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1、生物化学学实验技技术操作作指导天津科技技大学生物化学学课程组组20066.122目录生物化学学实验须须知 2实验室一一些常用用知识介介绍 3实验一：离子交交换法分分离氨基基酸 7实验二：垂直板板聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳分离蛋蛋白质 9实验三：马铃薯薯多酚氧氧化酶制制备及性性质实验验13实验四：碱性蛋蛋白酶活活力的测测定16实验五:植物组组织中DDNA和和RNAA的提取取和鉴定定19实验六：糖酵解解中间产产物的鉴鉴定22实验七：综合设设计实验验蛋白质质的制备备及其含含量测定定24实验八：还原糖糖和总糖糖的测定定（3，5-二硝硝基水杨杨酸法）35实验九：发酵过过程中无无机磷的的利用37实验十：氨基
2、酸酸的分离离鉴定纸层析析法39实验十一一：细菌菌血栓溶溶解酶活活性测定定41实验十二二：可溶溶性糖的的硅胶GG薄层层层析43实验十三三：植物物材料中中总黄酮酮的提纯纯与鉴定定44实验十四四：IEEF/SSDS-PAGGE双向向电泳分分离鉴定定蛋白质质45附 录 49一、实验验室主要要仪器使使用操作作规程与与注意事事项49二、常用用缓冲溶溶液的配配制55三、硫酸酸铵饱和和度的常常用表60生物化学学实验须须知1实验验室规则则(1) 实验验课必须须提前55分钟到到实验室室,不迟到到,不早退退，应自自觉遵守守课堂纪纪律。(2) 使用用仪器、药药品、试试剂和各各种物品品必须注注意节约约, 应特特别注意意
3、保持药药品和试试剂的纯纯净, 严防混混杂污染染。(3) 实验台台、试剂剂药品架架必须保保持整洁洁, 仪器器药品摆摆放井然然有序。实实验完毕毕,需将药药品、试试剂排列列整齐, 仪器器洗净倒倒置放好好, 实验验台面抹抹拭干净净, 经教教师验收收仪器后后, 方可可离开实实验室。(4) 使用和和洗涤仪仪器时, 应小小心谨慎慎, 防止止损坏仪仪器。使使用精密密仪器时时, 应严严格遵守守操作规规程, 发现故故障应立立即报告告教师, 不要要自己动动手检修修。(5) 在实实验过程程中要听听从教师师的指导导, 严肃肃认真地地按操作作规程进进行实验验, 并简简要、准准确地将将实验结结果和数数据记录录在实验验记录本
4、本上。课课后写出出实验报报告, 由课代代表收齐齐交给教教师。(6)仪器损损坏时, 应如如实向教教师报告告, 真填填写损坏坏仪器登登记表, 然后后补偿一一定金额额。(7)每次实实验课安安排同学学轮流值值日, 值日生生要负责责当天实实验的卫卫生和安安全检查查。2实验验记录实验课前前应认真真预习实实验内容容，将实实验名称称、实验验原理、实实验内容容和步骤骤等简单单扼要写写在记录录本上。实实验记录录本要标标明页码码，不能能随意撕撕掉任何何一页。实验中使使用的试试剂纯度度和终浓浓度以及及使用的的仪器类类型等都都要记录录清楚。实实验中观观察到的的现象、结结果和得得出的数数据，应应及时直直接记在在记录本本上
5、，绝绝对不可可以随意意记在单单片纸上上。原始始记录必必须准确确、简练练、清楚楚。3实验验报告的的书写实验结束束后,应及时时整理和和总结实实验结果果, 写出出实验报报告。（1） 标题标题应包包括实验验名称、实实验时间间、实验验室名称称、实验验组号、实实验者及及同组者者姓名、实实验室条条件。（2） 实验目的的（3） 实验原理理应简述基基本原理理，不要要完全照照抄实验验指导书书。（4）操操作步骤骤操作步骤骤 (或方方法)可以采采用流程程图的方方式或自自行设计计的表格格来表达达。（5） 实验结果果将实验中中的现象象、数据据进行整整理、分分析，得得出相应应的结论论。建议议尽量使使用图表表法来表表示实验验
