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1、Evaluation Warning: The document was created with Spire.Doc for .NET.液相色谱培培训讲义(十)x转载载自：发布日期期：20077-5-222第十一章 柱子的应应用与维护护 色色谱柱的液液相色谱系系统获得分分离的中心心部件，许许多分离问问题都归结结于色谱柱柱。对柱注注意适当的的维护，则则可缓解许许多故障的的发生。 柱柱故障主要要是由机械械、色谱或或者化学方方面的原因因引起的。维维护色谱柱柱和排除故故障，；需需要懂得液液相色谱的的分离过程程以及色谱谱柱本身的的构造是非非常重要的的。色谱柱柱的价格昂昂贵，应避避免人为地地损坏，并并尽
2、可能延延长其寿命命。一、色谱柱柱的种类与与评价 一一般地说，根根据样品的的性质决定定采用何种种液相色谱谱方法，然然后再选择择不同类型型的柱。即即不同类型型的柱则代代表了不同同的色谱方方法。 不不同种类色色谱柱的差差异在于柱柱结构、柱柱填料和柱柱尺寸的不不同。 色色谱柱有不不同的尺寸寸(长度和内内径)，分制备备型、常规规分析型和和微型。不不同类型柱柱的硬件也也不同，(包括接头头、柱管等等方面)，还有径径向加压柱柱和夹套加加热柱等。 不不同液相色色谱法的尺尺寸根据需需要可以选选取，普通通分析330cm长，内径48mm。常用20cm长、4.6mmm内径的柱柱。制备型型柱内径一一般为8mm、25cm长
3、。微型型柱内径l3mm，长1020cm。不同的的填料分析析的效果可可能不同，这这是因为生生产过程不不同所致。同同一厂商生生产的同种种填料因批批号不同也也会有差异异，这种差差异可能从从基质就开开始(表面积、杂杂质、特殊殊处理)，还有键键合的化学学物质(一氯或三三氯硅烷反反应剂)，不同厂厂家生产的的填料还会会因专利技技术(预处理、键键合过程、填填装技术)等不同而而呈现较大大差异。由由于种种差差异、仅能能假设同一一批号的柱柱有基本相相同的性质质。 多多数柱填料料基质采用用多孔硅胶胶微粒，通通常有球形形和无定形形两种，具具有不同的的粒度、孔孔径和表面面积。多孔孔聚合物微微粒也适用用于反相色色谱。聚合合
4、物柱的流流动相范围围广，流动动相pH值可在1至一三之之间。而硅硅胶基质pH仅能在2.5和7之间。显显然，聚合合物柱要好好一些，但但目前仍是是以硅胶基基质的柱为为主。原则则上，聚合合物柱可以以克服硅胶胶基质柱的的某些不足足，但需要要大量的实实验来证实实，要进一一步考查聚聚合物基质质填料的全全面优越性性。 在在实际工作作中，选择择性能良好好的柱可得得到好的结结果，首先先要注意柱柱径、长度度、填料种种类和填料料粒度。 评评价柱的好好坏不仅只只是N数，还应应考虑组分分在柱上的的保留、键键合相表面面的物性、柱柱压降以及及峰不对称称因子As等。每一一根新柱都都应标出详详细参数，主主要内容包包括公司名名称、
5、柱名名称(商标)、柱填料料、尺寸。附附一张标准准参考色谱谱图，并标标出色谱条条件、样品品名称、流流动相组成成、流速、柱柱温、进样样体积、检检测器、峰峰的保留时时间及峰名名称等。评评价一根色色谱柱的主主要指标是是：塔板数N值；峰不对称称因子As；柱压降；键合相浓浓度。二、色谱柱柱预防性保保护与柱寿寿命的延长长 通通常，一根根色谱柱在在分析数千千个样品之之后性能仍仍然保持良良好，但也也有的柱仅仅分析不多多的样品后后几乎就报报废了。影影响柱寿命命和其它问问题的因素素很多，而而有些因素素是操作者者很难控制制的，如果果被分析的的样品(如分析生生物样品)，怎么净净化样品也也是“脏”的，对于于色谱柱的的影响
6、是非非常大的。然然而采取下下列措施后后，在多数数情况下总总能够人为为地减少柱柱上故障，达达到延长寿寿命的目的的。1、加流路路过滤器和和保护柱 流流路过滤器器紧靠进样样阀后面，位位于分析柱柱前。0.5m烧结不锈锈钢片夹在在死体积很很小的套子子中，挡住住来源于样样品和进样样阀垫圈的的微粒入柱柱。因为每每个样品都都过滤既费费事又带来来误差，样样品量少过过滤更困难难，因此流流路上装过过滤器是比比较省事的的办法。也也可以在流流路加上保保护柱，放放在流路过过滤器和分分析柱之间间，或者代代替流路过过滤器。保保护柱的使使命是收集集阻塞柱进进口的来自自样品的化化学“垃圾”。这种垃垃圾最终降降低柱效能能。保护柱柱
