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1、枯草杆菌蛋白酶活力的测定枯草杆菌蛋白酶活力的测定生物化学实验之十生物化学实验之十生物化学实验之十生物化学实验之十安徽师范大学生科院生化教研室一一.实验目的实验目的 蛋白酶浸提、分离、提取技术蛋白酶浸提、分离、提取技术 最适条件下酶促水解反应的操作程序最适条件下酶促水解反应的操作程序 酶活力的测定及活力单位的计算酶活力的测定及活力单位的计算二二.实验原理实验原理比色测定比色测定酪蛋白酪蛋白蛋白酶蛋白酶酪氨酸酪氨酸钼蓝钼蓝钨蓝钨蓝酪氨酸酪氨酸FolinFolin-酚试剂酚试剂pHpHpHpH值、温度值、温度值、温度值、温度OHOHOHOH-三三.实验试剂和器材实验试剂和器材试剂1.酚试剂；2.0.
2、55M碳酸钠；3.10%三氯乙酸；4.0.5%酪蛋白；5.0.02MPH7.5磷酸缓冲液；6.50g/ml酪氨酸；7.酶液。器材：7200型分光光度计；试管；水浴锅；坐标纸等。测定酶活的程序测定酶活的程序1 1 1 1、将酶液稀释到一定程度、将酶液稀释到一定程度、将酶液稀释到一定程度、将酶液稀释到一定程度2 2 2 2、最适条件、最适条件、最适条件、最适条件下下下下进行酶促水解反应进行酶促水解反应进行酶促水解反应进行酶促水解反应3 3 3 3、测定反应量、测定反应量、测定反应量、测定反应量4 4 4 4、根据酶活单位定义计算酶活力、根据酶活单位定义计算酶活力、根据酶活单位定义计算酶活力、根据酶
3、活单位定义计算酶活力【重点掌握重点掌握】1 1 1 1、将酶液稀释到一定程度、将酶液稀释到一定程度、将酶液稀释到一定程度、将酶液稀释到一定程度 在在在在底物浓度一定，反应时间一定内维持初速度，底物浓度一定，反应时间一定内维持初速度，底物浓度一定，反应时间一定内维持初速度，底物浓度一定，反应时间一定内维持初速度，必须调整酶的最适稀释倍数即必须调整酶的最适稀释倍数即必须调整酶的最适稀释倍数即必须调整酶的最适稀释倍数即吸光度限制在吸光度限制在吸光度限制在吸光度限制在0.250.250.250.250.400.400.400.40范围内。范围内。范围内。范围内。2 2 2 2、最适条件、最适条件、最适
4、条件、最适条件下下下下进行酶促水解反应进行酶促水解反应进行酶促水解反应进行酶促水解反应最适温度最适温度最适温度最适温度 37 37 37 37 恒温水浴恒温水浴恒温水浴恒温水浴 最适最适最适最适pHpHpHpH值值值值 pH7.5 pH7.5 pH7.5 pH7.5 缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液底物浓度足够大底物浓度足够大底物浓度足够大底物浓度足够大 1%1%1%1%酪蛋白溶液酪蛋白溶液酪蛋白溶液酪蛋白溶液1mL1mL1mL1mL反应时间准确反应时间准确反应时间准确反应时间准确 10min 10min 10min 10min及时灭活及时灭活及时灭活及时灭活 三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸
5、 2mL2mL2mL2mL【重点掌握重点掌握】3 3 3 3、测定反应量、测定反应量、测定反应量、测定反应量 测定产物的增加量或底物的减少量测定产物的增加量或底物的减少量测定产物的增加量或底物的减少量测定产物的增加量或底物的减少量 测定酪氨酸的生成量测定酪氨酸的生成量测定酪氨酸的生成量测定酪氨酸的生成量 4 4 4 4、根据酶活单位定义计算酶活力、根据酶活单位定义计算酶活力、根据酶活单位定义计算酶活力、根据酶活单位定义计算酶活力 酶活单位定义：在上述条件下，酶活单位定义：在上述条件下，酶活单位定义：在上述条件下，酶活单位定义：在上述条件下，1min1min1min1min水解酪蛋白产生水解酪蛋
6、白产生水解酪蛋白产生水解酪蛋白产生 1g1g1g1g酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。【重点掌握重点掌握】用一系列浓度不同的酪氨酸标准液与用一系列浓度不同的酪氨酸标准液与用一系列浓度不同的酪氨酸标准液与用一系列浓度不同的酪氨酸标准液与FolinFolinFolinFolin-酚试剂作酚试剂作酚试剂作酚试剂作用，产生兰色深浅不同的溶液用，产生兰色深浅不同的溶液用，产生兰色深浅不同的溶液用，产生兰色深浅不同的溶液，680nm680nm波长处，作出波长处，作出酪氨酪氨酸浓度酸浓度-吸光度标准曲线。吸光度标准曲线。用