6、结果，这这样可以以使实验验结果清清楚明了了。（6） 讨论包括对实实验结果果及观察察现象的的小结、对对实验中中遇到的的问题和和思考题题的探讨讨以及对对实验的的改进意意见等。4生物物化学实实验课评评分标准准n 实验预习习情况（10%）n 实验操作作情况（20%）n 实验报告告情况（30%）n 实验考试试成绩（40%）实验室一一些常用用知识介介绍一玻璃璃仪器的的洗涤及及一些常常用的洗洗涤剂1. 玻玻璃仪器器的洗涤涤（1）新新购买的的玻璃仪仪器, 首先用用自来水水洗去表表面灰垢垢, 然后后用洗衣衣粉刷洗洗, 自来来水冲净净后, 浸泡在在 1%2% 盐酸酸溶液中中过夜以以除去玻玻璃表面面的碱性性物质。最
7、最后, 用自来来水冲洗洗干净, 并用用蒸馏水水冲洗 2 次次。（2）对对于使用用过的玻玻璃仪器器, 应先先用自来来水冲洗洗, 再用用毛刷蘸蘸取洗衣衣粉刷洗洗。用自自来水充充分冲洗洗后再用用蒸馏水水冲洗 2 次次。凡洗洗净的玻玻璃仪器器壁上都都不应带带有水珠珠, 否则则表示尚尚未洗净净, 需重重新洗涤涤。（3）比比较脏的的仪器或或不便刷刷洗的仪仪器, 使用前前应用流流水冲洗洗, 以除除去粘附附物, 如果仪仪器上有有凡士林林或其他他油污, 应先先用软纸纸擦除, 再用用有机溶溶剂擦净净，最后后用自来来水冲洗洗。待仪仪器晾干干后, 放入铬铬酸洗液液中浸泡泡过夜。取取出后用用自来水水充分冲冲洗, 再用蒸
8、蒸馏水冲冲洗 22 次。（4）普普通玻璃璃仪器可可在烘箱箱内烘干干, 但定定量的玻玻璃仪器器如吸管管、滴定定管、量量筒、容容量瓶等等不能加加热, 应晾干干备用。另另外, 分光光光度计中中的比色色杯的四四壁是用用特殊胶胶水粘合合而成, 受热热后会散散架, 所以也也不能烘烘干。对疑有传传染性的的样品 ( 如如肝炎病病人的血血清 ), 其其容器应应先消毒毒再清洗洗。盛过过剧毒药药物或放放射性同同位素物物质的容容器, 应先经经过专门门处理后后再清洗洗。2. 一一些常用用的洗涤涤剂a. 肥肥皂水或或洗衣粉粉溶液这是最常常用的洗洗涤剂, 主要要是利用用其乳化化作用以以除去污污垢, 一般玻玻璃仪器器均可用用
9、其刷洗洗。b. 铬铬酸洗液液 ( 重铬酸酸钾一硫硫酸洗液液 )铬酸洗液液广泛用用于玻璃璃仪器的的洗涤, 其清清洁效力力来自于于它的强强氧化性性 (66 价铬铬) 和强强酸性。铬铬酸洗液液具有强强腐蚀性性, 使用用时应注注意安全全。铬酸酸洗液可可反复使使用多次次, 如洗洗液由红红棕色变变为绿色色或过于于稀释则则不宜再再用。c. 55%110% 乙二胺胺四乙酸酸二钠 (EDDTA-Na22) 溶溶液: 加热煮煮沸, 利用 EED-TTA 和和金属离离子的强强配位效效应, 可去除除玻璃器器皿内部部钙镁盐盐类的白白色沉淀淀和不易易溶解的的重金属属盐类。d. 445% 的尿素素洗液: 是蛋蛋白质的的良好
10、溶溶剂, 适用于于洗涤盛盛蛋白质质制剂血血样的容容器。e.乙醇醇一硝酸酸混合液液用于清洗洗一般方方法难于于洗净的的有机物物, 最适适合于洗洗涤滴定定管。二生物物化学常常用缓冲冲液1. 磷磷酸盐缓缓冲液磷酸盐是是生物化化学研究究中使用用最广泛泛的一种种缓冲剂剂, 由于于它们是是二级解解离, 有2 个pkaa 值, 所以以用它们们配制的的缓冲液液, ppH 范范围最宽宽：NaH22P04：pKaa1=2.12, ppKa22=7.21Na2HHP044：pKaa1=7.21, ppKa22=122.322配酸性缓缓冲液：用 NNaH22P04, ppH 值值为 114 。配中性缓缓冲液：用混合合的
11、两种种磷酸盐盐, ppH 值值为 668。配碱性缓缓冲液：用 NNa2HP004, ppH 值值为 110112 。磷酸盐缓缓冲液的的优点为为：容易配配制成各各种浓度度的缓冲冲液; 适用的的 pHH 范围围宽; pHH 受温温度的影影响小;缓冲液液稀释后后 pHH 变化化小, 如稀释释 100 倍后后 pHH 的变变化小于于 0.1 。其缺点为为：易与常常见的CCa2+、 Mgg2+以及及重金属属离子缔缔合生成成沉淀;会抑制制某些生生物化学学过程, 如对对某些酶酶的催化化作用会会产生某某种程度度的抑制制作用。2.Trris缓缓冲液( 三羟羟甲基氨氨基甲烷烷) Triss 缓冲冲液在生生物化学学
