《7生物过程控制1.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《7生物过程控制1.ppt（56页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、发酵过程控制是发酵的重要部分发酵过程控制是发酵的重要部分控制难点：过程的不确定性和参数的非线性控制难点：过程的不确定性和参数的非线性同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素是复杂的，得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素是复杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵过程的一般方法对
2、于控制代谢是十分必要的法对于控制代谢是十分必要的 第七章第七章 发酵过程工艺控制发酵过程工艺控制一一 发酵过程工艺控制的目的发酵过程工艺控制的目的有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来目标是得到最大的比生产速率和最大的生产目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率率第一节第一节 发酵过程工艺控制的发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次目的、研究的方法和层次为了全面的认识发酵过程，本章首先要告诉大为了全面的认识发酵过程，本章首先要告诉大家分析发酵过程的基本方法，在此基础上再举家分析发酵过程的基本
3、方法，在此基础上再举一些例子，说明如何综合分析发酵过程及进行一些例子，说明如何综合分析发酵过程及进行优化放大。优化放大。二二 发酵过程研究的方法和层次发酵过程研究的方法和层次1、研究方法、研究方法单因子实验单因子实验：对实验中要考察的因子逐个进行试对实验中要考察的因子逐个进行试验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实验验优点优点 一次可以进行多种条件的实验，可以在较一次可以进行多种条件的实验，可以在较快时间内得到的结果。快时间内得到的结果。缺点缺点 如果考察的条件多，实验时间会比较长如果考察的条件多，实验时间会比较长各因子之间可能会产生交互作用，影响
4、的结果准各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准确性确性例：最佳例：最佳pHpH的确定的确定配制不同初始配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情的培养基，摇瓶考察发酵情况况pH对产海藻酸裂解酶的影响对产海藻酸裂解酶的影响数理统计学方法数理统计学方法：运用统计学方法设计实验和分运用统计学方法设计实验和分析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、均匀设计、响应面设计。均匀设计、响应面设计。优点优点 同时进行多因子试验。用少量的实验，经过同时进行多因子试验。用少量的实验，经过数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，数理分析得到单因子实验同样的结果
5、，甚至更准确，大大提高了实验效率。大大提高了实验效率。但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中存在较大的误差就会得出错误的结果。存在较大的误差就会得出错误的结果。例例 利用热冲击处理技术提高发酵甘油的产量利用热冲击处理技术提高发酵甘油的产量背景：背景：（1）酵母在比常规发酵温度髙）酵母在比常规发酵温度髙10200C的温度下的温度下经受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。经受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。（2）Lewis发现热冲击能提高细胞对盐渗透压的
6、耐发现热冲击能提高细胞对盐渗透压的耐受力受力（3）Toshiro发现热冲击可使胞内发现热冲击可使胞内3磷酸甘油脱磷酸甘油脱氢酶的活力提高氢酶的活力提高1525，并导致甘油产量提高，并导致甘油产量提高实验：甘油发酵是在髙渗透压环境中进行的，实验：甘油发酵是在髙渗透压环境中进行的，因此可望通过热冲击来提高发酵甘油的产量因此可望通过热冲击来提高发酵甘油的产量正交条件正交条件A 冲击温度（冲击温度（0C）40，45，50 B 开始时机（开始时机（h）8，16，30 C 冲击时间（分）冲击时间（分）15，30，60A 温度；温度；B 开始时机；开始时机；C 冲击时间冲击时间结果发酵结果发酵16小时，小时
7、，45 冲击冲击30分钟最佳，分钟最佳，发酵发酵96小时后甘油浓度提高小时后甘油浓度提高32.62 2、研究的层次、研究的层次初级层次的研究初级层次的研究：一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最适温度、最适适温度、最适pH等要求。等要求。摇瓶研究的优点是处理量大，可以一次试验几摇瓶研究的优点是处理量大，可以一次试验几十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优化有较高的效率。化有较高的效率。摇瓶优化配方：菌种筛选，反应器研究的基础摇瓶优化
8、配方：菌种筛选，反应器研究的基础代谢及工程参数层次研究代谢及工程参数层次研究：一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以得到的代谢情况比较
