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1、认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目遗传工程胚胎工程操作对象基因（基因工程）基因（基因工程）早期胚胎、配子技术手段获取目的基因获取目的基因构建表达载体构建表达载体目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞目的基因检测与鉴定目的基因检测与鉴定胚胎移植体外受精胚胎分割胚胎干细胞培养理论基础中心法则中心法则哺乳动物受精卵早期胚胎发育规律认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目中心法则：在细胞分裂过程中，遗传信息通过DNA的复制传递给子代，在子代
2、的个体发育过程中遗传信息又从DNA传递到RNA，最后翻译成特异的蛋白质，在某些病毒（如烟草花叶病毒等）中的RNA能够自我复制，指导病毒蛋白质生物合成，某些病毒（如致癌病毒等）还能以RNA为模板逆转录成DNA。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目基因敲除动物基因敲除动物 基因敲入动物基因敲入动物 根据外源基因在染色体上的整合情况，可将遗传工程动物分为以下几类：转基因动物转基因动物 染色体工程动物染色体工程动物 认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精
3、准扶贫”项目 将特定的外源基因或经过改造的自身基因成分通过各种技术手段导入动物受精卵或胚胎内，使之稳定整合于动物的染色体基因组并能遗传给后代的一类动物。第一节第一节 转基因动物转基因动物“特定的外源基因或经过改造的自身基因成分”目的基因“各种技术手段”各种转基因技术认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现某种性状。转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物
4、质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目1.1974年，Jaenisch等人把纯化的SV40病毒DNA注入小鼠囊胚腔后，发现动物的许多组织中都有该基因序列，表明外源基因已整合于胚胎细胞的基因组中。2.1980年，Gorden等进一步完善了显微操作技术，首次应用显微注射的方法，把克隆的人胸苷激酶基因注射到小鼠受精卵的雄性原核内，建立了转基因小鼠。3.1982年，Palmiter将大鼠生长激素基因结构区融合在SMT金属巯蛋白基因（MT）启动
5、子中，注射到小鼠受精卵雄性原核内，获得了体型似大鼠的转基因巨型小鼠。一、转基因动物研究发展概况一、转基因动物研究发展概况认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目3.1985年，Smithies等建立了ES细胞基因打靶技术，首先在球蛋白位点上进行基因打靶，获得基因敲除小鼠。4.1987年，英国Roslin研究所研制成功-抗胰蛋白酶转基因绵羊，乳汁中分泌-抗胰蛋白酶含量高达30mg/L，标志着利用转基因技术生产生物药品在实践上是可行的。5.1995年，Ramirez-Solis等用重组酶Cre/LoxP系统首先制作成功染
6、色体重排小鼠。6.2000年，McCreath等用体细胞基因打靶技术获得转基因绵羊，乳汁中分泌-抗胰蛋白酶含量高达650ugml。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目 我国的转基因动物研究始于20世纪80年代初期，中国科学院率先成功地制作了人-珠蛋白基因、大肠杆菌galk和gpt基因、牛及人生长激素等多种转基因小鼠，在转基因猪、牛、羊和兔等的研究方面，也取得了成功，并在国际上首先将人生长激素基因转移到金鱼受精卵中，为培育高产优质和具有抗性的鱼类新品种开拓了新途径。1994年在上海、1995年在长春、分别召开了两届
7、全国转基因动物学术讨论会，2002年在上海召开了国际转基因动物学术讨论会。目前，遗传工程动物、模式动物疾病动物模型的研究被列为国家“863”计划的重点项目之一。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目 2001年，国家科技部资助南京大学建立了“国家遗传工程小鼠资源库”，专门用于研究开发、收集、保存和供应遗传工程小鼠，形成资源共享的公共服务平台。转基因动物技术的成熟和发展是在20世纪80年代以后，从国际上发表的论文数量来看，有关转基因的论文呈直线上升，表明遗传工程动物研究已经成为生命科学研究的热点之一。认识到了贫困户贫