12、研究中中使用的的越来越越多, 有超过过磷酸盐盐缓冲液液的趋势势, 如在在SDSS- 聚聚丙烯酷酷胶凝胶胶电泳中中己都使使用 TTriss 缓冲冲液, 而很少少再用磷磷酸盐。Triss 缓冲冲液的常常用有效效 pHH 范围围是在 中中性 范围围 , 例如Triss-HCCl 缓缓冲液ppH 值值为 77.58.55Triss- 磷磷酸盐缓缓冲液 pH 值为 55.09.00Triss-HCCl 缓缓冲液的的优点是是：因为 Triis 碱碱的碱性性较强 , 所所以可以以只用这这一种缓缓冲体系系, 配制制 pHH 范围围由酸性性到碱性性的大范范围 ppH 值值的缓冲冲液; 对生物物化学过过程干扰扰很
13、小, 不与与钙离子子及重金金属离子子发生沉沉淀。其缺点是是：缓冲液液的 ppH 值值受溶液液浓度影影响较大大, 缓冲冲液稀释释 100 倍 , pH 值的变变化大于于 0.1; 温度效效应大, 温度度变化对对缓冲液液 pHH 值的的影响很很大, 例如4时缓冲冲液的 pH 值为 88.4, 则37 时的 ppH 值值为 77.4, 所以以一定要要在使用用温度下下进行配配制, 室温下下配制的的 Trris-HCll 缓冲冲液不能能用于 044; 易吸收收空气中中的 CC02, 所以以配制的的缓冲液液要盖严严密封;此缓冲冲液对某某些 ppH 电电极发生生一定的的干扰作作用, 所以要要使用与与 Trr
14、is 溶液具具有兼容容性的电电极。3. 硼硼酸盐缓缓冲液常用的有有效 ppH 范范围是：pH 值为 88.510.0, 因而它它是碱性性范围内内最常用用的缓冲冲液, 其优点点是配制制方便, 只使使用一种种试剂, 缺点点是能与与很多代代谢产物物形成络络合物, 尤其其是能与与糖类的的短基反反应生成成稳定的的复合物物而使缓缓冲液受受到干扰扰。4. 氨氨基酸缓缓冲液此缓冲液液使用的的范围宽宽, 可用用于 ppH 值值为 22.011.0, 例如最最常用的的有：甘氨酸 -HCCl 缓缓冲液：pH 值为 22.05.00 。甘氨酸 -NaaOH 缓冲液液：pHH 值为为 8.0111.00 。甘氨酸 -T
15、rris 缓冲液液：pHH 值为为 8.0111.00( 此此缓冲液液用于广广泛使用用的 SSDS 聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳的电极极缓冲液液 ) 。组氨酸缓缓冲液：pH 值为 55.56.55 。甘氨酰胺胺(gllyciine amiide) 缓冲冲液：ppH 值值为 77.88.88 。甘氨酰甘甘氨酸 (gllycyylgllyciine 缓冲冲液：ppH 值值为 88.09.00 。此类缓冲冲体系的的优点是是：为细细胞组分分和各种种提取液液提供更更接近的的天然环环境。其缺点是是：与羧酸酸盐和磷磷酸盐缓缓冲体系系相似, 也会会干扰某某些生物物化学反反应过程程, 如代代谢过程程等; 试剂的的价
16、格较较高。三pHH 值的的测定测定溶液液 pHH 值通通常有两两种方法法, 最简简便但较较粗略的的方法是是用 ppH 试试纸, 分为广广泛和精精密 ppH 试试纸两种种。精确测定定溶液 pH 值要使使用 ppH 计计, 其精精确度可可达 00.0005 个个 pHH 单位位, 关键键是要正正确选用用和校对对 pHH 电极极。过去去是使用用两个电电极, 即玻璃璃电极和和参比电电极, 现在它它们已淘淘汰, 被两种种电极合合一的复复合电极极所代替替。玻璃电极极对溶液液中的氢氢离子浓浓度敏感感, 其头头部为一一薄玻璃璃泡, 内装有有 0.lmool/LL HCCl, 上部由由银 -氯化银银电极与与铂金
17、丝丝联结。当当玻璃电电极浸入入样品溶溶液时, 薄玻玻璃泡内内外两侧侧的电位位差取决决于溶液液的 ppH 值值, 即玻玻璃电极极的电极极电位随随样品溶溶液中氢氢离子浓浓度 ( 活度 ) 的变化化而变化化。参比电极极的功能能是提供供一个恒恒定的电电位, 作为测测量玻璃璃电极薄薄玻璃泡泡内外两两侧电位位差的参参照。常常用的参参比电极极是甘汞汞电极(Hg/HgCCl) 或银 -氯化银银电极 (Agg/AggCl) 。参参比电极极电位是是氯离子子浓度的的函数, 因而而电极内内充以 4mool/LL KCCl 或或饱和 KC11, 以以保持恒恒定的氯氯离子浓浓度和恒恒定的电电极电位位。使用用饱和 KCll