7、用酶促水解液进行同样操作酶促水解液进行同样操作酶促水解液进行同样操作酶促水解液进行同样操作，比色后，查阅标准曲线，比色后，查阅标准曲线，即可求得待测酶活力。即可求得待测酶活力。四四.操作步骤操作步骤（一）（一）（一）（一）标准曲线的绘制标准曲线的绘制标准曲线的绘制标准曲线的绘制 1 1、取、取6 6支干燥试管，编号，按教材表格顺序加入试剂；支干燥试管，编号，按教材表格顺序加入试剂；2 2、混匀器充分、混匀器充分混匀后，混匀后，置置3737恒温水浴反应恒温水浴反应20min20min；3 3、以、以0 0#管做参比，分别比色测定各管管做参比，分别比色测定各管A A680 680；4 4、绘制标准
8、曲线，根据作图或用回归方程，计算出当、绘制标准曲线，根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为吸光度为1 1时的酪氨酸的量（时的酪氨酸的量（gg）即为）即为K K值。值。项目项目 管号管号0 01 12 23 34 45 5标准酪氨酸溶液标准酪氨酸溶液（mlml）0 00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.0蒸馏水蒸馏水（mlml）1.01.00.80.80.60.60.40.40.20.20 0NaNa2 2COCO3 3溶液溶液（mlml）5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0酚试剂酚试剂（mlml）0.50.50.50.50.50.50.
9、50.50.50.50.50.5处理处理摇匀置于摇匀置于3030水浴保温水浴保温1515分钟，冷却后比色。分钟，冷却后比色。吸光度（吸光度（680680）表格表格 (二二二二)待测酶液的制备待测酶液的制备待测酶液的制备待测酶液的制备 称取酶粉称取酶粉0.500g0.500g，用少量，用少量pH7.5pH7.5pH7.5pH7.5缓冲液溶解缓冲液溶解用缓冲用缓冲液定容至液定容至50mL50mL容量瓶中（容量瓶中（N=100N=100N=100N=100倍倍倍倍）。摇匀，用四层纱布）。摇匀，用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度
10、，供测试用（至吸光度在供测试用（至吸光度在0.250.250.400.40范围内，范围内，N=1000N=1000N=1000N=1000倍倍倍倍）。）。取取3 3支试管，分别加入支试管，分别加入1mL1mL酶液，置酶液，置3737预热预热5min5min空白管空白管 平行管平行管2mL 2mL 三氯乙酸三氯乙酸 3737，10min10min2mL 2mL 三氯乙酸三氯乙酸 3737，10min10min1mL 1%1mL 1%酪蛋白酪蛋白 3737，10min10min1mL 1%1mL 1%酪蛋白酪蛋白 3737，10min10min过过 滤滤（1）（2）（3）(三三三三)蛋白酶活力的测
11、定蛋白酶活力的测定蛋白酶活力的测定蛋白酶活力的测定另取另取3 3支试管，分别支试管，分别取取管滤液管滤液1mL1mL（4）各加入各加入5mL Na5mL Na2 2COCO3 3溶液、溶液、1mL 1mL FolinFolin酚试剂酚试剂（5）3737反应反应20min20min（6）（7）比色测定比色测定A A680680，管做参比管做参比(四四四四)酶活力的计算酶活力的计算酶活力的计算酶活力的计算酶活单位定义：在上述条件下，酶活单位定义：在上述条件下，1min1min水解酪蛋白产生水解酪蛋白产生1g1g酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。蛋白酶活力（蛋白酶活力（u/
12、gu/g或或u/mLu/mL）=AK=AK4 4 NN1010 式中式中 AA样品平行试验的平均吸光度；样品平行试验的平均吸光度；K K 吸光常数；吸光常数；4 4 反应试剂的总体积（反应试剂的总体积（mLmL）；）；1010 反应时间反应时间10min10min，以，以1min1min计；计；N N 稀释倍数稀释倍数 所得结果表示至整数。所得结果表示至整数。五五.结果与讨论结果与讨论 常规酶活测定程序为：常规酶活测定程序为：酶液适当稀释，最适条件下进行酶促反应，酶液适当稀释，最适条件下进行酶促反应，测定反应量，根据酶活单位定义计算酶活力。上测定反应量，根据酶活单位定义计算酶活力。上述过程中，那个阶段的操作误差给实验结果造成述过程中，那个阶段的操作误差给实验结果造成的影响最大？如何防止？的影响最大？如何防止？【思考题思考题】