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1、上次实验小结上次实验小结1、观察自己组的实验结、观察自己组的实验结果：转化平板果：转化平板*培养板在培养板在37C 培养培养12-16h卫星菌：培养时间过长卫星菌：培养时间过长2、实验中的难点、实验中的难点*制备效率高的感受态细胞制备效率高的感受态细胞o目的目的 DNA片段片段 质粒质粒 TA载体载体连接连接 重组质粒重组质粒目的目的 DNA转化转化无质粒的无质粒的E.Coli 死亡死亡有质粒的有质粒的E.Coli 存活存活含抗生素培养基中生长含抗生素培养基中生长重组质粒重组质粒的鉴定的鉴定PCR开始上课时介绍开始上课时介绍2-3min平板筛选平板筛选小量制备质粒和电泳分析小量制备质粒和电泳分
2、析 实验四实验四开始实验操作前：本次实验介绍开始实验操作前：本次实验介绍10-15min质粒质粒质粒载体质粒载体是存在于细菌染色体外的小型闭是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链合环状双链DNA分子，在宿主细分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状细胞一定的遗传性状筛选标记筛选标记MCS（多克隆位点）（多克隆位点）复制原点复制原点质粒质粒1)培养细菌使质粒扩增；培养细菌使质粒扩增；2)收集裂解细菌；收集裂解细菌；3)分离纯化质粒分离纯化质粒DNA。质粒提取原理质粒提取原理：质粒提取有多种方法，但质粒提取有多种方法，但都包含有都包含有3个基本步骤：
3、个基本步骤：去除蛋白质去除蛋白质去除基因组去除基因组DNA去除去除RNA*酚酚-氯仿抽提法氯仿抽提法*RNase消化消化？质粒质粒DNA与基因组与基因组DNA的区别的区别大肠杆菌遗传物质大肠杆菌遗传物质1、部位不同：、部位不同：2、大小不同：、大小不同：质粒分子量较小，大小只质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体有普通细菌染色体DNA的百分的百分之一。之一。基因组基因组DNA分子量较大，分子量较大，细菌基因组约含细菌基因组约含3000个基因，个基因，5 106 bp。基因组基因组DNA容易断裂线性化容易断裂线性化碱裂解法提取质粒的原理碱裂解法提取质粒的原理原理：原理：1、强、强碱碱和和SDS裂
4、解裂解细菌，细菌中的质粒或基因组细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱在碱性条件下发生变性。性条件下发生变性。2、怎样去除基因组、怎样去除基因组DNA？当加入当加入酸酸性物质进行性物质进行中和中和时，时，质粒质粒DNA很快复性，很快复性，染色体染色体DNA则则和变性蛋白质等缠绕在一起和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形难以复性而形成沉淀成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；，经离心随细胞碎片一起去除；3、怎样去除蛋白质？、怎样去除蛋白质？（已经学过）（已经学过）留有质粒留有质粒DNA的上清，经的上清，经酚和氯仿去除蛋白质酚和氯仿去除蛋白质后后,用乙醇用乙醇沉淀沉淀质粒质粒DNA，即得到质粒，即得到质
5、粒DNA.1)细胞悬浮液（溶液细胞悬浮液（溶液I）-悬浮菌体悬浮菌体50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.010 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.02)细菌裂解液（溶液细菌裂解液（溶液II）-裂解菌体裂解菌体0.2mol/L NaOH1%SDS碱裂解法提取质粒试剂碱裂解法提取质粒试剂：3）中和液（溶液）中和液（溶液III）-中和中和NaOH60 ml 5mol/L 醋酸钾醋酸钾11.5ml 冰醋酸冰醋酸28.5ml 水水4）20mg/ml RNase-降解细菌降解细菌RNA工作浓度工作浓度3050 g/ml其他试剂作用和成分同实验一。其他试剂
6、作用和成分同实验一。质粒质粒DNA的的制备制备录像录像5分钟：（分钟：（8：208：25）（1）（细菌的收获：）细菌的收获：）取取1.5 ml 工程菌液工程菌液6,000转转/分，离心分，离心2min，弃上清。弃上清。（2）（细菌的裂解：）细菌的裂解：）加入加入200 l预冷的细胞悬浮液（溶液预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮悬浮细菌细菌 加入加入200 l细菌裂解液（溶液细菌裂解液（溶液II），），颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。注：注：粘稠粘稠：开盖后出现拉丝现象，证明：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。已经游出。（3）（中和：）（中和：）