18、 是为为使电极极内沉积积有部分分 KCCl 结结晶, 以使 KKCl 的饱和和浓度不不受温度度和湿度度的影响响。现在 ppH 值值测定已已都改用用玻璃电电极与参参比电极极合一的的复合电电极, 即将它它们共同同组装在在一根玻玻璃管使使用时应应注意：(1) 经常检检查电极极内的 4mool/LL KCCl 溶溶液的液液面, 如液面面过低则则应补充充 4mmol/L KKCl溶溶液。(2) 玻璃泡泡极易破破碎, 使用时时必须极极为小心心。(3) 复合电电极长期期不用, 可浸浸泡在 2mool/LL KCCl 溶溶液中, 平时时可浸泡泡在无离离子水或或缓冲溶溶液中, 使用用时取出出, 用洗洗并冲洗洗玻
19、璃泡泡部分, 然后后用吸水水纸吸干干余水, 将电电极浸入入待测溶溶液中 , 稍稍加搅拌拌, 读数数时电极极应静止止不动, 以免免数字跳跳动不稳稳定。(4) 使用时时复合电电极的玻玻璃泡和和半透膜膜小孔要要浸入到到溶液中中。(5) 使用前前要用标标准缓冲冲液校正正电极, 其数数据见书书后附录录, 常用用的 33 种标标准缓冲冲液pHH 值 4.00 、 6.88 和 9.23(20 ), 精度度为 0.0022pH 单位。校校正时先先将电极极放入 6.888 的的标准缓缓冲液中中, 用 pHH 计上上的 标准准 旋钮校校正 ppH 读读数, 然后取取出电极极洗净, 再放放入 ppH 值值为 44
20、.000 或 9.23 的标准准缓冲液液中, 用 斜率 旋钮钮校正 pH 读数, 如此反反复多次次, 直至至二点校校正正确确, 再用用第三种种标准缓缓冲液检检查。标标准缓冲冲液不用用时应冷冷藏。(6) 电极的的玻璃泡泡容易被被污染。若若测定浓浓蛋白质质溶液的的 pHH 值时时, 玻璃璃泡表面面会覆盖盖一层蛋蛋白质膜膜, 不易易洗净而而干扰测测定, 此时可可用 00.1mmol/L HHCl 的lInnurnnl 胃胃蛋白酶酶溶液浸浸泡过夜夜。若被被油脂污污染, 可用丙丙酣浸泡泡。若电电极保存存时间过过长, 校正数数值不准准时, 可将电电极放入入 2mmol/L KKCl 溶液中中 ,400 加
21、热 llh 以以上, 进行电电极活化化。pH 测测定时会会有几方方面的误误差：(1) 钠离子子的干扰扰：多数数复合电电极对 Na+ 和 H+ 都非非常敏感感, 尤其其是高 pH 值的碱碱性溶液液 ,NNa的干干扰更加加明显。例例如 , 当 Naa+ 浓浓度为 0.11moll/L 时, 可使使 pHH 值偏偏低 00.4 0.5 个个单位。为为减少 Na+ 对 pHH 测定定的干扰扰, 每个个复合电电极都应应附有一一条校正正Na+ 干扰扰的标准准曲线, 有的的新式的的复合电电极具有有 Naa+ 不不透过性性能, 如不具具备以上上两个条条件, 则可以以将电极极内的 KCll 换成成NaCCl。(
22、2 浓度效效应：溶溶液的 pH 值与溶溶液中缓缓冲离子子浓度和和其他盐盐离子浓浓度有关关, 因为为溶液 pHH 值取取决于溶溶液中的的离子活活度而不不是浓度度, 只有有在很稀稀的溶液液中, 离子的的活度才才与其浓浓度相等等。生化化实验中中经常配配制比使使用浓度度高 110 倍倍的 贮液液 , 使用用时再稀稀释到所所需浓度度，由于于浓度变变化很大大，溶液液pH会有有变化，因因此稀释释后仍需需对其ppH进行行调整。(3）温温度效应应：有的的缓冲液液的pHH受温度度影响很很大，如如Triis 缓缓冲液，因因此配制制和使用用都要在在同一温温度下进进行。实验一：离子交交换法分分离氨基基酸一、实验验目的学
