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1、第五章第五章 扫描电镜生物样品制备技术扫描电镜生物样品制备技术常规电镜样品要求常规电镜样品要求：必须必须是干燥的，不含水分或可挥发性物质；是干燥的，不含水分或可挥发性物质；具有一定机械强度，能耐受电子束轰击；具有一定机械强度，能耐受电子束轰击；具有导电性，被激发时能够产生足够的二次电子具有导电性，被激发时能够产生足够的二次电子。生物材料特点生物材料特点：含水分多，质地柔软，机械强度小；含水分多，质地柔软，机械强度小；组成元素的原子序数低，导电性差，组成元素的原子序数低，导电性差，激发后二次电子的产额较少。激发后二次电子的产额较少。制样的制样的任务任务：通过一系列处理，既要尽量完美地保存材料的固
2、有形态，通过一系列处理，既要尽量完美地保存材料的固有形态，又要改良其物理性能，使其适合在电镜下观察成像又要改良其物理性能，使其适合在电镜下观察成像。主要内容主要内容：第一节：第一节 SEM样品的常规制备技术样品的常规制备技术 第二节第二节 特殊要求的扫描制样技术特殊要求的扫描制样技术第一节 扫描电镜样品的常规制备技术冷冻冷冻断裂断裂粘样或滴样粘样或滴样熏蒸固定熏蒸固定干燥干燥花粉、种子及孢子类样品花粉、种子及孢子类样品管道铸型管道铸型腔形器官腔形器官取取材材清清洗洗固固定定脱脱水水干干燥燥粘粘样样镀镀膜膜镜镜检检清洗清洗菌类和组培细胞菌类和组培细胞取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检一、取材一、取
3、材即：获取观察材料获取观察材料。遵循五字原则：遵循五字原则：准、轻、小、净、浓准、轻、小、净、浓1.迅速准确：迅速准确：取材动作要快，部位要准确。取材动作要快，部位要准确。方法方法：因材料而异，通过破碎、解剖、切割、：因材料而异，通过破碎、解剖、切割、分离、提纯等手段，获取样品分离、提纯等手段，获取样品最佳观察面最佳观察面。2.动作轻巧：保护好拟观察面动作轻巧：保护好拟观察面。解剖器械要锋利，不能对材料施加锯、挤、拉压解剖器械要锋利，不能对材料施加锯、挤、拉压的外力。含水分多的、幼嫩材料最好冷冻断裂法。的外力。含水分多的、幼嫩材料最好冷冻断裂法。3.厚度小厚度小：满足观察条件的最小体积，厚度为
4、满足观察条件的最小体积，厚度为12毫米毫米4.纯净防混杂纯净防混杂：花粉、孢子类样品注意防尘、防混杂花粉、孢子类样品注意防尘、防混杂5.悬浮液样品要求悬浮液样品要求合适的浓度合适的浓度：浓度太大造成样品堆积；浓度小则检出困难。浓度太大造成样品堆积；浓度小则检出困难。取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检二清洗：确保得到二清洗：确保得到清洁清洁的的观察表面观察表面1.完整的制样程序中有完整的制样程序中有三次清洗三次清洗固定前清洗：洗去表面的灰尘、黏液等附着物，固定前清洗：洗去表面的灰尘、黏液等附着物，确保确保获得清洁的观察表面获得清洁的观察表面。前固定后清洗：洗净醛类固定液，以免戊二醛与锇酸前固定后清
5、洗：洗净醛类固定液，以免戊二醛与锇酸 反应而反应而削弱削弱锇酸的固定效果锇酸的固定效果。脱水前的清洗：洗净固定液，以免固定液与脱水剂脱水前的清洗：洗净固定液，以免固定液与脱水剂 反应而反应而产生沉淀产生沉淀，影响观察效果。，影响观察效果。2.清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等 选择原则选择原则：清洗液的：清洗液的pH值值、渗透压渗透压、温度温度应该尽量接应该尽量接近样品的近样品的生理值生理值，以免样品因环境突变而导致形态变化，以免样品因环境突变而导致形态变化。植物材料：蒸馏水洗净尘埃；植物材料：蒸馏水洗净尘埃；动物材料：动物材料
