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1、专题二 微生物的培养与应用 知识点2.1 微生物的实验室培养1培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。2. 培养基按物理性质分为液体培养基（应用于工业或生活生产）、固体培养基（应用于微生物的分离和鉴定）和半固体培养基（常用于观测微生物的运动及菌种保藏等）。按成分分为合成培养基（用成分已知的化学物质配制而成，成分种类比例明确，用于微生物的分离鉴定）和天然培养基（用化学成分不明的天然物质配制而成，用于实际工业生产）。按用途分为选择培养基（加入某种化学物质，以克制不需要微生物生长，促进所需微生物的生长）和鉴别培养基（根据微生物的特点，加入
2、某种指示剂或化学药品，来鉴别不同类别的微生物）。3.培养基的化学成分涉及：水、无机盐、碳源、氮源和生长因子等。碳源涉及CO2、NaHCO3等无机碳源和糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能运用有机碳源。单质碳不能作为碳源。氮源涉及N2、NH3、NO3-、NH4+等无机氮源和蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨等有机氮源。只有固氮微生物才干运用N2。4.培养基还需满足pH、特殊营养物质和氧气的规定。例：培养乳酸杆菌需添加维生素；培养霉菌需将pH调至酸性；培养细菌需将pH调至中性或微碱性；培养厌氧型微生物需提供无氧的条件。5.无菌操作技术涉及：对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和
3、消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用品和培养基等器具进行灭菌。为避免周边环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌解决的材料用品与周边的物品相接触。6.消毒与灭菌的区别是：消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不涉及芽孢和孢子），涉及煮沸消毒法，巴氏消毒法 （酒精、氯气、石炭酸）和紫外线消毒法。灭菌指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，涉及芽孢和孢子，涉及灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。7.灭菌方法：接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属用品等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱；培养基、无菌
4、水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅；表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。8.制作牛肉膏蛋白胨固体培养基（1）方法环节：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。（2）倒平板操作的环节涉及：将灭过菌的培养皿放在酒精灯火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。将锥形瓶的瓶口迅速通过火焰（灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基）。将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，再将锥形瓶中的培养基（约1020mL）倒入培养皿，立即盖上培养皿的皿盖。等待平板冷却凝固然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上（目的：使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培
5、养基，导致污染）。9.倒平板时若不慎将培养基溅在皿盖与皿底上，则这个平板不能用来培养微生物，因素是空气中的微生物会在皿盖与皿底上生长。10.纯化大肠杆菌的原理是：用平板划线法和稀释涂布平板法接种，使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落（生态学上称种群），以达纯化菌种的目的。11.平板划线操作时第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环的因素是：前者避免接种环上也许存在的微生物污染培养物，后者杀死上次划线残留在环上的菌种，使菌种逐渐变少以便得到单个菌落。在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环的因素是及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。在灼烧接种环之后，
6、要等其冷却后再进行划线的因素是避免接种环温度太高而杀死菌种。12.涂布平板操作的环节涉及：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取少量菌液，滴加到培养基表面。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810s。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。13.菌种的保存：频繁使用，临时保存接种到固体斜面培养基，在4下保存。长期保存菌种用甘油管藏的方法。2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1.尿素是重要的农业氮肥，不能直接被植物吸取。土壤中有一类细菌能合成脲酶，将尿素分解成氨，被植物吸取运用。尿素最初是从人的尿液中发现的。2.实验室中微生物筛选的原理是：人为提供有助于目的菌株生长的条件（涉及营
7、养、温度、PH等），同时克制或阻止其他微生物生长。3.在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时克制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。4.测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。5.稀释涂布平板法常用来记录样品中活菌的数目。原理是：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。记录平板上的菌落数，就能推测出样品中大约具有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择3-5个菌落数在30300
8、的平板进行计数，并取平均值。6.记录的菌落数往往比活菌的实际数目低，因素是当两个或多个细胞连在一起时，平板上看到的只是一个菌落，因此，记录结果一般用菌落数而不是活菌数来表达。7.设立对照的重要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他也许因素的干扰，证明的确是所测试的条件引起相应的结果。8.实验设计涉及实验方案，所需仪器、材料、用品和药品，具体的实行环节以及时间安排等的综合考虑和安排。9.土壤取样：铲去表层土，在距地表约38cm的土壤层从富具有机物、潮湿、pH7的土壤中取样。10.
9、样品的稀释限度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围（细菌一般选用104、105、106；放线菌一般选用103、104、105；真菌一般选用102、103 、104）的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板。11.不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌30-37 1-2天；放线菌25-285-7天；霉菌25-283-4天。12.每隔24小时记录一次菌落数目，选取菌落数目稳定期的记录作为结果，这样可以防止因培养时间局限性而导致漏掉菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间），同种微生物表现出稳定的
10、菌落特性（形状、大小、隆起限度和颜色基本一致）13. 每克样品中的菌落数=（C/V） M （C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积（ml）；M：代表稀释倍数）14.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，假如PH升高，指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能分解尿素为氨。2.3 分解纤维素的微生物的分离1.纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。2.纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少涉及三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤
11、维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。3.当在具有纤维素的培养基中加入刚果红时，它能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，根据是否产生透明圈就可以来筛选纤维素分解菌，这种方法叫做刚果红染色法。4.刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理：刚果红（染料）可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反映。5.实验流程：土壤取样选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来拟定）梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基
12、上挑选产生透明圈的菌落6.为拟定得到的是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。7.由于生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。8.将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，事实上是人工设立纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。9.刚果红染色法种类：一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反映；另一种是在倒平板时就加入刚果红。前者的缺陷是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反映基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺陷是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都具有淀粉类物质，可以使可以产生淀粉酶的微生物出现假阳性反映。但由于培养基中纤维素占重要地位，纤维素酶产生的透明圈更明显。方法二的另一缺陷是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。10.在选择培养的条件下，可以使那些可以适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被克制，因此可以起到“浓缩”的作用。