23、习用阳阳离子交交换树脂脂柱分离离氨基酸酸的操作作方法和和基本原原理。二、实验验原理离子交换换层析（ion exchange chromatography，简称ICE）是分析和制备样品混合物的液-固相层析方法，是基于待测物质的阳离子或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质的酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附原理将电解质溶液各组分分开。它是从复杂混合物体系中分离性质极为相似的生物分子的有效手段之一。由于带电荷不同的各种物质对离子交换剂有不同亲和力，通过改变洗脱液的离子强度和pH值，控制这种亲和力，即可使这些物质依据亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。氨基酸是是两性电电解质，
24、分分子上的的净电荷荷取决于于氨基酸酸的等电电点和溶溶液的ppH值，各各种氨基基酸分子子结构不不同，在在同一ppH值时时所带电电荷的性性质（正正、负）和和多少不不同，与与离子交交换树脂脂的亲和和力有差差异，因因此可根根据亲和和力从小小到大的的顺序被被洗脱液液分别洗洗脱下来来，达到到分离的的效果。三、仪器器与试剂剂（一）实实验器材材（1）玻玻璃层析析柱（2）试试管（3）移移液管（4）恒恒压洗脱脱瓶（5）部部分收集集器（6）水水浴锅（7）分分光光度度计（8）电电炉（二）材材料与试试剂（1）苯苯乙烯磺磺酸钠型型树脂（100200目）（2）22moll/L盐盐酸溶液液（3）22moll/L氢氢氧化钠钠溶
25、液（4）标标准氨基基酸溶液液：将天天门冬氨氨酸和赖赖氨酸分分别配成成2mgg/mLL的0.11moll/L盐盐酸溶液液。（5）混混合氨基基酸溶液液：将上上述天门门冬氨酸酸和赖氨氨酸溶液液按1：4比例混混合。（6）柠柠檬酸-氢氧化化钠-盐酸溶溶液（ppH5.8，钠钠离子浓浓度0.45mmol/L）：取柠檬檬酸144.255克、氢氧氧化钠99.300克分别溶溶于水后后混合，加加入浓盐盐酸5.255毫升，定定容至5500毫毫升；44冰箱保保存。（7）显显色剂：2克水合茚茚三酮溶溶于955%乙醇醇中，加加水至1100毫毫升。四、操作作步聚（1）层层析柱的的准备：将强酸酸性阳离离子交换换树脂用用氢氧化化
26、钠处理理成Naa+型后洗洗至中性性，搅拌拌1小时后后装入层层析柱，使使之自然然降沉到到一定高高度，用用缓冲液液平衡。（2）平平衡：用用pH55.8的的柠檬酸酸缓冲液液冲洗平平衡离子子交换柱柱，调节节流速，收收集洗脱脱液至44倍床体体积即可可上样。（3）加加样分离离：将液液面缓慢慢放至贴贴近层析析柱表面面，由柱柱上端仔仔细加入入氨基酸酸混合液液0.22500.5毫毫升，同同时开始始收集流流出液。当当样品液液弯月面面靠近树树脂顶端端时，立立即加入入0.55毫升柠柠檬酸缓缓冲液。待待缓冲液液弯月面面靠近树树脂顶端端时，再再加入00.5毫毫升柠檬檬酸缓冲冲液。如如此重复复两次，然然后用滴滴管小心心注入
27、柠柠檬酸缓缓冲液（切切勿搅动动床面）。用用试管收收集洗脱脱液，每每管收集集1毫升，直直至无氨氨基酸流流出为止止。（4）氨氨基酸的的鉴定：向各管管收集液液中加入入1毫升水水合茚三三酮显色色剂并混混匀，在在沸水浴浴中加热热15分钟钟，冷至至室温测测定光密密度值。以以收集的的管数为为横坐标标，以吸吸光度值值A为纵坐坐标，绘绘制洗脱脱曲线。（用用以已知知两种氨氨基酸的的纯溶液液为样品品，按上上述方法法和条件件分别操操作，将将得到的的洗脱曲曲线与混混合氨基基酸的洗洗脱曲线线对照，即即可确定定两个峰峰为何种种氨基酸酸。）五、思考考题1.何谓谓氨基酸酸的离子子交换？本实验验采用的的离子交交换剂属属于哪一一种
28、？2.离子子交换树树脂用缓缓冲液平平衡，为为何又用用缓冲液液冲洗？实验中中为什么么要用ppH5.8的柠柠檬酸缓缓冲液？可不可可以用其其它pHH值的缓缓冲液？如果可可以，应应选用的的pH为多多少？并并阐述原原理。3.茚三三酮显色色剂在与与氨基酸酸显色时时，是与与氨基酸酸的什么么基团反反应？反反应条件件是什么么？显色色时为什什么要沸沸水浴加加热？显显色原理理是什么么？4.本实实验分离离的两种种氨基酸酸，是否否可以采采用阴离离子交换换树脂分分离，如如果使用用阴离子子树脂，条条件和结结果如何何？请说说明原理理。5.除氨氨基酸外外，用离离子交换换柱层析析法还适适合分离离哪些物物质？为为什么？实验二：垂直