6、：等渗等渗生理盐水、生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等；碳酸钠或缓冲液洗去黏液等；游离细胞：用游离细胞：用等渗等渗的缓冲液清洗的缓冲液清洗(精子、血细胞、微生物精子、血细胞、微生物)；覆盖大量黏液的样品覆盖大量黏液的样品(胃黏膜胃黏膜)用低浓度的蛋白水解酶溶液洗；用低浓度的蛋白水解酶溶液洗；组织培养细胞：用相应的培养液清洗；组织培养细胞：用相应的培养液清洗；特殊样品：如乳腺组织富含蛋白质和脂类，分别用特殊样品：如乳腺组织富含蛋白质和脂类，分别用16%的的 甘油和甘油和20%乙醇浸泡清洗；乙醇浸泡清洗；表面附着蜡质、角质层的样品：用有机溶剂脱蜡。表面附着蜡质、角质层的样品：用有机溶剂脱蜡。选
7、择方法：选择方法：取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检3.清洗方法清洗方法：不同材料采用不同方法，灵活应用不同材料采用不同方法，灵活应用（1）植物材料：根部用水冲洗去泥土，植株用水冲洗或滴洗。）植物材料：根部用水冲洗去泥土，植株用水冲洗或滴洗。观察观察气孔状态气孔状态时应注意清洗后时应注意清洗后取材时机取材时机。（2）较干净的样品：）较干净的样品：固定后固定后20倍体积的清洗液轻摇，换液三次倍体积的清洗液轻摇，换液三次。（3）表面附着大量黏液的样品：振荡法或喷射瓶壁加压冲洗）表面附着大量黏液的样品：振荡法或喷射瓶壁加压冲洗。（4）游离细胞、微生物：离心法清洗。）游离
8、细胞、微生物：离心法清洗。（5）超声波清洗：用于表面结构复杂、凹陷、皱折多的样品）超声波清洗：用于表面结构复杂、凹陷、皱折多的样品。样品置清洗液中，超声波清洗器内清洗，必须样品置清洗液中，超声波清洗器内清洗，必须控制功率控制功率（6）灌流清洗：观察管腔内壁结构的样品，避免血液、）灌流清洗：观察管腔内壁结构的样品，避免血液、组织液凝聚而影响观察效果。组织液凝聚而影响观察效果。通过动脉注入清洗液，直到排出液变清为止。必须通过动脉注入清洗液，直到排出液变清为止。必须控制压力控制压力清洗液与样品混合摇匀清洗液与样品混合摇匀 低速离心（反复三次）低速离心（反复三次）取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检1.单
9、固定：只用一种固定剂（通常戊二醛）固定的方法。单固定：只用一种固定剂（通常戊二醛）固定的方法。2.熏蒸固定：固体培养基上培养的菌丝类样品，熏蒸固定：固体培养基上培养的菌丝类样品，用锇酸（或甲醛）用锇酸（或甲醛）蒸汽蒸汽熏蒸固定熏蒸固定0.51小时小时。3.双固定双固定：戊二醛戊二醛(13h)锇酸锇酸(0.51h)4.冷冻固定：液氮冷冻固定：液氮超低温快速冷冻超低温快速冷冻可保存样品的生活状态。可保存样品的生活状态。5.不固定：干种子、花粉、孢子类、毛发类样品。不固定：干种子、花粉、孢子类、毛发类样品。四、脱水四、脱水：梯度系列脱水法。梯度系列脱水法。注意：根据材料性质和大小而调节脱水时间。注意
10、：根据材料性质和大小而调节脱水时间。三、固定方法三、固定方法取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检五、干燥：五、干燥：指除去样品中的残存液体（水或脱水剂），指除去样品中的残存液体（水或脱水剂），使样品中不含液态物质的过程使样品中不含液态物质的过程。原因原因：液态物质脱离样品表面时必须克服表面张力，液态物质脱离样品表面时必须克服表面张力，其反作用力会使样品表面结构产生形变其反作用力会使样品表面结构产生形变。1.自然干燥法：自然干燥法：样品中的水分或脱水剂在大气中样品中的水分或脱水剂在大气中自然蒸发自然蒸发使样品干燥。使样品干燥。适宜样品适宜样品：花粉、孢子、种子、果壳、木质纤维、骨骼；：花粉、孢子、种