7、是消耗品品，分析50100个比较脏脏的样品之之后就要调调换新的。保保护柱应该该是小体积积，用分析析柱的同种种填料填装装。保护柱柱使用得当当，对分离离无影响，好好像未装保保护柱一样样。有些厂厂商的商品品将保护柱柱和流路过过滤器连在在一个单元元内，使用用起来非常常方便。自自己填装保保护柱都是是用短柱、不不超过3cm长，内径23mm，用较大大粒度的填填粒(一五20m)干法填装装，会使分分析柱效略略微有所降降低。2、避免高高压冲击 一一般色谱柱柱都能经得得起高压，但但经不起突突然变化的的高压冲击击。引起高高压突然冲冲击，主要要是因样品品阀的缓慢慢转动、泵泵起动快、柱柱切换操作作等。转动动六通进样样阀时
8、从泵泵到柱的液液流会瞬时时切断。在在阀的泵侧侧压力升高高，在阀的的柱侧压力力降低(变化超过20)。阀转到到底后压力力突然冲击击一下恢复复正常。手手动进样阀阀的变化不不大，自动动进样阀比比较慢，可可能造成压压力冲击，可可用氦气代代替空气驱驱动进样阀阀。因氮压压缩系数小小。另外泵泵起动不应应过快，可可分步操作作。如用3mLmin流速，先先从lmLmin到2mLmin，然后再3mLmin，每个间间隔应大于于20s。柱切换换技术的应应用也很广广泛，切换换过程中在在色谱柱的的入口处压压力在零到到很大数字字之间变化化，会很快快使柱报废废。3、分离条条件 多多数色谱柱柱有很宽的的试验条件件范围，但但具体应用
9、用又受到限限制，主要要是pH值、柱温温和流动相相的选择。 硅硅胶为基质质的键合相相要求PH在2.57之间，极极端pH的流动相相能“溶解”硅胶，使使键合相流流失。结果果非碱性组组分的保留留不断减少少，碱性组组分的保留留增加，引引起碱性组组分峰变宽宽。如果一一定要用高高或低pH的流动相相，可加预预柱(饱和柱)。预柱装装在泵和进进样阀之间间，用分析析柱相同的的填料填装装，或者用用普通硅胶胶。硅胶饱饱和了流动动相，减少少了分析柱柱填料的损损失。预柱柱不要求柱柱效高，用用价格低的的一般硅胶胶疏松地填填装，按期期检查硅胶胶的溶解情情况。用预预柱也有不不利的影响响，即新流流动相难以以平衡，保保留时间不不稳定
10、或稳稳定慢。使使用了预柱柱一定要加加流路过滤滤器，以防防止硅胶微微粒引起的的麻烦。 以以硅胶为基基质的柱和和阴离子交交换柱超过过60后，会增增加对流动动相中化学学物质的吸吸附。在高高温下用小小颗粒柱引引起柱床塌塌陷，降低低柱效，改改变峰形。在40以上使用3m柱，70以上使用5m柱，会使值降低50。 有有些流动相相中的溶剂剂不能用于于某些柱，如如小颗粒的的聚苯乙烯烯填料不能能用于非水水的排阻色色谱。另一一方面，有有些柱与某某些溶剂(如四氢呋呋喃)一旦达到到平衡，不不要随意改改用其它溶溶剂。有关关这些特殊殊填料，可可以参见有有关资料。 水水溶性流动动相会引起起微生物生生长而造成成阻塞柱。色色谱柱应
11、存存放在纯有有机溶剂或或加了50有机溶溶剂的水中中。凝胶柱柱可存放在在水溶性缓缓冲液中，同同时加0.01叠氮钠钠以防止微微生物的生生长。4、净化样样品 用用溶剂溶解解的样品，多多数组分在在一定的时时间内能完完全从柱中中流出来，不不会造成危危害。有些些样品可能能含有微粒粒物质，样样品中的某某种组分(如蛋白质)在柱头上上沉积下来来，组分在在固定相上上保留很强强，溶剂带带走柱填料料等，这些些都会造成成柱效能下下降或对柱柱寿命的影影响，有必必要采取措措施防止柱柱变坏。 如如在光线照照射下观察察样品是浑浑浊的或带带有乳白色色，进样前前必须要过过滤虽然然流路上装装有过滤器器和保护柱柱，但不能能代替样品品的
12、前处理理，样品中中过多的微微粒会使过过滤器和保保护柱超载载，很快阻阻塞，或者者微粒进入入分析柱，所所以在进样样前必须过过滤样品。 若若怀疑样品品与流动相相混合有沉沉淀而对色色谱柱有阻阻塞，应先先试验一下下，看样品品溶液加入入流动相中中有无变浑浑或乳白色色出现。如如果进样后后压力突然然增加而后后又慢慢减减小，表明明样品中有有微粒或发发生沉淀。如如有沉淀要要设法改变变分离条件件，包括换换样品溶剂剂和流动相相或处理样样品去掉不不溶物质。应应尽量用小小体积的样样品。 有有些样品能能很强地吸吸附在柱填填料上，这这样会降低低塔板数，改改变样品的的保留物质质外，还要要加保护柱柱，定期清清洗色谱柱柱。有时因因