29、板板聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳分离蛋蛋白质一、实验验目的 学学习SDDS-聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳法法(SDDSPAGGE)测测定蛋白白质的分分子量的的原理和和基本操操作技术术。二、实验验原理 蛋白质质是两性性电解质质，在一一定的ppH条件件下解离离而带电电荷。当当溶液的的pH大大于蛋白白质的等等电点(pI)时，蛋蛋白质本本身带负负电，在在电场中中将向正正极移动动；当溶溶液的ppH小于于蛋白质质的等电电点时，蛋蛋白质带带正电，在在电场中中将向负负极移动动；蛋白白质在特特定电场场中移动动的速度度取决于于其本身身所带的的净电荷荷的多少少、蛋白白质颗粒粒的大小小和分子子形状、电电场强度度等。 聚丙烯烯
30、酰胺凝凝胶是由由一定量量的丙烯烯酰胺和和双丙烯烯酰胺聚聚合而成成的三维维网状孔孔结构。本本实验采采用不连连续凝胶胶系统，调调整双丙丙烯酰胺胺用量的的多少，可可制成不不同孔径径的两层层凝胶；这样，当当含有不不同分子子量的蛋蛋白质溶溶液通过过这两层层凝胶时时，受阻阻滞的程程度不同同而表现现出不同同的迁移移率。由由于上层层胶的孔孔径较大大，不同同大小的的蛋白质质分子在在通过大大孔胶时时，受到到的阻滞滞基本相相同，因因此以相相同的速速率移动动；当进进入小孔孔胶时，分分子量大大的蛋白白质移动动速度减减慢，因因而在两两层凝胶胶的界面面处，样样品被压压缩成很很窄的区区带。这这就是常常说的浓浓缩效应应和分子子
31、筛效应应。同时时，在制制备上层层胶(浓浓缩胶)和下层层胶(分分离胶)时，采采用两种种缓冲体体系；上上层胶ppH=66.76.88，下层层胶pHH8.9；TTrissHCII缓冲液液中的TTriss用于维维持溶液液的电中中性及ppH，是是缓冲配配对离子子；CII-是前导导离子。在在pH66.8时时，缓冲冲液中的的Glyy-为尾随随离子，而而在pHH8.9时，GGly的的解离度度增加；这样浓浓缩胶和和分离胶胶之间ppH的不不连续性性，控制制了慢离离子的解解离度，进进而达到到控制其其有效迁迁移率之之目的。不不同蛋白白质具有有不同的的等电点点，在进进入分离离胶后，各各种蛋白白质由于于所带的的静电荷荷不
32、同，而而有不同同的迁移移率。由由于在聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳中中存在的的浓缩效效应，分分子筛效效应及电电荷效应应，使不不同的蛋蛋白质在在同一电电场中达达到有效效的分离离。 如果在在聚丙烯烯酰胺凝凝胶中加加入一定定浓度的的十二烷烷基硫酸酸钠(SSDS)，由于于SDSS带有大大量的负负电荷，且且这种阴阴离子表表面活性性剂能使使蛋白质质变性，特特别是在在强还原原剂如巯巯基乙醇醇存在下下，蛋白白质分子子内的二二硫键被被还原，肽肽链完全全伸展，使使蛋白质质分子与与SDSS充分结结合，形形成带负负电性的的蛋白质质SDSS复合物物；此时时，蛋白白质分子子上所带带的负电电荷量远远远超过过蛋白质质分子原原有的电
33、电荷量，掩掩盖了不不同蛋白白质间所所带电荷荷上的差差异。蛋蛋白质分分子量愈愈小，在在电场中中移动得得愈快；反之，愈愈慢。蛋蛋白质的的分子量量与电泳泳迁移率率之间的的关系是是：Mr=KK(100-bm) loggMr=LoogKbRm，式中 Mr蛋白白质的分分子量；logKK截距距；b斜斜率；Rm相对迁迁移率。实验证明明，蛋白白质分子子量在115,00002000,0000的范范围内，电电泳迁移移率与分分子量的的对数之之间呈线线性关系系。蛋白白质的相相对迁移移率Rmm蛋白白质样品品的迁移移距离染料(溴酚蓝蓝)迁移移距离。这这样，在在同一电电场中进进行电泳泳，把标标准蛋白白质的相相对迁移移率与相相