11、子、果壳、木质纤维、骨骼；游离细胞类在脱水剂中自然干燥较好游离细胞类在脱水剂中自然干燥较好。特点特点：经济便捷：经济便捷。2.真空干燥法真空干燥法：含水分或脱水剂样品置于真空干燥器内，含水分或脱水剂样品置于真空干燥器内，抽低真空使液态物质挥发，使样品干燥。抽低真空使液态物质挥发，使样品干燥。特点特点：干燥速度快，效果与自然干燥法相近。干燥速度快，效果与自然干燥法相近。3.冷冻干燥法冷冻干燥法：超低温快速冷冻超低温快速冷冻取材取材固定固定脱水脱水制冷剂制冷剂真空升华真空升华粘样粘样液氮、丙烷液氮、丙烷取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检样品干燥法样品干燥法4.临界点干燥法临界点干燥法（critica
12、l piont drying method CPD)(1)干燥原理干燥原理：在密闭容器中加热，使液态干燥剂在密闭容器中加热，使液态干燥剂变为气态，当气态与液态物质的密变为气态，当气态与液态物质的密度相等时，相界消失。这时液态干度相等时，相界消失。这时液态干燥剂的分子内聚力为零，此时液体燥剂的分子内聚力为零，此时液体的表面张力系数为零的表面张力系数为零(即即临界状态临界状态)。在临界状态下继续对容器加热，同在临界状态下继续对容器加热，同时以一定速度排出气体（保持临界状态），时以一定速度排出气体（保持临界状态），直到排净为止。这时样品在直到排净为止。这时样品在无表面张力无表面张力影响的影响的临界状
13、况临界状况下得以干燥。下得以干燥。使使干燥剂气相与液相相等的温度称为该干燥剂的干燥剂气相与液相相等的温度称为该干燥剂的临界温度临界温度。使干燥剂气相与液相相等的气压称为该干燥剂的使干燥剂气相与液相相等的气压称为该干燥剂的临界压强临界压强。加热器加热器CO2CO2取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检临界点干燥法临界点干燥法（2）常用干燥剂与中间剂）常用干燥剂与中间剂：常用干燥剂常用干燥剂：中间剂中间剂：既可以与干燥剂，又能与脱水剂相混溶的液体，既可以与干燥剂，又能与脱水剂相混溶的液体，先置换脱水剂而后又被干燥剂所置换。先置换脱水剂而后又被干燥剂所置换。常用中间剂常用中间剂：醋酸异戊脂，醋酸戊脂。醋酸
14、异戊脂，醋酸戊脂。干燥剂：在临界点干燥器内起临界干燥作用的液体干燥剂：在临界点干燥器内起临界干燥作用的液体.液态液态CO2：,临界温度为临界温度为31.1，临界压强，临界压强72.8标准大气压。标准大气压。F12 ：临界温度临界温度 28.9 ，临界压强，临界压强38.1标准大气压标准大气压。取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检(3)干燥步骤干燥步骤：第一步：中间剂置换脱水剂：第一步：中间剂置换脱水剂：2次次/1015分钟；分钟；第二步：干燥剂置换中间剂：第二步：干燥剂置换中间剂：2次次/1015分钟；分钟；第三步：干燥剂进入临界状态并第三步：干燥剂进入临界状态并维持临界状态维持临界状态排尽干燥剂
15、。排尽干燥剂。1530min510 1520 1020min3540 510min固定脱水固定脱水中间剂中间剂置换置换预预冷样品室冷样品室样品入样品入样品室样品室注入液注入液态态CO2CO2汽化汽化缓慢排气缓慢排气直到排尽直到排尽粘样粘样镀膜镀膜CO2置换置换(4)注意事项：注意事项：放置样品前要预冷样品室，以免过早汽化影响效果；放置样品前要预冷样品室，以免过早汽化影响效果；必须保证干燥剂的纯度以免污染样品；必须保证干燥剂的纯度以免污染样品；控制排出气体速度，必须控制排出气体速度，必须保持保持在在临界状态临界状态下排净气体；下排净气体；样品室温度回到室温，压力回到零后方可开取样品；样品室温度回
