FFluooresscennt nnanooparrticcle, Laanthhaniide cheelatte, Bioolabbeliing, Tiime-ressolvved fluuorooimmmunooasssay.11