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1、ICS 65.020 B 16 DB65 新疆维吾尔自治区地方标准DB 65/T 3915-2016 草莓脱毒种苗病毒检测技术规程Technical specification for virus-free plantlets virus detecting of Strawberry 2016一08-04发布2016一09一04实施新疆维吾尔自治区质量技术监督局发布D865/T 3915一一2016目IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2009 标准化工作导则第l部分:标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所提出。本标准由新疆维吾尔自治区农业厅归口。本
2、标准起草单位:新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所、新疆维吾尔自治区标准化研究院。本标准主要起草人:史芳芳、汪泉、李向泉、郭艳、陈晓坤、胡晓憨、哈里旦、向征。I 草莓脱毒种苗病毒检测技术规程1 范围本标准规定了草莓脱毒种苗病毒检测对象、抽样方法、检测方法和质量要求。本标准适用于脱毒草莓母本株、组培苗及脱毒草莓种茵的病毒检测。2 规范性引用文件0865/T 3915-2016 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。WS 233-2002 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则N
3、Y/T 406-2000 脱毒草莓种苗病毒检测技术规程DB33/T 594.1一2005草莓脱毒种苗第1部分:脱毒种苗3 术语和定义下列定义和术语适用于本文件。3.1 脱毒茵in-vitrovirus free plantlet 经组织培养脱毒处理或直接引进，经检测后确认不携带本规程规定检测病毒的种苗。3.2 脱毒组培瓶苗virus一freep I ant I et i n v i tr。通过植物组织培养方法获得的不携带本规程规定检测病毒的组织培养瓶苗。3.3 脱毒草莓母本株virus-freestrawberry parent strain 由脱毒组培苗直接繁育并且不带本规程的检测对象、用于
4、提供草莓匍匍茎繁殖苗的母株。3.4 脱毒草莓种茵virus-freestrawberry seedl ing 由脱毒草莓母本株繁育并符合本规程规定合格标准的种苗。3.5 病毒病株允许率theal lowing rate of virus infection OB65/T 3915一一2016脱毒草莓母本株及种苗繁殖田中病毒病株的允许比率。4 检测对象4.1 草莓斑驳病毒(SMoV)未归属病毒，是球状病毒颗粒，直径为25nrn-30 nr日，在叶片的表皮和韧皮部的细胞质内有晶状球形颗粒。4.2 草莓轻型黄边病毒(SMYEV)马铃薯X病毒属CPotexvirus)，为线状病毒颗粒，14 nrnX5
5、00 nrn，分布在细胞质内。4.3 草莓皱缩病毒(SCV)弹状病毒科CRhabdovirida的细胞质弹状病毒属CCytorhabdovirus)，为弹状病毒颗粒。在植物组织中，成熟病毒颗粒直径为63nrn,-.,75 nrn，粒体长度为190nrn,-.,380 nrn，在模株表皮、导管和筛管附近的薄壁组织细胞内均有分布。4.4 草莓镶脉病毒(SVBV)花椰菜花叶病毒科CCaulimoviridae)的花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)，为球形病毒颗粒，直径40nrn-50 nrno主要在细胞质内复制，存在于叶片表皮与木质部相连的导管和细胞质内。5 抽样方法5.1 脱毒苗抽样5.
6、1.1 脱毒核心材料:每株应检测。5.1.2 扩繁组培茵:随机抽取1%，-.，2%的扩繁基础苗检测。5.2 出圃种苗抽样出圃种苗抽样应符合NY/T406-2000中5.3规定。6 检测方法6.1 使用试剂符合WS233-2002的规定。6.2 方法反转录一聚合酶链式反应CRT-PCR)检测法(见附录A)，检验结果记录见附录B。7 质量要求7.1 脱毒组培瓶苗质量要求符合DB33/T594.1-2005的规定。凡反转录一聚合酶链式反应(RT一PCR)检测呈阳性反应者为带毒种苗。2 OB65/T 3915一-20167.2 各类种苗病株病毒允许率a)脱毒草莓母本株:病毒病株允许率是0;b)脱毒草莓
7、种商:病毒病株允许率5.0%。3 D865/T 3915一一2016附录A(规范性附录反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测程序A.1 溶j夜自己制所用化学试剂为分析纯级规格。所用试剂用0.1%(lmLDEPC+999mL蒸馆水的DEPC处理水配制，并进行高温高压灭菌。A.2 试剂配制A.2.1 2XCTAB提取液(PH8.0):2%CT邸，1.4M NaCl,0.02M EDTA-2Na,O.lM Tris-HC1,0.2%统基乙醇。即称取CTAB2g加DEPC水40mL，加1MTris-HCl(pH8.0)10此，0.5M EDTA-2Na(pH8.0)4 mL和5MNaCl 28此，