16、到室温，压力回到零后方可开取样品；干燥好的样品要防止回潮，要妥善保存。干燥好的样品要防止回潮，要妥善保存。取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检5.有机溶剂干燥法有机溶剂干燥法利用某些有机溶剂利用某些有机溶剂凝固点凝固点较高的特性，对样品进行干燥较高的特性，对样品进行干燥。常用有机溶剂：叔丁醇、乙腈、莰烯常用有机溶剂：叔丁醇、乙腈、莰烯纯水：纯水：结晶点为结晶点为0，再结晶点为，再结晶点为-130 叔丁醇：凝固点为叔丁醇：凝固点为2425.5，10 时全部固化；时全部固化；莰烯：莰烯：凝固点为凝固点为40 干燥方法干燥方法：固定固定脱水脱水75%叔丁醇叔丁醇乙醇溶液乙醇溶液100%叔丁醇叔丁醇100
17、%叔丁醇叔丁醇冷凝冷凝固化固化真空真空干燥干燥粘粘样样镀膜镀膜1015分钟分钟1015分钟分钟浸没浸没样品样品04 取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检六、粘样六、粘样利用粘接剂把样品固定在样品托上利用粘接剂把样品固定在样品托上1.目的要求目的要求：保证样品在样品托上的稳定性；保证样品在样品托上的稳定性；增强样品与样品托之间的导电性，观察时样品表面增强样品与样品托之间的导电性，观察时样品表面 不造成不造成电荷堆积电荷堆积而发生放电现象。而发生放电现象。2.常用粘接剂：银粉导电胶、碳粉导电胶、双面胶带常用粘接剂：银粉导电胶、碳粉导电胶、双面胶带。3.粘样方法粘样方法：保护观察面保护观察面，导电胶：用
18、于粘贴大块样品（组织块）；导电胶：用于粘贴大块样品（组织块）；双面胶带：用于花粉类细小易分散的样品；双面胶带：用于花粉类细小易分散的样品；不粘贴：细菌、血液等单细胞直接滴在样品托上；不粘贴：细菌、血液等单细胞直接滴在样品托上；胶水：果壳、种子等较大颗粒的样品。胶水：果壳、种子等较大颗粒的样品。七、镀膜七、镀膜:取材清洗固定脱水干燥粘样镀膜镜检在在样品以及样品托表面同时喷镀一层金属膜样品以及样品托表面同时喷镀一层金属膜要求要求：镀膜必须镀膜必须薄而均匀薄而均匀，本身无结构，能够再现样品表面的，本身无结构，能够再现样品表面的固有形态，化学性质稳定，不与样品发生化学反应。固有形态，化学性质稳定，不与
19、样品发生化学反应。目的目的：改善生物样品的导电性；提高二次电子的产额，改善生物样品的导电性；提高二次电子的产额，改善图像的反差、亮度、分辨率，从而改善了改善图像的反差、亮度、分辨率，从而改善了 图像的质量；并增强了样品的机械强度。图像的质量；并增强了样品的机械强度。1.离子溅射镀膜法离子溅射镀膜法：金、铂、金金、铂、金钯、铂钯、铂钯合金钯合金（1）镀膜原理）镀膜原理：0.53KV110-2Torr抽低真空，加负高压，抽低真空，加负高压，残留气体分子电离，残留气体分子电离，撞击靶金属产生粒子，撞击靶金属产生粒子，粒子受电场作用飞向粒子受电场作用飞向阳极落在样品表面。阳极落在样品表面。应用：微生物
20、样品的处理应用：微生物样品的处理液体培养基液体培养基 的菌落的菌落固体培养基固体培养基的菌落的菌落,先先滴固定液滴固定液刮下刮下菌落菌落8000离心离心25分钟分钟常规固定常规固定脱水干燥脱水干燥粘样镀膜粘样镀膜细菌细菌霉菌霉菌切割菌落切割菌落戊二醛固定戊二醛固定常规脱水干燥常规脱水干燥杆菌杆菌10m球菌球菌10 m曲霉曲霉20 m酵母菌酵母菌5 m矮粟葵花粉矮粟葵花粉第二节第二节 特殊要求的扫描制样技术特殊要求的扫描制样技术组织细胞的内部结构观察法组织细胞的内部结构观察法切断法：多孔组织切断法：多孔组织掰开法：实质性组织掰开法：实质性组织拉断法：纤维组织拉断法：纤维组织简易剖出法简易剖出法环
