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1、实验八实验八 蛋白质的性质实验（一）蛋白质的性质实验（一）蛋白质及氨基酸的呈色反应1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理3.学习几种常见的鉴定蛋白质和氨基酸的方法一、实验目的（一）双缩尿反应（一）双缩尿反应1.实验原理 尿素加热至1800C左右，生成双缩尿并放出一分子氨。双缩尿在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩尿反应。蛋白质分子中含有肽键，其结构与双缩尿相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定反应式反应式l双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个CSNH2，CH2NH2，CRHNH2，CH
2、2NH2CHNH2CH2OH或 CHOHCH2NH2等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu(NH3)42+。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。2.试剂试剂（1）尿素 10g (2)10%氢氧化钠溶液 250 mL (3)1%硫酸铜溶液 60 mL（4）2%卵清蛋白溶液 80 mL3.实验操作实验操作 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1%硫酸铜
3、溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色 向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液2ml，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现（二）二）茚三酮反应1.实验原理l除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，11 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。l茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和
4、氨缩合生成有色物质。l此反应的适宜pH为57，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。2.试剂试剂（1）蛋白质溶液）蛋白质溶液 100mL2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清蛋清:水水=1:9)（2）0.5%甘氨酸溶液甘氨酸溶液 80mL（3）0.1%茚三酮水溶液茚三酮水溶液 50mL （4）0.1%茚三酮茚三酮-乙醇溶液乙醇溶液 20mL3.实验操作实验操作l取取2 2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1 1mlml，再各加再各加0.50.5ml0.1%ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在茚三酮水
5、溶液，混匀，在沸水浴中加热沸水浴中加热1212分钟，观察颜色由粉色变紫红分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。色再变蓝。l在一小块滤纸上滴一滴在一小块滤纸上滴一滴0.5%0.5%甘氨酸溶液，风干甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴后，再在原处滴一滴0.1%0.1%茚三酮乙醇溶液，在微茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。（三）黄色反应三）黄色反应1.实验原理l含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。l多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，
6、需加入少量浓硫酸才有黄色反应。2.试剂试剂（1）鸡蛋清溶液）鸡蛋清溶液 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用混匀，然后用6层纱布过滤。层纱布过滤。（2）头发）头发（3）指甲）指甲（5）0.5%苯酚溶液苯酚溶液 50mL (6)浓硝酸浓硝酸 200mL (7)0.3%色氨酸溶液色氨酸溶液 10mL (8)0.3%酪氨酸溶液酪氨酸溶液 10mL (9)10%氢氧化纳溶液氢氧化纳溶液 100mL3.实验操作实验操作l向向6 6个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化管 号123456材 料（滴）鸡蛋清溶液4指甲少许头发少许0.5%苯酚40.3%色氨酸40.3%酪氨酸4浓硝酸/（滴）24040444现象思考题思考题l通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法?它们的原理?l能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？l 实验总结