13、为疏忽，用用对柱有害害的溶剂溶溶解样品，比比如用6molL的氢氧化化钠溶解样样品，这样样的样品只只要进50100L到硅胶基基质柱中，硅硅胶就很快快溶解而使使柱报废。在在这种情况况下，应立立即中和样样品，或除除去原溶剂剂中的有害害成分。5、用强溶溶剂定期冲冲洗柱 每每次工作结结束，用强强溶剂冲洗洗柱是良好好的习惯。可可用甲醇、乙乙腈冲反相相柱，冲去去留在柱上上的强吸附附组分。用用甲醇水为为流动相时时也应冲洗洗。冲洗的的程序在以以下章节中中介绍。柱柱头的烧结结不锈钢滤滤片，要求求平整，死死体积小，孔孔径适当(25m)。过滤片片选择不好好会改变色色谱峰形，增增加阻力或或起不到阻阻挡污染物物的作用(填
14、料很快快变色)。 此此外，对柱柱硬件的保保养也不可可忽视实实际操作中中应注意以以下几点：接头要配配套，用同同一厂商的的组接件；接头之间间、柱压帽帽螺母与密密封卡套之之间无微粒粒(填料)，否则收收紧时容易易咬死；密封卡套套与柱管一一次性卡紧紧后再也不不能松动，所所以拆开柱柱头再上紧紧时要小心心，不能使使卡套移动动，原来柱柱端的不锈锈钢滤片和和垫片的厚厚度和强度度也不能改改变(改变这些些附件的性性能就促使使卡套移动动；接头等组组接件不要要拧得过紧紧，适当上上紧后接上上泵试验，分分步拧紧，直直到不漏为为止还有有非常重要要的是柱硬硬件的损坏坏往往会造造成不可挽挽回的损失失。综上所述，如如何保护良良好的
15、柱性性能与柱寿寿命：O认真阅读读色谱柱使使用说明书书；O使用填充充良好的色色谱柱；O尽量减少少压力波动动，避免机机械及热冲冲击；O使用保护护柱及在线线过滤器；O经常以强强溶剂冲洗洗色谱柱；O充分过滤滤样品及流流动相，尽尽量避免杂杂质微粒与与强保留成成分；O用稳定的的固定相(C一八最稳定)：O在中等ppH值操作时(68)，用有机机缓冲溶液液；O色谱柱使使用温度最最好小于40；O硅胶基质质的色谱柱柱，应保持持流动相的的pH值范围在3.08.0；O在水流动动相与缓冲冲溶液中加加200pppm的叠氮钠钠；O流动相中中含有缓冲冲溶液，应应注意用95：5的水及有有机溶剂过过滤，有机机溶剂不能能低于5；O过
16、夜或贮贮存时，冲冲洗掉盐和和缓冲液，用用纯有机溶溶剂流动相相保存(乙腈最好)。三、怎样选选择色谱柱柱 现现代高效液液相色谱中中，分离效效果好坏很很大程度上上取决于色色谱填料的的选择。但但是色谱填填料的选择择范围很宽宽，要做合合适的选择择，必须对对此有一定定的认识和和了解。1.硅胶基基质填料（1）正相相色谱 正正相色谱用用的固定相相通常为硅硅胶(Sillica) 以及其他他具有极性性官能团，如如胺基团(NH2APS)和氰基团(CN,CPS)的键合相相填料。由于硅胶表表面的硅羟羟基(SiOOH)或其他极极性基团极极性较强，因因此，分离离的次序是是依据样品品中各组份份的极性大大小，即极极性较弱的的组
17、份最先先被冲洗出出色谱柱。 正正相色谱使使用的流动动相极性相相对比固定定相低 ，如：正正己烷(Hexxane)、氯仿(Chllorofform)、二氯甲甲烷(Metthyleene CChlorride)等。（2）反相相色谱反相色谱用用的填料常常是以硅胶胶为基质表表面键合有有极性相对对较弱的官官能团的键键合相。反相色谱所所使用的流流动相极性性较强，通通常为水、缓缓冲液与甲甲醇、乙腈腈等的混合合物。样品流出色色谱的顺序序是极性较较强的组份份最先被冲冲洗出，而而极性弱的的组份会在在色谱柱上上有更强的的保留。常用的反相相填料有：C一八(ODDS)、C8(MOSS)、C4(buttyl)、C6H5(P
18、heenyl)等。2.聚合物物填料聚合物填料料多为聚苯苯乙烯-二乙烯基基苯或聚甲甲基丙烯酸酸酯等，其其主要优点点是在pH值为114均可使用用。相对于硅胶胶基质的C一八填料，这这类填料具具有更强的的疏水性；大孔的聚聚合物填料料对蛋白质质等样品的的分离非常常有效。 现现有的聚合合物填料的的缺点是相相对硅胶基基质填料，色色谱柱柱效效较低。3.其它无无机填料 其其它HPLC的无机填填料色谱柱柱也已经商商品化。由由于其特殊殊的性质，一一般仅限于于特殊的用用途。如，石石墨化碳正正逐渐成为为反相色谱谱柱填料。这这种填料的的分离不同同于硅胶基基质烷基键键合相，石石墨化碳的的表面即是是保留的基基础，不再再需其它