8、困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目 乳动物有大约30,000个基因，传统基因功能研究方法如基因剔除和化学诱变等，技术要求高、时间长、费用大，转座因子是一类可以进入基因组内不同位置的基因载体，科学家利用它们插入基因，导致基因突变以了解基因功能，也利用它们培育转基因生物。2005年，复旦大学发育生物学研究所的科研人员将一种源于飞蛾甘蓝尺蠖中的DNA转座因子系统piggyBac(PB)用于小鼠和人类细胞的基因功能研究，表明PB转座系统可作为一种新型实用的小鼠和其他脊椎动物的高效遗传操作工具，为大规模研究哺乳动物基因功能提供了新方法。
9、这是我国生命科学研究近年取得的重大成果之一。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目（一）获取外源目的基因 从复杂的生物细胞基因组中，经过酶切（限制性内切酶）消化或PCR扩增等步骤，分离得到带有目的基因的外源性DNA片段。对于分子质量较大而又不知其序列的基因，可从特定细胞里提取所需基因的mRNA后，借助逆(反)转录酶的作用合成碱基互补的DNA片段，即cDNA，再在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA。
10、或者通过探明目的基因所含的遗传密码及其排列顺序，然后用化学方法人工合成所需基因序列。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目 基因转运载体是具有自体复制能力的一种环状DNA分子，它经过人工改造后能与外来基因连接，重新形成新的重组DNA分子，并带有必要的标记基因，用于携带目的基因转移到受体细胞中。能在受体细胞内进行独立和稳定的DNA复制；在其DNA插入外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性；易于从宿主细胞中分离，并进行纯化；在其DNA序列中，具有适当的限制酶位点。（二）构建基因转运载体认识到了贫困户贫困的根本原因
11、，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目 目前，常用的基因载体主要有两大类型：一类是质粒，另一类是病毒（如逆转录病毒）。质粒主要存在于细菌中，可用溶菌酶分解细菌细胞壁，然后用物理化学方法，把质粒与其他成分分开，从而得到纯粹的质粒，用于进行体外重组DNA分子构建的操作。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目（三）构建重组DNA分子（重组外源目的基因）通过专一限制性内切酶处理或人为方法，使带有目的基因的外源DNA片段和能够自我复制并具有选择标记基因的载体DNA分子产生末
12、端，并通过连接酶在体外使两者连接起来，形成一个带有目的基因的重组DNA分子。“剪刀与浆糊”工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 末端转移酶 单链核酸酶 反转录酶等 每一种酶都有自身每一种酶都有自身特定的功能。有的像手特定的功能。有的像手术刀可以对术刀可以对DNADNA分子进分子进行定向进行切割；有的行定向进行切割；有的像砌砖机，可以合成完像砌砖机，可以合成完整的双链整的双链DNADNA分子。分子。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目（四）将重组DNA分子导入受体细胞进行扩增 用显微注射等人工方法，将重组DNA分
13、子转移到适当的受体细胞中，使它能在细胞中“定居”下来，并与之一起增值。(五)筛选与克隆、培育，获得转基因产物 从大量的细胞群体中筛选出获得重组DNA分子的受体细胞克隆；从筛选出的受体细胞克隆中提取出已经得到扩增的目的基因；将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类需要的物质。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目*1.显微注射法：在显微镜下利用玻璃显微注射针将外源DNA直接注入到受体的受精卵雄性原核内。二、将重组DNA分子导入受体细胞的方法认识到了贫困户贫困的根本原因，才