34、应的蛋蛋白质分分子量对对数作图图，由未未知蛋白白的相对对迁移率率可从标标准曲线线上求出出它的分分子量。 SSDS-聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳(SDDS-PPAGEE)法测测定蛋白白质的分分子量具具有简便便、快速速、重复性好的的优点，是是目前一一般实验验室常用用的测定定蛋白质质分子量量的方法法。三、试剂剂及主要要器材1主要要试剂1)标准准蛋白混混合液内含：磷磷酸化酶酶(Mww 944,0000)，牛牛血清蛋蛋白(MMw 667,0000)，肌动动蛋白(Mw 43,0000)，磷磷酸酐酶酶(Mww 300,0000)和和溶菌酶酶(Mww 144,0000)2)300凝胶胶贮备液液：Accr 330g
35、，BBis 0.88g,加加蒸馏水水至1000mLL3)分离离胶缓冲冲液(11.5mmolL): Trris 18.15gg,加水水溶解,6mool/LL HCCl调ppH8.9,定定容1000mLL4)浓缩缩胶缓冲冲液(00.5mmolL): Trris 6g,加加水溶解解，6mmol/L HHCl调调pH66.8，并并定容到到1000mL5)电极极缓冲液液(pHH8.33)：SSDS lg，TTriss 6gg，Glly 228.88g，加水溶溶解并定定容到110000mL。用用时稀释释五倍。6)100SDDS7)100过硫硫酸铵(新鲜配配制)8)1TEMMED9)上样样缓冲液液：0.5m
36、oolLL Trris-HCll pHH6.88 11.255mL，550甘甘油4mmL，110SSDS 2mLL，巯基基乙醇00.4mmL，00.1溴酚蓝蓝0.44mL，加加蒸馏水水定溶至至10mmL。10)00.255考马马斯亮蓝蓝R-2250染染色液：考马斯斯亮蓝RR-2550 11.255g，550甲甲醇4554mLL，冰乙乙酸466mL。11)脱脱色液：冰乙酸酸 355mL，蒸蒸馏水4465 mL。12)未未知分子子量的蛋蛋白质样样品(11mgmL )2实验验器材1) DYCZZ-244D垂直直板电泳泳槽(北北京市六六一仪器器厂)2) 电泳仪3) 长滴管及及微量加加样器4) 烧杯(2
37、250mmL、5500mm1)、量量筒(5500mmL、 2500m1)、培养养皿(115cmml5cmm)5) 注射器等等四、实验验操作1 装板将密封用用硅胶框框放在平平玻璃上上，然后后将凹型型玻璃与与平玻璃璃重叠，将将两块玻玻璃立起起来使底底端接触触桌面，用用手将两两块玻璃璃夹住放放入电泳泳槽内，然然后插入入斜插板板到适中中程度, 即可可灌胶。2 凝胶的聚聚合分离胶和和浓缩胶胶的制备备：按下下表中溶溶液的顺顺序及比比例，配配置100的分分离胶和和4.88的浓浓缩胶。试剂名称称10%的的分离胶胶/mLL4.8%的浓缩缩胶/mmLAcr/Biss 300%分离胶缓缓冲液（ppH8.9）浓缩胶缓
38、缓冲液（ppH6.8）10%SSDS10%过过硫酸铵铵水TEMEED53.75500.1550.1511.601.2550.10.14.9551按上表各各液加入入混匀后后配制成成分离胶胶后，将将凝胶液液沿凝胶胶腔的长长玻璃板板的内面面缓缓用用滴管滴滴入，小小心不要要产生气气泡。将将胶液加加到距短短玻璃板板上沿22cm处处为止,约5mmL。然然后用细细滴管或或注射器器仔细注注入少量量水,约约0.55-1mmL。室室温放置置聚合330-440miin。待分离胶胶聚合后后，用滤滤纸条轻轻轻吸去去分离胶胶表面的的水分，按按上表制制备浓缩缩胶。用用长滴管管小心加加到分离离胶的上上面，插插入样品品模子(梳
39、子)；待浓浓缩胶聚聚合后，小小心拔出出样品模模子。3蛋白白质样品品的处理理 若若标准蛋蛋白质或或欲分离离的蛋白白质样品品是固体体，称取取lmgg的样品品溶解于于lmLL 0.5moolLL pHH6.88Triis-盐盐酸缓冲冲液或蒸蒸馏水中中；若样样品是液液体，要要测定蛋蛋白质浓浓度，按按1.001.5mggmLL溶液比比例，取取蛋白质质样液与与样品处处理液等等体积混混匀。本本实验所所用样品品为155200mg的标标准蛋白白样品溶溶液，放放置在00.5mmL的离离心管中中，加入入1520ml的样样品处理理液。在在1000水浴中中处理22minn，冷却却至室温温后备用用。 吸吸取未知知分子量量