19、的的表面改性性。该柱填填料一般比比烷基键合合硅胶或多多孔聚合物物填料的保保留能力更更强。石墨墨化碳可用用于分离某某些几何异异构体，又又由于在HPLC流动相中中不会被溶溶解，这类类柱可在任任何pH与温度下下使用。氧氧化铝也用用于HPLC，氧化铝铝微粒刚性性强，可制制成稳定色色谱柱柱床床，其优点点是可在pH高达12的流动相相中使用。但但由于氧化化铝与碱性性化合物作作用也很强强，应用范范围受到一一定的限制制，所以未未能广泛应应用。新型型氧化锆基基质色谱填填料也可用用于HPLC，商品化化的仅有聚聚合物涂层层的多孔氧氧化锆微球球色谱柱，应应用pH范围114，温度可可达100。由于氧氧化铝填料料是最近几几
20、年才开始始研究，加加之面临的的实验难度度，其重要要用途与优优势尚在进进行中。四、怎样选选择填料粒粒度 目目前，商品品化的色谱谱填料粒度度从1m到超过30m均有售，而而目前分析析分离主要要用3、5和10m填料，填填料的粒度度主要影响响填充柱的的两个参数数，即柱效效和背压。粒粒度越小，填填充柱的柱柱效越高；然而粒度度越小，柱柱压越大，柱柱压的增加加限制了粒粒度小于3m的填料应应用。在相相同选择性性条件下，提提高柱效可可提高分离离度，但不不是唯一的的因素。如如果固定相相选择是正正确，但是是分离度不不够，那么么选用更小小粒度的填填料是很有有用的。3m填料填充充柱的柱效效比相同条条件下的5m填料的的的柱
21、效提高高近30；然而而，3m的色谱柱柱的背压却却是5m的2倍。与此此同时，柱柱效提高意意味着在相相同条件下下可以选用用更短的色色谱柱，以以缩短分析析时间。另另外，可以以采用低粘粘度的溶剂剂做流动相相或增加色色谱柱的使使用温度，比比如用乙腈腈代替甲醇醇，以降低低色谱柱的的压力。名称别名功能基团正相反相离子对应用Silica非极性和中等极性以及非离子性有机化合物SASC1-OH在所有的烷基键合相中对非极性于中等极化合物保留最弱；典型用于中等极性和多官能团化合物。BtylC4-(CH3)3分离肚和蛋白质，保留时间比C8和C一八短。MOSC8,Octyl-C4H9中等极性到强极性化合物，小肽和蛋白质，
22、极性药物、甾族环境样品。ODSC一八-C8H37烷基键合相中对中等极性化合物保留最强。广泛用于药物、甾族化合物、脂肪酸和环境样品。CPSCN,Cyano(Propyl nitrile)-(CH2)3CN对极性化合物有独特的选择性，适合应用于正相分离。当用于反相系统时，其选择性与C8和C一八不同。在药学领域和复杂混合物的分离中应用广泛。APSNH2(Amino propy)-(CH2)3NH2反相中分析糖类和其他极性化合物。弱阴离子交换，阴离子和有机酸则应用缓冲剂和有机改性剂做流动相。正相中与硅胶的选择性不同，分析芳香族效果很好。Phenyl-(CH3) C3H5芳香族化合物Diol-(CH2)
23、2OCH2(CH2OH)2反相时，分离肽和蛋白质。正相时，与硅选择性相似，但极性较弱SCX强阳离子次换-(CH2)2C6H4 SO3H-有机碱SAX强阴离子交换-(CH2)3N+（(CH3)3有机酸、核苷和核苷酸五、如何选选择保护柱柱 怎怎样选择保保护柱，但但又不影响响分离分析析?这是色谱谱工作者经经常提出的的一个问题题。通常，在在选择保护护柱之前首首先要考虑虑的是样品品是否清洁洁。对于大大部分分析析工作者来来说，一支支lcm长的保护护柱便能提提供对柱子子的保护，工工作中发现现要经常更更换1cm的保护柱柱，那么应应选择2cm或3cm长的保护护柱。保护护柱越长，自自然所装填填的色谱填填料越多，则
24、则其越能避避免污染物物进入分析析色谱柱的的机会。当当然，随着着保护柱的的长度加长长，样品的的保留时间间会比使用用短保护柱柱长。一般来说，保保护柱的内内径与分析析色谱柱的的内径相同同或相当即即可。 保保护柱的填填料装填方方式也很重重要。目前前有薄膜装装填法的保保护柱，使使用过程很很简单方便便，而且可可以在实验验室中进行行干装。但但是，其最最大的缺点点是不经济济，特别是是针对中国国的具体情情况，一次次性使用相相对费用较较高。另外外，薄膜装装填法的保保扩性所装装填的色谱谱填料有限限，只能提提供很有限限的保护作作用；不过过也因为所所装填的色色谱填料较较少，保护护柱的长度度也较短，所所以对分析析样品的保