21、氧树脂割断法环氧树脂割断法：冷冻割断法冷冻割断法：管道铸型法：腔形器官的立体构架管道铸型法：腔形器官的立体构架内部结构剖出法内部结构剖出法离子蚀刻法离子蚀刻法：适用于适用于多孔隙组织多孔隙组织，如肺、脾等，如肺、脾等。1.切断法：切断法：方法：干燥的样品方法：干燥的样品双刀切割双刀切割粘样镀膜粘样镀膜观察观察新新切面切面一、一、组织内部结构简易剖出法：组织内部结构简易剖出法：2.镊子掰开法镊子掰开法适用于肝脏等实质性器官以及密度大的组织适用于肝脏等实质性器官以及密度大的组织3.双面胶带拉断法：双面胶带拉断法：方法：切痕方法：切痕掰开掰开粘样粘样镀膜观察镀膜观察适用于纤维组织、颗粒样品适用于纤维
22、组织、颗粒样品方法：干燥方法：干燥粘样粘样拉断拉断镀膜观察镀膜观察二、环氧树脂割断法二、环氧树脂割断法：环氧树脂环氧树脂包埋样品包埋样品固固化化敲敲断断溶溶去去树脂树脂干燥干燥镀膜镀膜观观察察-80小锤敲击刀背小锤敲击刀背三、冷冻割断法：三、冷冻割断法：常用二甲基亚砜常用二甲基亚砜(DMSO)冷冻割断法冷冻割断法取材取材固定固定清清洗洗保护保护包埋包埋固固化化断断裂裂融化融化保护液保护液清洗清洗干燥干燥镀膜镀膜观察观察DMSO过渡，过渡，12.5%，25%，50%各各2030分钟，分钟，缓冲液缓冲液液氮液氮冷却冷却敲击敲击断裂断裂50%DMSO四、管道铸型法四、管道铸型法为观察为观察腔形器官腔
23、形器官内循环系统的内循环系统的立体构筑立体构筑和和分布情况分布情况，而设计的制样方法。而设计的制样方法。铸型剂注入铸型剂注入官腔内，待官腔内，待其固化成形其固化成形后，用腐蚀后，用腐蚀剂去掉组织，剂去掉组织，从而使反映从而使反映官腔真实情官腔真实情况的铸型样况的铸型样品保留下来，品保留下来，经干燥镀膜经干燥镀膜后观察分析后观察分析.插图犬肾髓旁犬肾髓旁血管铸型血管铸型犬肾犬肾小叶间动脉小叶间动脉肾肾髓髓质质血血管管分分布布肾小体肾小体球球动脉动脉叶叶间间动动脉脉出出球球小小动动脉脉1.管道铸型的技术条件：管道铸型的技术条件：铸型剂应具有适当的黏度：相当铸型剂应具有适当的黏度：相当2050%的甘
24、油黏度；的甘油黏度；铸型剂成型后应具有耐腐蚀，干燥不变形、脆裂、耐高温；铸型剂成型后应具有耐腐蚀，干燥不变形、脆裂、耐高温；控制灌注压力：控制灌注压力：100mmHg左右，与组织和铸型剂有关。左右，与组织和铸型剂有关。2.铸型操作技术：铸型操作技术：（1）铸型剂：聚氯乙烯、甲基丙烯酸、丙烯酸单体、树脂）铸型剂：聚氯乙烯、甲基丙烯酸、丙烯酸单体、树脂 类、工程塑料。类、工程塑料。60下进行半聚合，调节黏度适中。下进行半聚合，调节黏度适中。（2）器官处理：摘取新鲜器官，生理盐水由动脉注入清洗，）器官处理：摘取新鲜器官，生理盐水由动脉注入清洗，1%戊二醛灌流固定，确保效果。戊二醛灌流固定，确保效果。
25、（3）加入硬化剂：灌注前加入，）加入硬化剂：灌注前加入，10分钟即可硬化。分钟即可硬化。（4）灌注铸型：）灌注铸型：控制注入压力控制注入压力，确保完全注入而不变形，确保完全注入而不变形。（5）样品腐蚀清洗：）样品腐蚀清洗：1020%的的NaOH或或2050%的盐酸中，的盐酸中，常温下约常温下约7天，提高温度可缩短腐蚀时间天，提高温度可缩短腐蚀时间。（6）清洗、修整、干燥）清洗、修整、干燥(371h)、即可镀膜观察。即可镀膜观察。五、离子蚀刻法五、离子蚀刻法利用离子溅射仪辉光放电时产生的利用离子溅射仪辉光放电时产生的阴离子阴离子(电子电子)冲击冲击样品样品表面，使样品表面的成分被剥离，表面，使样品表面的成分被剥离，暴露暴露出样品出样品内层结构内层结构。切割切割断裂：界面断裂：界面 断开断开蚀刻：表面蚀刻：表面 剥离剥离表面剥离使内部结构暴露花粉破壁花粉破壁