7、加入加入150 l中和液，上下颠倒混合后置中和液，上下颠倒混合后置 冰上冰上 5min，12,000转转/分，分，4离心离心 5min。碱裂解法提取质粒操作步骤碱裂解法提取质粒操作步骤开始操作：开始操作：（去除蛋白质）（去除蛋白质）（4）将上清移至另一离心管中将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色注意不要混入白色沉淀物沉淀物)，加入等体积的，加入等体积的TE饱和的酚饱和的酚/氯仿氯仿/异戊醇异戊醇(25：24:1)混和液，振荡混匀混和液，振荡混匀1min，12,000转转/分离心分离心 5min。（5）将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的）将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿氯仿
8、/异戊醇异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀溶液，振荡混匀1min，12,000转转/分分 离心离心 5min。（沉淀（沉淀DNA）（6）将上层水相移至另一离心管中，加入）将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积倍体积的无水乙醇，的无水乙醇，置置-20沉淀沉淀1015 min。继续提取质粒：继续提取质粒：获取及溶解沉淀的质粒获取及溶解沉淀的质粒DNA2质粒质粒DNA电泳分析：电泳分析：（7 7）12,000 转转/分离心分离心8min。弃上清，室温干燥质粒弃上清，室温干燥质粒DNA 5-10minDNA 5-10min。（去除（去除RNA）（8 8）用）用20 l含含RNase的的水溶解质粒水
9、溶解质粒DNA，轻轻吹打混合轻轻吹打混合。37 保温保温10min20 l质粒质粒DNA溶液溶液取出取出10 l放于另一个离心管中备用放于另一个离心管中备用剩余剩余10 l用于下一步酶切用于下一步酶切继续实验操作继续实验操作 取取10 l 的质粒的质粒DNA 加加2 l 上样液混匀。上样液混匀。加到加到0.8%琼脂糖凝胶的加样孔内。琼脂糖凝胶的加样孔内。电泳条件：电泳条件：100V 40min。电泳结束后照像保存，结果分析。电泳结束后照像保存，结果分析。质粒质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳质粒提取方法质粒提取方法质粒的量质粒的量质粒的纯度要求质粒的纯度要求决定使用不同的方法决定使用不
10、同的方法质粒的大小质粒的大小质粒过大：温和裂解质粒过大：温和裂解质粒大小适中：碱裂解，煮沸法质粒大小适中：碱裂解，煮沸法如：如：如：大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法质粒纯度：要求高纯度、无内毒素等等质粒纯度：要求高纯度、无内毒素等等 （满足各种转基因实验的要求）（满足各种转基因实验的要求）要求不同的纯化方法要求不同的纯化方法电泳时讲授电泳时讲授10-20min方法举例：方法举例：经典的方法：经典的方法：CsCl-溴化乙锭梯度密度离心溴化乙锭梯度密度离心特点：纯度最高（
11、可获得特点：纯度最高（可获得高质量的超螺旋质高质量的超螺旋质粒粒DNA）、最贵、）、最贵、最麻烦最麻烦应用：应用：大量大量制备质粒；基制备质粒；基因注射，基因转染因注射，基因转染等对质粒质量要求等对质粒质量要求高的实验高的实验缺口环状或缺口环状或线状线状DNA闭环质粒闭环质粒DNA原理：不同结构和大小的原理：不同结构和大小的DNA参入的溴化乙锭的量不一参入的溴化乙锭的量不一样从而在样从而在CsCl梯度密度离心中处于不同的位置梯度密度离心中处于不同的位置特点：小量质粒制备、最简便、快捷特点：小量质粒制备、最简便、快捷应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）测序、转染（细提
12、）测序、转染（细提）质粒提取试剂盒质粒提取试剂盒常用方法：小量碱裂解法常用方法：小量碱裂解法满足不同需要的试剂盒满足不同需要的试剂盒纯化原理：离子交换柱层析等纯化原理：离子交换柱层析等小量制备质粒小量制备质粒kit大量制备质粒大量制备质粒kit去除内毒素制备质粒去除内毒素制备质粒kit可用于大部分分生实验可用于大部分分生实验质粒的电泳质粒的电泳质粒质粒DNA的的3种形式泳动速度种形式泳动速度:超螺旋超螺旋线性线性开环开环 质粒质粒DNA的存在形式有的存在形式有3种种:1、共价闭环共价闭环DNA:常以超螺旋常以超螺旋形式存在形式存在 2、开环开环DNA:质粒质粒DNA两条链两条链中有一条发生一处
13、或多处断裂，中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张因此可以自由旋转从而消除张力力,形成松弛的环状分子形成松弛的环状分子 3、线性线性DNA:因质粒因质粒DNA的两的两条链在同一处断裂而造成条链在同一处断裂而造成.开环开环超螺旋超螺旋线性线性重组质粒的鉴定重组质粒的鉴定平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞空质粒或重组质粒的细胞提取的质粒提取的质粒质粒电泳筛选重组质粒质粒电泳筛选重组质粒重组质粒的进一步酶切鉴定重组质粒的进一步酶切鉴定质粒电泳质粒电泳空质粒空质粒重组质粒重组质粒重组质粒分子量变大而重组质粒分子量变大而在电泳中滞后在电泳中滞后质粒酶切电泳质粒酶切电泳a:酶切前酶切前b:酶切后酶切后插入片段插入片段注：注：观察质粒的电泳带型观察质粒的电泳带型 分析质粒切不开的原因。分析质粒切不开的原因。