9、可信。得到的代谢情况比较可信。小型发酵罐：反应器小型发酵罐：反应器水平水平,参数连续参数连续鸟苷发酵过程曲线鸟苷发酵过程曲线生产规模放大生产规模放大：在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐的优化条件在大型反应器上得以实现的优化条件在大型反应器上得以实现,达到产达到产业化的实现。业化的实现。一般来说微生物在不同体积的反应器中的生一般来说微生物在不同体积的反应器中的生长速率是不同的，原因可能是，长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造罐的深度造成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不同剪切力
10、不同，灭菌时营养成分破坏程度不同所致。所致。第二节第二节 发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉程中微生物的主要代谢变化。因为微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数眼无法看见，要了解它的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。来判断，所以说中间分析是生产控制的眼睛。这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映发酵过程中菌的生理代谢状况，如菌的生
11、理代谢状况，如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等粘度，菌浓度等一一 发酵过程的主要控制参数发酵过程的主要控制参数参数按性质分可分三类：参数按性质分可分三类：一物理参数一物理参数 1.温度温度：指发酵整个过程或不同阶段所维持的温度。：指发酵整个过程或不同阶段所维持的温度。2.压力压力：发酵罐维持的压力。：发酵罐维持的压力。3.搅拌转速搅拌转速：搅拌器在发酵罐中转动速度：搅拌器在发酵罐中转动速度 4.搅拌功率搅拌功率：搅拌器搅拌时所消耗的功率：搅拌器搅拌时所消耗的功率 与氧体积传递系数与氧体积传递系数Kla有关有关 5.空气流量空气流量：与氧的传递，其他控
12、制参数有关：与氧的传递，其他控制参数有关 6.粘粘度度：粘粘度度可可作作为为细细胞胞生生长长或或细细胞胞形形态态的的一一项项指指标标，也也能能反反映映发发酵酵罐罐中中菌菌丝丝分分裂裂过过程程的的情情况况，可可表表示示菌菌体体的相对浓度，并可改变氧传递阻力的相对浓度，并可改变氧传递阻力 7.浊度浊度：可表示单细胞生长状况的参数：可表示单细胞生长状况的参数 二、二、化学参数化学参数 1.PH：是是发发酵酵过过程程中中各各种种产产酸酸，产产碱碱生生化化反反应应的的综综合合结结果果，与与菌菌体体生生长长和和产产物合成有重要的关系物合成有重要的关系 2.基基质质浓浓度度：发发酵酵液液中中糖糖，氮氮，磷磷
13、等等重重要要营营养养物物质质的的浓浓度度，它它们们的的变变化化对对生生产产菌菌的的生生长长和和产产物物的的合合成成有有重重要要影影响响，也也是是提提高高代代谢谢产产物物产产量量的的重重要要控控制制手手段段。必必须须定定时时（或或实实时时）测测定定糖糖（还还原原糖糖，总总糖糖），氮氮（氨氨基基氮氮或或铵铵氮氮）等等基基质质浓度。浓度。3.溶溶解解氧氧浓浓度度：氧氧是是微微生生物物体体内内一一系系列列细细胞胞色色素素氧氧化化酶酶催催化化产产能能反反应应的的最最终终电电子子受受体体，也也是是合合成成某某些些产产物物的的基基质质。所所以以利利用用DO浓浓度度的的变变化化，可可以以了了解解微微生生物物对
14、对氧氧利利用用的的规规律律，反反映映发发酵酵的的异异常常情情况况，是是一一个个重重要要的的控控制制参参数数，也也是是设设备供氧能力的指标。备供氧能力的指标。4.产产物物浓浓度度：是是产产量量高高低低，代代谢谢正正常常与与否否的的重重要要参参数数，也也是是决决定定发发酵酵周周期期长长短短的根据。的根据。5.氧氧化化还还原原电电位位：培培养养基基氧氧化化还还原原电电位位是是影影响响微微生生物物生生长长及及其其生生化化活活性性的的因因素素。在在限限氧氧条条件件下下，氧氧电电极极已已不不能能精精确确使使用用时时，氧氧化化还还原原电电位位就就成成为为控控制制发发酵酵过过程的重要参数程的重要参数 6.尾气
15、尾气O2浓度和浓度和CO2浓度浓度尾气中尾气中O2浓度与生产菌的摄氧率和浓度与生产菌的摄氧率和Kla有关（发酵罐的供氧能力）有关（发酵罐的供氧能力）CO2浓度可计算出生产菌的呼吸商，了解呼吸规律。浓度可计算出生产菌的呼吸商，了解呼吸规律。7.菌菌体体RNA,DNA含含量量，以以及及ATP,ADP,AMP体体系系，NAD(P)-NAD(P)H体体系系，表示菌体生长情况，能量代谢能力，生物合成能力表示菌体生长情况，能量代谢能力，生物合成能力 三、生物参数生物参数 1.菌菌体体浓浓度度（生生物物量量biomass）：菌菌体体浓浓度度的的大大小小和和变变化化速速度度对对生生化化反反应应有有影影响响，特
16、特别别是是对对抗抗生生素素等等次次级级代代谢谢产产物物的的发发酵酵影影响响显显著著，菌菌体体浓度与培养液的粘度，浓度与培养液的粘度，DO都有关。都有关。2.菌菌体体形形态态：菌菌体体形形态态的的改改变变是是生生化化代代谢谢变变化化的的反反映映，尤尤其其是是菌菌丝丝，菌菌丝丝形形态态可可以以作作为为衡衡量量种种子子质质量量，区区分分发发酵酵阶阶段段，控控制制发发酵酵过过程程代代谢谢变化和决定发酵周期的依据之一。变化和决定发酵周期的依据之一。菌浓测定方法菌浓测定方法光密度测定法光密度测定法 OD600660 适合于细菌、酵母适合于细菌、酵母测干重测干重测粘度测粘度压缩体积法（离心）压缩体积法（离心
17、）静置沉降体积法静置沉降体积法从检测手段分可分为：从检测手段分可分为：直接参数：直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、的参数，如温度、pH、残糖等、残糖等间接参数：间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、如摄氧率、KLa等等直接参数又可分为直接参数又可分为:在线检测参数在线检测参数指不经取样直接从发酵罐上安装指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；、搅拌转速；离线检测参数离线检测参数指取出样后测定得到的参数，如指取出样后测定得到的参数，如残糖、残糖