25、保留时间的的影响也很很小。 另另一种保护护柱结构其其实质是缩缩短了的色色谱分析柱柱，设计方方式上有直直连式、手手紧式或整整体式。整整体式设计计是由色谱谱柱的生产产厂商直接接安装在色色谱分析柱柱上的，必必须与色谱谱分析柱一一同订货，可可以非常方方便地使用用，但不能能够被修改改。直连式式结构设计计可在任何何时候由色色谱工作者者来安装连连接，可以以与任何品品牌的色谱谱分析柱连连接使用，而而且还可以以根据样品品的相关情情况选择不不同的保护护柱一样，只只是在连接接时不需要要借助扳手手等工具，直直接用手上上紧即可。另另外从保护护柱结构的的角度看，保保护柱的结结构又分为为是否可以以更换保护护柱柱芯。现现在大
26、多数数的保护柱柱均可以更更换保护柱柱柱芯，可可以降低保保护柱的使使用成本。大大多数人是是根据色谱谱分析柱的的填料选择择保护柱的的填料，正正常情况下下可以选择择与分析色色谱柱一样样的色谱填填料。但是是，根据实实际的分析析工作，也也可不必与与分析色谱谱柱的填料料完全相匹匹配。 对对于选择保保护柱的原原则是：在在满足分析析分离要求求的前提条条件下，尽尽可能地选选择较短的的保护柱结结构，尽可可能选择对对分离样品品小一些保保留性的填填料。六、故障与与解决的方方法 选选样了一根根好的柱子子，再加上上有效的维维护与预防防，可以避避免不少意意外故障的的发生。当当然谁也不不能保护色色谱柱“永远”不出故障障，任何
27、一一根色谱柱柱最终都会会因为柱效效下降直到到报废。柱柱损坏的标标志是：塔板数下下降；峰形改变变；压力增加加；保留时间间变化。有有时往往是是几种情况况伴随着同同时发生。1、塔板数数下降 在在色谱柱使使用过程中中，塔板数数会不断下下降一般般情况下，进2000个样品后柱效N值要降低50，(但也不能一概而论)，而用C一八，柱梯度分析氨基酸，进100个血清样品之后，柱效就下降50%。这两种情况的差别之所以这么大，关键在于处理样品的方法不同。 如如果柱效很很快下降，应应考虑上节节所提到的的人为不利利因素。N值突然下下降(如一个工工作日内)，应考虑虑柱头塌陷陷或进了不不合格的样样品。如果果使用了不不同系统的
28、的色谱柱造造成柱效下下降，是某某系统中存存在柱外效效应。新建建立的方法法中柱效下下降，可能能是样品和和其它内在在因素引起起，此时要要采取相应应措施，防防止继续给给柱造成危危害。2、峰形变变坏 出出现拖尾峰峰、分叉峰峰或非高斯斯峰的原因因很多，但但总是与塔塔板数骤然然下降联系系在一起的的。峰形变变坏而保留留时间不变变，多半是是柱受到阻阻塞(不锈钢烧烧结片)，或者柱柱头有了空空穴。 3、压力增增加 和和柱塔板数数不断减少少一样，在在使用过程程中柱压慢慢慢增加，可可视为正常常。如果压压力一下子子增加过高高，应考虑虑两种可能能，一是样样品沉积在在柱内，二二是柱内硬硬件阻塞(未考虑系系统其它部部分的阻塞
29、塞)。 对对于第一种种情况，要要用能溶解解所用样品品的溶剂冲冲洗。冲洗洗时拆开柱柱与检测器器之间接头头，正向冲冲洗或将柱柱出口接在在泵上反向向冲洗(如果柱条条件许可)，使用大大约3050mL溶剂。不不要让冲洗洗液通过检检测器流动动池，以防防污染。在在冲洗过程程中不断检检查，直到到压力恢复复正常为止止。如冲洗洗无效，应应该考虑是是第二种情情况，先换换烧结不锈锈钢过滤片片，拆下柱柱，拧开柱柱头上的压压帽，持垂垂直方向小小心取出不不锈钢过滤滤片，换上上新的(不是洗过过的旧滤片片)。换滤片片时尽量不不要搅动柱柱头填料，如如有塌陷，可可用同种填填料中乙醇醇调成糊状状补平柱头头，压紧，压压平，柱性性能可恢
30、复复如前。如如果柱头填填料己脏，可可挖去23mm，用新填填料补平。4、保留时时间的改变变 保保留时间的的变化指两两种类型的的情况，第第一种是同同一根柱样样品间的保保留变化，第第二种类型型主要是填填料的差异异造成的，许许多实验都都会碰到，现现讨论如下下。 不不同牌号的的色谱柱分分离的色谱谱峰保留时时间可在小小范围内移移动，但峰峰的顺序和和分辨率不不变，可改改变流速或或溶剂强度度(反相色谱谱加水调节节)进行校正正。如果谱谱图中色谱谱顺序发生生了变化，或或者两峰重重叠在一起起，问题就就比较严重重。保留时时间发生大大的变化，主主要由柱填填料硅酸相相互作用所所致，另外外有次级保保留因素的的影响。硅硅胶为
