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1、安县中学安县中学一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农被农作物作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才之后才能被植物利用。能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)脲酶脲酶+CO+CO2 2NHNH3 3+H+H2 2OO3 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌
2、、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。也能分解尿素。4 4、课题目的、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照（一）筛选菌株（一）筛选菌株水生耐热细菌Taq(Thermus aquaticus)耐高温的Taq DNA聚合酶美国微生物学科布鲁克（T.Brock)1966年发现耐热细菌筛选菌株1.自然界筛选：根据它对生存环境的要求，到相应
3、的环境中去寻找。2.实验室筛选：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 4土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基从物理性质看此培养基属于哪类
4、？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺缺乏乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。培养基选择分解尿素的微生物的原理培养基选择分
5、解尿素的微生物的原理测定微生物数量的方法：测定微生物数量的方法：1 1、直接计数法：最常用的直接计数法：最常用的显微镜直接计数显微镜直接计数。先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数（微镜下进行计数（血球计数板血球计数板）。）。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。体积内的微生物总数。优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。缺点：不能区分死菌和活菌；不适于运动的细菌计数缺点：不能区分死菌和活菌；不适于运动的细菌计数 难以
6、计数微小的细菌。难以计数微小的细菌。应用：一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计应用：一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。数。（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一
7、稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的
8、稀释度很重要，一般以涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在落数在5050个左右为最好。个左右为最好。说说明明设设置置重重复复组组的的重重要要性性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑
9、所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。（三）设置对照（三）设置对照1、对照实验：、对照实验：指除了被测试条件以外，其他条件都相同的实验，作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试条件引起的相应结果。2、对照实验的目的：、对照实验的目的：排除实验组中非测试因素对实验结果 的影响，提高实验结果的可信度。一一是是由由于于土土样样不不同同，二二是是由由于于培培养养基基污污染染或或操操作作失失误误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一一种种方方案案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果
10、结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另另一一种种方方案案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。（小结）操作：设置重复组，（小结）操作：设置重复组，增强实验的说服增强实验的说服力和准确性。将待测样品经过一系列的稀释，力和准确性。将待测样品经过一系列的稀释，然后选择三个然后选择三个稀释度的菌液均匀涂布在平板稀释度的菌液均匀涂布在平板上，然后培养。上，然后培养。（注意）：为了结果接近真实值，可将同一（注意）：为了结果接近真实值，可将同一稀释度菌液涂布到稀释度菌液涂
11、布到3 3个或个或3 3个以上的平板上，个以上的平板上，经培养，计算出菌落的平均数。经培养，计算出菌落的平均数。对照原则：对照原则：判断培养基中是否有杂菌污染，判断培养基中是否有杂菌污染，将未接种的培养基同时进行培养。将未接种的培养基同时进行培养。判断判断选择培养基选择培养基是否具有筛选作用，是否具有筛选作用，对照培对照培养基养基接种后培养观察菌落数目。接种后培养观察菌落数目。计算公式：每克样品中的菌株数计算公式：每克样品中的菌株数=（C/VC/V）*MM（1）原理：尿素是一种重要的农业氮肥，只有当土壤中 的 细菌将尿素分解成氨之后，才能 被植物利用。尿素细菌能合成脲酶，在脲酶的作用下尿素被分
12、解成氨。CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3二、实验设计（2）实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。（3）实验流程：土壤取样土壤取样 样品系列稀释样品系列稀释 涂布平板与培养涂布平板与培养 观察并记录结果观察并记录结果 菌落计数菌落计数二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。.制
13、备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的平板数的平
14、板三三样品的稀释样品的稀释为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解解尿尿素素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中中各各类类微微生生物物的的数数量量（单单位位：株株/kg/kg）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线线菌数约为菌数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。结结论论：为为
15、获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地提提供选择培养的条件。供选择培养的条件。.取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在30303030300300300300的平板，的平板，的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计
16、数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果果果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验不精确验不精确验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌
17、落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察 一一一一 无菌操作无菌操作无菌操作无菌操作1 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2 2、应应在在火火焰焰旁旁称称取取土土壤壤。在在火火焰焰
18、附附近近将将称称好好的的土土样样倒倒入入锥锥形瓶中，塞好棉塞。形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二二二二 做好标记做好标记做好标记做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。三三三三 规划时间规划时间规划时间规划时间1 1、结结合合对对照照，分分析析培培养养物物中中是是否否有有杂杂菌菌污污染染以以及及选选择培养基是否筛选出一些菌落。择培养基是否筛选出一些菌落。2 2、是是否否获获得得了了某某一一稀稀释释度度下下，菌菌落落数数目目在在30303
19、00300的的平平板板。在在这这稀稀释释度度下下，是是否否至至少少有有两两个个平平板板的的菌菌落落数相近？数相近？3 3、你你统统计计的的每每克克土土壤壤中中含含有有能能分分解解尿尿素素的的细细菌菌的的菌菌落落数数是是多多少少？与与其其他他同同学学的的结结果果接接近近吗吗？如如果果差差异异很很大，可能是什么原因引起的？大，可能是什么原因引起的？五五.课外延伸课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素分解尿素。测定饮水
20、中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝 培养培养培养培养基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出，通过记述得出，通过记述得出，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数
21、量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在大肠杆菌在伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 （一）空气中微生物总数的检测（二）水中细菌总数的检测（三）牛奶中细菌的分离与计数（四）土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B.B.至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）
22、A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练A A C CD D4.4.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中
23、分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加
24、为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）入（）A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C例例3 3（20052005年江苏）抗生素作为治疗细菌感年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。义。青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是是 ，青霉素是青霉菌的，青霉素
25、是青霉菌的 代谢产物。代谢产物。在生产和科研中，常选用处于在生产和科研中，常选用处于 期的青霉菌作期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，和和 比较稳定。比较稳定。对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，酵液，经离心分离、反复洗涤后，再计算，再计算发酵罐中菌体的总重量。发酵罐中菌体的总重量。异养需氧型异养需氧型次级次级对数对数个体的形态个体的形态生理特性生理特性称菌体的湿重称菌体的湿重（称烘干后的重量）（称烘干后的重量）下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是()A.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水、葡萄糖、尿素、琼脂、水 B.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水、葡萄糖、琼脂、水 C.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水、尿素、琼脂、水 D.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水水练一练：练一练：A