14、能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目2.逆转录病毒载体法：逆转录病毒是一种单链的RNA病毒，能够在逆转录酶的作用下，形成双链的DNA原病毒，目前已成为基因转移载体的最佳选择，它可有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。主要用于基因转移和基因治疗。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目3.精子载体法：将外源DNA与动物精子一起孵育，在体外受精过程中由精子将外源DNA带入受精卵内。4.电穿孔法：细胞暴露于高电压时，细胞膜为高电压瞬时击穿，从而使外源DNA
15、被摄入细胞中。5.脂质体法：将外源DNA装入脂质体（一种人造膜）与培养细胞一起温育，即可将外源DNA导入受体细胞。6 基因枪法：7.DEAE-葡聚糖介导法：8.磷酸钙介导法：认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目 超数排卵、取超数排卵、取受精卵受精卵向受精卵雄性原核注入外源向受精卵雄性原核注入外源性性DNADNA溶液，将细胞胚胎移溶液，将细胞胚胎移植到假孕雌鼠的输卵管中植到假孕雌鼠的输卵管中。正常雄鼠正常雄鼠雌鼠雌鼠A A 结扎输精管的雄鼠结扎输精管的雄鼠 （品系不限（品系不限)雌鼠B假孕雌鼠（假孕雌鼠（ICRIC
16、R或或KMKM）（选择（选择C57BL/6C57BL/6或或BD62F1BD62F1）二、转基因动物制作实例转基因小鼠（显微注射法）认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目 用结扎了输精管的雄性小鼠与发情期的雌性小鼠进行交配，虽然不能受精，但可以刺激子宫颈管，使雌性小鼠体内的黄体活化，造成能继续妊娠的内分泌环境，这种小鼠称为假孕雌鼠。假孕雌鼠一般采用远交系，如ICR或昆明种等，因其母性好，善带仔鼠；体重最好大于25克。体型较大，便于移植。已产过仔并成功抚育过幼鼠的作假孕雌鼠最理想。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开
17、始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目一、转基因动物在生物制药中的应用：作为基因药物的“生物反应器”，生产具有医药价值的生物活性蛋白质药物：将抗凝血酶、人血清白蛋白、B一干扰素、降钙素、胰岛素、人生长激素等的基因通过基因打靶技术，定点转入牛或羊的乳球蛋白质基因中，在乳腺中高效表达，便可自乳汁中回收该蛋白质。目前已从转基因的动物乳汁中生产出的治疗蛋白主要有：奶山羊乳汁中高度表达的抗凝血酶和Or-1一蛋白酶抑制因子，绵羊乳汁中表达的OL-1一抗胰蛋白酶和人凝血因子，牛乳中表达的a-乳蛋白和乳铁蛋白,兔乳中表达的a-葡萄糖苷酶等。第二节 遗传工程技术的应用
18、二、转基因技术在人类疾病研究中的应用：1.建立诊断和治疗人类疾病的转基因动物模型 人类的许多疾病都与遗传因素相关。但人类伦理道德一般不允许直接对人的受精卵进行基因操作，因而只有将处理过的体细胞移植到遗传病患者体内。但这种操作具有一定的危险性，必须首先在动物体内进行试验。所以，通过培育缺陷性状矫正的动物新品系，可以为这类疾病的基因治疗提供宝贵的经验和动物模型。迄今为止，这方面的研究已取得了不少进展。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目2.生产可用于人体器官移植的转基因动物器官 转基因动物不仅可以用来摸索基因疗法的经
19、验，转基因动物不仅可以用来摸索基因疗法的经验，而且还可能为因患病而导致某个器官功能衰退的病而且还可能为因患病而导致某个器官功能衰退的病人提供健康的器官，如心、肝、肾等。人提供健康的器官，如心、肝、肾等。英国剑桥的几位科学家为一只猪胚胎导入了人英国剑桥的几位科学家为一只猪胚胎导入了人的基因，因而培育出了世界上首例具有人的基因的的基因，因而培育出了世界上首例具有人的基因的转基因猪，在世界上引起强烈反响，目前，这种转转基因猪，在世界上引起强烈反响，目前，这种转基因猪已发展到数百头。科学家的目的是希望这种基因猪已发展到数百头。科学家的目的是希望这种转基因猪能为人类提供健康的器官。现在，他们已转基因猪能
20、为人类提供健康的器官。现在，他们已在进行把转基因猪的器官移植到灵长目动物身上的在进行把转基因猪的器官移植到灵长目动物身上的试验，预计移入人体的试验将在本世纪末得以实施。试验，预计移入人体的试验将在本世纪末得以实施。如果这项计划能够成功的话，那么将解决人类备用如果这项计划能够成功的话，那么将解决人类备用器官的缺乏，使千百万名患者脱离死亡。器官的缺乏，使千百万名患者脱离死亡。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目 除了开展异种器官移植研究之外，异种细胞移植的研究也在进行中。已知很多疑难疾病、生理功能紊乱都与细胞凋亡或细