31、基质质的填料表表面含有硅硅醇，有的的封尾填料料可部分去去掉硅醇、不不封尾填料料的硅胶表表面硅醇基基更多。酸酸性或碱性性分子可与与硅醇发生生不同程度度的相互作作用。硅酸酸与样品分分子作用的的强弱，因因不同批号号的硅胶和和不键合相相填料而异异。即使同同批号的硅硅胶而不同同批号的键键合相也有有差异。硅硅醇对阳离离子或碱性性样品影响响最大。参参照下列要要求做可以以减少色谱谱柱之间保保留时间的的变化。 (1)仅用同一一厂商的柱柱。实际上上不具可操操作性，但但最起码作作某一专门门分析方法法时要用同同一厂商的的柱。 (2)设计分离离条件，使使保留值变变化最小(建立标准准的方法)。 (3)选用液相相色谱系统统
32、或色谱柱柱对次级保保留因素(外界)灵敏度最最低。 (4)换新柱时时调整分析析条件保持持旧柱的保保留值(改变条件)。这一步步工作是必必不可少的的，在长期期的常规分分析中，不不会从头至至尾用一根根柱，中间间总要换新新柱，每换换一次，都都应仔细地地调整各组组分的保留留。 在在实际工作作中，应考考虑到可能能会发生什什么问题，怎怎样预防这这些问题的的发生。 第第一，前面面提到的作作某一专门门分析尽量量用同一批批号的柱。也也可与厂商商接洽，提提出特殊的的要求。 第第二，选择择硅醇影响响最小的分分离条件，减减少柱间的的差异。如如在流动相相中添加三三乙胺抑制制硅醇的作作用。 第第三，许多多色谱工作作者认为，在
33、在流动相中中加入离子子对试剂更更能抗硅醇醇的干扰，使使保留具有有更好的重重复性。 不不管什么情情况下引起起保留值的的明显变化化，都应该该改善分离离条件。 改改善特别差差的峰的分分离度，并并使保留值值稳定下来来。例如用用梯度洗脱脱分析体液液中的氨基基酸，这种种复杂的样样品有20多个组分分，保留稍稍有变化可可能对分离离就产生灾灾难性的结结果。一些些极端组分分，如偏向向酸性或碱碱性的组分分很易发生生保留值的的改变，应应用不同流流动相的组组成、pH值和缓冲冲液的浓度度，可以改改善关键色色谱峰间的的分离。色色谱峰分离离度变差，可可能会系统统地改变保保留值。 塔塔板数降低低、压力增增高、峰形形变差、保保留
34、值变化化可能同时时发生，可可能都是由由柱引起的的。下表的的内容可帮帮助找到一一些故障的的原因，有有些内容将将在后面的的章节中详详细讨论。表11-11 由柱引起起的故障 故 障现象解决办法过滤片阻塞柱头塌陷键合相流失样品阻塞强吸附的样品压力增高，N下降，峰形差峰分叉，N下降保留改变，峰形差，N下降高压N下降，保留减小倒柱冲洗或换过滤片修补柱头，可恢复80以上换柱用能溶解样品的溶剂冲洗柱强溶剂反冲七、延长柱柱寿命的方方法 一一根柱到了了不可使用用的时候应应更换。“不可挽救”这个概念念在许多色色谱工作者者的认识上上不完全相相同，有人人认为只有有当柱的压压力增高到到系统不可可承受的地地步才考虑虑报废，
35、只只要压力在在可接受的的范围内总总要设法修修补，以延延长柱的寿寿命。另另外也可以以从分析高高要求的样样品改作分分析低要求求的样品，从从分离多组组分的样品品改作分离离单组分的的样品，从从分离介质质复杂的样样品改为分分离介质相相对简单的的样品。实实验室最常常用的延长长柱寿命的的方法是修修补柱头、换换不锈钢烧烧结片，冲冲洗、倒冲冲柱。 修修补柱头和和换不锈钢钢结片常联联系在一起起，前面已已简单作了了叙述。去去掉过滤片片后发现柱柱头塌陷或或填料被污污染，可用用无水乙醇醇调成糊状状的同种填填料(挖去脏填填料)填补柱头头，用与柱柱内径相同同的、顶端端平而光滑滑的不锈钢钢或聚四氟氟乙烯棒压压紧，再填填平，再
36、压压紧，反复复35次，最后后用无水乙乙醇将柱头头四周润湿湿几次，擦擦干净柱外外壁的填料料、加上新新过滤片，拧拧紧接头，接接上泵冲洗洗，而后再再接检测器器。如果塌塌陷很深，或或者挖去的的脏填料很很多，填平平柱头后接接上泵冲洗洗一五min，再拆下下柱填平，再再接上泵冲冲洗，反复复数次可恢恢复大部分分柱效。有有时还应该该用比较高高的流速才才能有效。 修修补过的柱柱一般不能能恢复到原原先的柱效效，刚开始始修补数次次效果不错错，随着修修补次数的的增多，维维持一个短短时间又要要修补，到到了后期，键键合相随硅硅胶的溶蚀蚀而流失，加加上化学物物质的腐蚀蚀，此时再再也无法修修补了。 对对价格高的的柱一定坚坚持自