8、待CTAB溶解后用DEPC水定容到100mL(提取前加入2%的琉基乙醇，100 mL加0.2mL 颈基乙醇)。A.2.2 1M Tris-HCl(pH 8.0)100 mL:12.11g Tris;DEPC水，80mL;HC1,4.9 mL三者混匀充分溶解后，滴力口浓盐酸1ft号pH至8.0，定容至100mL。A.2.3 0.5M EDTA-2Na(pH 8.0)100mL:在80mlDEPC水中加入18.01gEDTA一2Na搅拌溶解，用NaOH调pH至8.0(约2gNaOH颗粒)，定容至100mL。A.2.4 5M NaCI100 mL:称取29.22gNaCl，用DEPC水定容到100m
9、L。A.2.5 3M NaAc10 mL:称取2.46gNaAc，用DEPC水定容到10mL(pH5.2)。A.3 模板核酸(包括RNA和DNA)的制备A.3.1 称取19幼嫩的叶片，在研钵中加入液氮预冷，将叶片放到液氮中研磨均匀，直至全部研磨至粉末，取约50mg转入1.5 mL离心管中，加入500f.tL65DC预热的CTAB溶液用前加入2%的统基乙醇)，将装有CTAB和样品的EP管放入65DC水浴，约20minoA.3.2 冷却后，加入500L的盼:氯仿:异戊醇(25:24:1)，混匀，12000rpm，离心15min，吸上清，装入一新的EP管。A.3.3 加入500L氯仿:异戊醇(24:
10、1),12000rpm。离心15min吸上清，转入一新的离心管中。A.3.4加入1/10体积的NaAc(3 mol/l),1mL一200C预冷的无水乙醇，反复颠倒数次，混匀后置于一20OC(-800C,30min)3h-4h,12000rpm,10min弃上清。A.3.5 向离心管中加入75%的乙醇洗涤2次.3次，置于吸水纸上倒置晾干。A.3.6 加入DEPC水(50L)溶解。A.4 RT-PCR(一步法A.4.1 多重PCR扩增A.4.1.1 反应体系反应体系见表1。4 0865/丁391.5:-:-一2016表A.1反应体系表反应试剂反应体积10叩CR缓冲液2.5L M-MuLVRT 10
11、.25L RN ase inhibitor 0.25L 引物D1/D3(SMoV)0.85L C1/C2(SVBV)1.25L U11U2(SCV)0.5L Y1/Y2(SMYEV)0.75L TaqDNA聚合酶0.25L 总RNA5 L 总体积补足双蒸水至25L-蝴翩翩A.4.1.2 反应程序450C 30 min;预变性940C5 min;940C 30s,550C 30s,680C 1.5 min,35个循环;720C延伸10min;40C保存。A.5 扩增产物检测A.5.1 琼脂糖;疑胶电泳将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入水平电泳槽，取5L扩增产物加0.5L的澳盼蓝上样缓冲液混匀后，
12、小心点入样品孔内。电泳缓冲液1XTAE适量，100V，电泳30min。A.5.2 结果观察和记录电泳取出后，取出琼脂糖凝胶，放入凝胶成像系统中，观察并记录DNA带有无和片段大小。A.5.3 引物序列及分子大小A.5.3.1 SVBV(草莓镶脉病毒)278bp 引物C1/C2:GAATGGGACAATGAAATGAG(Sense primer)AACCTGTTTCTAGCTTCTTG(Antisense primer)A.5.3.2 SMYEV(草莓轻型黄边病毒)861bp引物Y1/Y2:CCGCTGCAGTTGTAGGGTA(Sense primer)CATGGCACTCATTGGAGCTGG
13、G(Antisens primer)A.5.3.3 SMoV(草莓班驳病毒)219bp 引物D1/D3:TAAGCGACCACGACTGTGACAAAG(Sense primer)TCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG(Antisense primer)5 A.5.3.4 SCV(草莓皱缩病毒)345bp 引物Ul/U2:CATTGGTGGCAGACCCATCA(Sense primer)TTCAGGACCTATTTGATGACA(Antisense primer)0865/T 391 S一20166 0865/T 3915一-2016附录B规范性附录)草莓脱毒苗病毒检验报告送样单位:品种名称:原种采集地:送样时间:原种数量:编号:编号草莓斑驳病毒(SMoV)草莓轻型黄边病毒草莓镶脉病毒(SVBV)草莓皱缩病毒(SCV)(SMYEV)j主z病毒检测结果+表示阳性携带病毒一表示阴性不携带病毒。病毒检测单位:质检员(签字)检测日期:7