21、胞功能异常有关，但到目前为止，人类细胞还不能很好地传代培养，因此将异种细胞尤其是猪的细胞移植到合适的位点，将使人类实现细胞治疗成为可能。1994年，Groth等将猪的胰岛细胞移植给糖尿病病人，取得了一定的成效。1997年,Deacon等将猪胎儿神经细胞移植到患有帕金森疾病的病人大脑中，研究发现移植后的细胞能长久保持活力。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目 3.转基因技术用于基因治疗 将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，达到治疗目的。目前的基因疗法是先从患者身上取出一些细胞，然后利用
22、对人体无害的逆转录病毒当载体，把正常的基因嫁接到病毒上，再用这些病毒去感染取出的人体细胞，让它们把正常基因插进细胞的染色体中，使人体细胞就可以“获得”正常的基因，以取代原有的异常基因。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目 基因疗法的典型例子是半乳糖血症病人的基因治疗。这种基因疗法的典型例子是半乳糖血症病人的基因治疗。这种病人由于细胞内缺少基因病人由于细胞内缺少基因G G，不能产生半乳糖，不能产生半乳糖11磷酸磷酸尿苷尿苷酰转换酶，以致大量半乳糖酰转换酶，以致大量半乳糖11磷酸和半乳糖堆积在肝组织中，磷酸和半乳糖堆
23、积在肝组织中，这些半乳糖可转变为酒精，因而造成肝脏损害。为了治愈这种这些半乳糖可转变为酒精，因而造成肝脏损害。为了治愈这种病人，人们把大肠杆菌病人，人们把大肠杆菌(一般内含一般内含G G基因基因)能产生半乳糖酶的脱氧能产生半乳糖酶的脱氧核糖核酸片段提取出来，让噬菌体作为运载体带入病人的细胞核糖核酸片段提取出来，让噬菌体作为运载体带入病人的细胞内，病人细胞便开始产生半乳糖酶。这样，原来不能利用半乳内，病人细胞便开始产生半乳糖酶。这样，原来不能利用半乳糠的细胞便恢复了对半乳糖的正常代谢。如果这种已经治愈的糠的细胞便恢复了对半乳糖的正常代谢。如果这种已经治愈的细胞用人工的方法移植到人体器官内，使之成
24、为人体的正常部细胞用人工的方法移植到人体器官内，使之成为人体的正常部分，那么这种病就从根本上治愈了。而且由于病人细胞内脱氧分，那么这种病就从根本上治愈了。而且由于病人细胞内脱氧核糖核酸的缺陷部分得了纠正，这种病也就不会再遗传给下一核糖核酸的缺陷部分得了纠正，这种病也就不会再遗传给下一代了。代了。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目第一个成功的基因治疗第一个成功的基因治疗 1990 1990年年9 9月月1414日美国的一个年仅日美国的一个年仅4 4岁的小女孩岁的小女孩接受了基因治疗而且取得了成功。她患的是遗传接受
25、了基因治疗而且取得了成功。她患的是遗传性的严重复合免疫缺损症，原因是她继承了父母性的严重复合免疫缺损症，原因是她继承了父母亲的各自的一个缺损基因。基因治疗采用的是体亲的各自的一个缺损基因。基因治疗采用的是体外疗法。从患者身上取出免疫系统中的白细胞，外疗法。从患者身上取出免疫系统中的白细胞，把野生型即正常的基因引入白细胞，然后把这些把野生型即正常的基因引入白细胞，然后把这些细胞注入血液中，在细胞注入血液中，在4 4个月内重复个月内重复4 4次。患者本来次。患者本来总是面容憔悴而且易受感染，现在已是一个健康总是面容憔悴而且易受感染，现在已是一个健康活泼的小姑娘了活泼的小姑娘了。认识到了贫困户贫困的
26、根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目三、转基因动物在动物育种中的应用：通过转基因克隆技术大量快速地繁殖出具有高产优质性状的转基因动物以有利于降低生产成本，提高经济效益。转基因技术用于育种，不仅可以加快改良遗传性状的进程，使选择的效率提高，改良的机会更多，而且不会受到有性繁殖的局限。人类在转bGH基因猪方面的研究表明，转基因猪日增重增加，饲料转化率提高。Powell等将毛角蛋白型中问细丝基因导入绵羊基因组转基因羊毛光泽亮丽，羊毛中羊毛脂的含量得到明显的提高。认识到了贫困户贫困的根本原因，才能开始对症下药，然后药到病除。近年来国家对扶贫工作高度重视，已经展开了“精准扶贫”项目 许多科学家在研究疯牛病的病因时，采用转基因老鼠进行PrP（朊蛋白）基因结构分析并利用转基因鼠研制出了抗PrP的单克隆抗体，通过临床试验已取得了有效成果，使人类对疯牛病在分子水平上有了科学评价和诊断依据，对疯牛病的病因有了明确的定位，只要提取其他动物抗PrP基因获得转基因牛，将会更好地防止疯牛病的发生。