37、己动动手修补。如如排阻色谱谱柱不随时时间而改变变保留，仅仅需比较低低的分离条条件，稍为为修补就可可解决问题题。 倒倒冲柱也是是经常采用用的维护措措施，不提提倡新柱倒倒冲柱。色色谱柱用到到中后期，而而且修补过过多次后才才考虑逆向向反冲。可可在倒冲柱柱前填平原原柱头的塌塌陷现冲洗洗，也可倒倒向冲洗后后再填平柱柱头(原柱出口)，后者效效果好一些些。柱逆向向使用后柱柱效损失较较大(约4060)，常常可可以倒过来来再倒过去去，只要不不破坏柱床床，效果还还不错。倒倒冲柱前要要检查柱两两端的烧结结过滤片情情况，防止止烧结过滤滤片(原柱头承承受过度压压力，填料料被泵打出出)。 在在采取以上上措施时，冲冲洗过程
38、应应伴随始终终。 有有少数实验验室自己装装柱，或请请厂商装柱柱。柱硬件件都是用过过的旧柱，这这可节约50的经费费，但有时时也碰到一一些麻烦。柱柱内壁未经经再抛光处处理，柱壁壁效应比较较大，分辨辨率降低，或或者拖尾峰峰。重装柱柱后卡套易易松动，整整个柱头渗渗漏。可借借助于聚四四氟乙烯软软膜密封，但但已不能承承受较高的的压力。 对对有些柱重重新处理是是值得的，但但有些则无无价值。除除考虑价格格外，还要要考虑实际际工作要求求。任何柱柱都可以修修补数次，样样品处理好好、流动相相温和、压压力中下可可以减少修修补柱的次次数。柱压压升高超过过系统所承承受的限度度就要报废废柱。实验验室内要备备有不同类类型的散
39、装装填料(C一八、硅胶)，用同类类型、同粒粒度的填料料修补柱头头效果好。如如果手头没没有所要求求的填料，可可以用其它它填料代替替，这比用用柱头塌陷陷的柱要好好得多。八、如何解解决色谱柱柱使用过程程出现的问问题1.保留值值与分离度度重现性不不好原因分分析问题原因表现不同色谱柱间差异使用期间柱变化填料、键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解强保留组分堆积堵塞保留因子(k)，分离因子()柱效(N) 保留因子(k)，分离因子()柱效(N)保留因子(k)，柱效(N)柱外效应系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。柱效（N)分离效果变差流
40、动相组分改变流速改变温度改变保留因子(k)，柱效变化很小保留因子(k)，分离因子（）保留因子(k)，柱效变化很小柱平衡慢重新平衡时间不够保留因子(k)，柱效变化很小柱超载样品量太大保留因子(k)，柱效(N)液相色谱培训讲义(十一)x转载自：发布日期：2007-5-22八、如何解决色谱柱使用过程出现的问题1.保留值与分离度重现性不好原因分析问题原因表现不同色谱柱间差异使用期间柱变化填料、键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解强保留组分堆积堵塞保留因子(k)，分离因子()柱效(N) 保留因子(k)，分离因子()柱效(N)保留因子(k)，柱效(N)柱外效应系统差异、进样量大、进样阀与色谱柱之间、色
41、谱柱与检测器之间的管路太长、检测器流通池体积大、接头死体积大等。柱效（N)分离效果变差流动相组分改变流速改变温度改变保留因子(k)，柱效变化很小保留因子(k)，分离因子（）保留因子(k)，柱效变化很小柱平衡慢重新平衡时间不够保留因子(k)，柱效变化很小柱超载样品量太大保留因子(k)，柱效(N)2.造成色谱峰(不对称)拖尾的原因(1)色谱柱本身填装问题，筛板堵塞或填料塌陷(2)柱头有污染(3)样品超载(4)样品溶剂不合适(5)柱外效应(6)化学或二次保留(硅羟基)效应(7)缓冲容量不足或不合适(8)重金属污染3.如何解决峰形拖尾的问题A、与化学有关的拖尾问题(1)流动相中，加入30mM的三乙胺(