18、、NH2-N、菌体浓度。、菌体浓度。二二 微生物培养过程的参数检测微生物培养过程的参数检测 在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据制提供依据。参数在线检测参数在线检测由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特殊要求：因此对传感器有特殊要求：l插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）（材料、数据）l传感器结构不能存在灭菌不透的死角，
19、以防染传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）菌（密封性好）l传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏）（响应快、灵敏）l传感器性能要稳定，受气泡影响小。传感器性能要稳定，受气泡影响小。带计算机数据采集与控制的生物反应系统带计算机数据采集与控制的生物反应系统P188原理：化学或物理信号原理：化学或物理信号 电信号电信号 放大放大 记录显示仪记录显示仪 控制器（与设定参数比较）控制器（与设定参数比较）发出调节信号发出调节信号 控制器动作控制器动作项目背景项目背景项目背景项目背景 参数的离线检测参数的离线检测举例举例 鸟苷是呈
20、味核苷酸二钠鸟苷是呈味核苷酸二钠“I+G”的重要的重要原料，原料，七十年代上海工业微生物研究所开始研七十年代上海工业微生物研究所开始研究究 发酵水平：发酵水平：7克克/升升 12克克/升升 没有形成产业没有形成产业 肇庆星湖公司从工微所购买上述菌株，肇庆星湖公司从工微所购买上述菌株，经过多年研究开发：经过多年研究开发：发酵水平：发酵水平：12克克/升升 16克克/升升 2000年年I+G 产品首次独家面市，遇到日本产品首次独家面市，遇到日本冲击，同年冲击，同年9月投资月投资2.1亿的新开发厂区全亿的新开发厂区全面停产。面停产。16g/L 25g/L（盈亏持平）（盈亏持平）通过通过鸟苷发酵的数据
21、采集发现：鸟苷发酵的数据采集发现：发酵到发酵到40小时后鸟苷合成速率下降，但糖耗速率小时后鸟苷合成速率下降，但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖并未下降，而且由于耗糖,使发酵过程使发酵过程pH下降，补下降，补入氨水增多。那么糖耗到哪里去了呢？入氨水增多。那么糖耗到哪里去了呢？于是进行以下一些测定与分析于是进行以下一些测定与分析（一）（一）利用高效液相（利用高效液相（HPLC）分析代谢中间产）分析代谢中间产物物 通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生物通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有的代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有的放矢的控制发酵过程放矢的控
22、制发酵过程什么因素导致什么因素导致pH下降？下降？1 1、有机酸的积累、有机酸的积累 有机酸积累有机酸积累 pH下降下降 补加氨水补加氨水 在正常代谢情况下，细胞通过在正常代谢情况下，细胞通过EMP途径和途径和TCA循环循环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累积累发酵后期有机酸积累发酵后期有机酸积累代谢不正常代谢不正常会引起加入的会引起加入的NH4+积累，相应出现产苷速率下降。积累，相应出现产苷速率下降。测定以下中间物测定以下中间物发酵后期丙酮酸积累发
23、酵后期丙酮酸积累2 2、氨基酸的积累、氨基酸的积累在有机酸分析的基础上进一步测定发酵过在有机酸分析的基础上进一步测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸不断积累，并且其积累晚于有机总氨基酸不断积累，并且其积累晚于有机酸和酸和NH4+积累。积累。通过通过HPLC对氨基酸成分分析表明，初始发酵液中对氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在在8小时之前已经降到很低水平，并始终维持在低小时之前
24、已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在水平，而在48小时左右丙氨酸开始出现明显的积小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累量达到初始量的累，发酵液中积累量达到初始量的12.6倍之多，倍之多，其它十余种氨基酸浓度则变化不大，并且在整个其它十余种氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓发酵过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能是代谢流迁移所致。度变化可能是代谢流迁移所致。3 3、分析原因、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以酸的合成可以直接由丙酮酸
25、转化而来，因此可以推断由于推断由于EMP途径代谢流的增加途径代谢流的增加造成了丙酮酸的造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酰胺合成酶（丙氨酸本身又会对谷氨酰胺合成酶（GS）造成反）造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。丙酮酸积累丙酮酸积累 氨水补加增加氨水补加增加NH4+积累积累抑制抑制GS抑制抑制TCA循环循环丙酮酸积累丙酮酸积累激活磷酸果糖激酶激活磷酸果糖激酶EMP流量增加流量增加恶性循环恶性循环丙氨酸丙氨酸积累积累（二）（二）代谢流迁移的酶学证明代谢流迁移的酶学证明糖代谢途径关键酶糖代谢途径关键酶糖酵解途径