40、的蛋白白质样品品20ml，按按照标准准蛋白的的处理方方法进行行处理。4 加样SDS-聚丙烯烯酰胺凝凝胶垂直直板型电电泳的加加样方法法用手夹住住两块玻玻璃板,上提斜斜插板使使其松开开,然后后取下玻玻璃胶室室去掉密密封用硅硅胶框,注意在在上述过过程中手手始终给给玻璃胶胶室一个个夹紧力力,再将将玻璃胶胶室凹面面朝里置置入电泳泳槽,插插入斜板板,将缓缓冲液加加至内槽槽玻璃凹凹面以上上,外槽槽缓冲液液加到距距平板玻玻璃上沿沿3mmm处即可可,注意意避免在在电泳槽槽内出现现气泡。 加加样时可可用加样样器斜靠靠在提手手边缘的的凹槽内内，以准准确定位位加样位位置，或或用微量量注射器器依次在在各样品品槽内加加样
41、，各各加100155ml(含蛋蛋白质110115mg)，稀稀溶液可可加200300ml (还还要根据据胶的厚厚度灵活活掌握)。 5电泳泳 加加样完毕毕，盖好好上盖，连连接电泳泳仪，打打开电泳泳仪开关关后，样样品进胶胶前电流流控制在在1520mmA，大大约155200minn；样品品中的溴溴酚蓝指指示剂到到达分离离胶之后后，电流流升到330445mAA，电泳泳过程保保持电流流稳定。当当溴酚蓝蓝指示剂剂迁移到到距前沿沿122cm处处即停止止电泳，约约1-22小时。如如室温高高，打开开电泳槽槽循环水水，降低低电泳温温度。6染色色、脱色色 电电泳结束束后，关关掉电源源，取出出玻璃板板，在长长短两块块玻
42、璃板板下角空空隙内，用用刀轻轻轻撬动，即即将胶面面与一块块玻璃板板分开，然然后轻轻轻将胶片片托起，指指示剂区区带中心心插入铜铜丝作为为标志，放放入大培培养皿中中染色，使使用0.25的考马马斯亮蓝蓝染液，染染色24h，必必要时可可过夜。 弃弃去染色色液，用用蒸馏水水把胶面面漂洗几几次，然然后加入入脱色液液，进行行扩散脱脱色，经经常换脱脱色液，直直至蛋白白质带清清晰为止止。7结果果处理1)测量量脱色后后凝胶板板的长度度和每个个蛋白质质样品移移动距离离(即蛋蛋白质带带中心到到加样孔孔的距离离)，测测量指示示染料迁迁移的距距离。2)按以以下公式式计算蛋蛋白质样样品的相相对迁移移率(RRm)相对迁移移率
43、样样品迁移移距离(cm)染料料迁移距距离(ccm)3)标准准曲线的的制作：以各标标准蛋白白质相对对迁移率率为横坐坐标，蛋蛋白质分分子量的的对数为为 纵坐坐标在半半对数坐坐标纸上上做图，得得到一条条标准曲曲线。4)测定定蛋白质质样品的的分子量量：根据据待测蛋蛋白质样样品的相相对迁移移率，从从标准曲曲线上查查得该蛋蛋白质的的分子量量。五、思考考题1 聚丙烯酰酰胺盘状状凝胶电电泳的几几个不连连续性是是什么？2 电泳时的的三个物物理效应应是什么么？是怎怎样造成成的？3 电泳后上上下槽缓缓冲液可可否混合合后再使使用？为为什么？4 上样缓冲冲液中加加入甘油油的作用用是什么么？5 贮液配制制及贮存存应注意意
44、什么？6 过硫酸铵铵、7%乙酸和和考马斯斯亮蓝在在实验中中有什么么作用？实验三：马铃薯薯多酚氧氧化酶制制备及性性质实验验一、实验验目的1 学习从组组织细胞胞中制备备酶的方方法。2 掌握多酚酚氧化酶酶的作用用及各种种因素对对其作用用的影响响。二、实验验原理多酚氧化化酶是一一种含铜铜的酶，其其最适ppH值为为677。由多多酚氧化化酶催化化的反应应，如以以邻苯二二酚为底底物，可可以被氧氧化形成成邻苯二二醌。由由多酚氧氧化酶催催化的氧氧化还原原反应可可通过溶溶液的颜颜色的变变化鉴定定，这个个反应在在自然界界中是常常见的，如如去皮的的马铃薯薯和水果果变成褐褐色就是是由于该该酶作用用的结果果。多酚氧化化酶的最最适底物物是邻苯苯二酚（儿儿茶酚）。间间苯二酚酚和对苯苯二酚与与邻苯二二酚的结结构相似似，它们们也可以以被氧化化为各种种有色物物质。酶是生物物催化剂剂，其催催化活性性易受各各种因素素的影响响，如温温度、ppH、底底物种类类、底物物浓度、酶酶浓度以以及抑制制剂和蛋蛋白质变变性剂等等都会改改变其生生物催化化活性。三、实验验器材1匀浆浆机2