42、用于碱性化合物)或醋酸胺(用于酸性化合物)，未知化合物加醋酸三乙胺；(2)如仍然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲辛胺）；(3)降低进样量到1g。B、与色谱柱有关的拖尾问题(l)如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96的二氯甲烷与4甲醇，加l氢氧化铵混合液冲洗；正向柱可用甲醇冲洗；(2)使用保护柱；C、与HPLC系统有关的峰拖尾和峰加宽(1)进样体积过大，(通常25L)：(2)进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过大(最佳连接管应20cm，内径为0.007)；(3)检测器流通池的体积过大。4.如何贮存色谱柱(1)防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物，做到流动相用多少配
43、多少，或在水流动相中加20ppm叠氮钠以抑制细菌生长(一定当心其毒性和潜在的爆炸性)；或在流动相中加20的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气。(2)尽可能将色谱柱贮存于100有机溶剂(乙腈最好)中，避免在缓冲液中保存。(3)使用缓冲液后的色谱柱，应用一五20倍柱体积的不含缓冲剂的同种水-有机溶剂流动相冲洗色谱柱换成100有机溶剂贮存。(4)避免用纯水冲洗键合致密的C一八柱。(5)将色谱柱两端用堵头拧好，以免柱床填料干裂。九、谱图问题液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来，其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决，而其他的问题必须通过修改操作程序来解决，对于色谱柱
44、和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。A、峰拖尾原因解决方法1、筛板阻塞1、a、反冲色谱柱b、更换进口筛板c、更换色谱柱2、色谱柱塌陷2、填充色谱柱3、干扰峰3、a、使用更长的色谱柱b、改变流动相或更换色谱柱4、流动相pH选择错误4、调整pH值。对于碱性化合物，低pH值更有利于得到对称峰5、样品与填料表面的活性点发生反应5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰b、更改色谱柱B、峰前延原因解决方法1、柱温低1、升高柱温2、样品溶剂选择不恰当2、使用流动相作为样品溶剂3、样品过载3、降低样品含量4、色谱柱损坏4、见A1、A2C、峰分叉原因解决方法1、保护柱或分析柱污染1、取下保护柱再分析。也可更
45、换保护柱。拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，可运用适当的再生措施。若还不行，可能是入口处堵，可以更换筛板或色谱柱。2、样品溶剂不溶于流动相2、改变样品溶剂，如果可能，采取流动相作为样品溶剂D、含量高的成分峰原因解决方法1、样品溶剂选择不恰当1、减少样品载量E、早出的峰变形 原因解决方法1、样品溶剂选择不恰当1、a、减少进样体积b、运用低极性样品溶剂F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰原因解决方法1、柱外效应 1、a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）b、使用小体积的流通池G、K增加时，脱尾更严重原因 解决方法1、二级保留效应，反相模式 2、a、加入三乙胺 b、加入乙酸c、加入盐或缓冲剂d、更换一支柱子2、二级保留效应，正相模 2、a、加入三乙胺 b、加入乙酸c、加入水 d、试用另一种方法3、二级保留效应，离子对 3、加入三乙胺H、酸性或碱性化合物的峰拖尾原因 解决方法1、缓冲不合适 1、a、使用浓度50-100mmol/L的缓冲液b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液I、额外的峰 原因 解决方法1、样品中有其他组分 1、正常2、前一次进样的洗脱峰 2、a、增加运行时间或梯度b、使用pH等于流动相pH的缓冲液3、空位或鬼峰