26、（糖酵解途径（EMP）在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶 磷酸果糖激酶的时序分析磷酸果糖激酶的时序分析12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，所以所以PFK的活力相对较低。的活力相对较低。24小时后随着发酵过程进小时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平稳。但是到力也基本保持平稳。但是到40小时以后，观察到小时以后，观察到PFK相对酶活增加，前面的测定也表明，丙氨酸和
27、丙酮酸相对酶活增加，前面的测定也表明，丙氨酸和丙酮酸积累，更重要的是鸟苷形成速率减慢甚至停止积累，更重要的是鸟苷形成速率减慢甚至停止，这表这表明此时通过明此时通过EMP途径的糖代谢通量已有了明显的增加。途径的糖代谢通量已有了明显的增加。丙酮酸激酶时序分析丙酮酸激酶时序分析丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在24小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时的水平，这表明在糖代谢时EMP途径代谢流增加途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成
28、代谢流迁移的主要因素迁移的主要因素 磷酸戊糖途径（磷酸戊糖途径（HMP）关键酶）关键酶 磷酸戊糖途径中主要的限速酶是磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6磷酸葡磷酸葡萄糖脱氢酶萄糖脱氢酶，该酶催化，该酶催化6磷酸葡萄糖脱氢磷酸葡萄糖脱氢生成生成6磷酸葡萄糖酸内酯磷酸葡萄糖酸内酯。6磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析由图可以看到，早期由图可以看到，早期6磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过HMP途径途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持从而保持EMP和和
29、HMP途径通量的平衡，此时稳定持续途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到的形成产物；但是到40小时后，小时后，6磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在谢在HMP途径通量下降而途径通量下降而EMP途径通量增加。途径通量增加。三羧酸三羧酸(TCA)循环的关键酶循环的关键酶三羧酸循环是三羧酸循环是“消耗消耗”丙酮酸的途径，三羧丙酮酸的途径，三羧酸流量大，丙酮酸就不会积累。三羧酸循环酸流量大，丙酮酸就不会积累。三羧
30、酸循环中的关键酶为中的关键酶为柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶，其催化乙酰辅，其催化乙酰辅酶酶A与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的循环的启动步骤启动步骤，也是三羧酸循环中的主要，也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸循环中的第一个限速步骤。羧酸循环中的第一个限速步骤。柠檬酸合成酶时序分析柠檬酸合成酶时序分析从图可以看到，从图可以看到，TCA循环的关键酶柠檬酸合成循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表
31、明下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时，在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时，TCA循环的通量并没有发生明显的增加。循环的通量并没有发生明显的增加。结果表明，结果表明，代谢流迁移发生在代谢流迁移发生在EMP和和HMP之间，主要是由于之间，主要是由于EMP和和HMP途径之间的途径之间的分配平衡被打破分配平衡被打破所造成的。所造成的。EMP途径代谢途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。丙氨酸脱氢酶的时序分析丙氨酸脱氢酶的时序分析在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢
32、酶催化由丙酮酸明显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的时序增加相吻合，这些数据表明代氨酸的时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙的丙酮酸节点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓解了氨酸，从而缓解了EMP途径代谢流增加造途径代谢流增加造成的代谢不平衡。成的代谢不平衡。结果加入结果加入EMP途径的抑制剂，克服了代谢途径的抑制剂，克服了代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产量流迁移的问题，提高了鸟苷的产量l创建了全新的补料控制工艺创建了全新的补料控制工艺 50L50L发酵罐：发酵罐：17.217.2克克/L 32/L 32克克/L(60/L(60小时小时)l菌体细胞主流代谢流迁移问题是本项目过菌体细胞主流代谢流迁移问题是本项目过程优化的关键。程优化的关键。结 果