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1、初始污染菌检查初始污染菌检查凌真凌真 Tel Tel：1377350097713773500977扬州药品检验所扬州药品检验所 药理室药理室2012-3-302012-3-30生物学检查生物学检查n n初始污染菌检查n n空气中细菌总数检测方法n n物体表明和生产人员手细菌总数检测方法微生物学检查微生物学检查无菌检查无菌检查微生物限度检查微生物限度检查细菌、真菌数量细菌、真菌数量控制菌控制菌其他（其他（初始污染菌初始污染菌）初始污染菌检测初始污染菌检测指标含义（！）指标含义（！）通过测定检品细菌总数可用来判明检通过测定检品细菌总数可用来判明检品品细菌细菌污染的程度，以及生产单位所用的污染的程度
2、，以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、生产人员的原料、工具设备、工艺流程、生产人员的卫生状况，是对检品进行卫生学评价的卫生状况，是对检品进行卫生学评价的综综合依据。合依据。初始污染菌检测n n目的：目的：保证灭菌的效果，确定灭菌剂量，保证灭菌的效果，确定灭菌剂量，监控灭菌过程的有效性。监控灭菌过程的有效性。n n引用标准：引用标准：GB7918.2 GB7918.2 化妆品微生物标准检验方法化妆品微生物标准检验方法 细菌总细菌总数测定数测定 GB15980-1995 GB15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准一次性使用医疗用品卫生标准 中华人民共和国药典中华人民共和国药典20
3、102010版版 附录附录 微生物限度微生物限度检查法检查法GB7918.2GB7918.2细菌总数细菌总数指1g或1ml化妆品（检品）中所含的活菌数量，测定细菌总数可用来判明化妆品（检品）被细菌细菌污染的程度，以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者（生产工人手细菌总数）的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据综合依据。GB15980-1995n n规规定定了了一一次次性性使使用用医医疗疗用用品品灭灭菌菌、消消毒毒前前、后后的的卫卫生生标标准准。对对一一次次性性使使用用医医疗疗用用品品（包包括括灭灭菌菌和和消消毒毒的的一一次次性性使使用用医医疗疗用用品品）生生产产企企业业中中
4、生生产产、装装配配、包包装装车车间间（空空气气中中细细菌菌总总数数检检查查方方法法）等等生生产产过过程程和和生生产产工工人人手手提提出出卫卫生生要要求求的的质质量控制。量控制。检测环境 和检验量和检验量 在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向空气区域内进行。洁净区设置可在微生物室操作 各类产品每批随机抽样10件样品（10个包装）方法主要步骤采样采样供试液制备供试液制备培养培养菌落计数菌落计数初始污染菌检测初始污染菌检测采样方法采样方法 供试液制备1.供试品是供试品是敷料、可以破坏性类敷料、可以破坏性类可用无菌手续称取可用无菌手续称取10g,放入放入100ml灭菌生理盐水中灭菌生理
5、盐水中充分振荡后取样。作为充分振荡后取样。作为1：10的供试液。的供试液。2.2.供试品是供试品是液体液体取取10ml加至加至100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。作为灭菌生理盐水中充分振荡后取样。作为1：10的供试液。的供试液。3.3.对供试品对供试品不能采用破坏性不能采用破坏性取样可用浸有取样可用浸有无菌无菌生理盐水拭子涂抹采样，被采表面生理盐水拭子涂抹采样，被采表面积为积为100cm2.加入灭菌生理盐水加入灭菌生理盐水100ml。作为供试液。作为供试液。4.4.可用破坏性可用破坏性方法取样供试品：方法取样供试品：（参照（参照中华人民共和国中华人民共和国药典药典2010年规定进行年规定进
6、行)5.对有对有内腔内腔的医疗用器的医疗用器:用定量洗脱液，无菌操作冲洗内腔，反复冲洗，充分振落后用定量洗脱液，无菌操作冲洗内腔，反复冲洗，充分振落后 取样。取样。6.对一次性输液（血）器的零配件及其他医疗器械对一次性输液（血）器的零配件及其他医疗器械:直接用直接用定量洗脱液定量洗脱液（1ml/10cm2）冲洗，将洗脱液置于无菌容器中，充分振荡后取样。冲洗，将洗脱液置于无菌容器中，充分振荡后取样。初始污染菌检测初始污染菌检测梯度稀释梯度稀释1ml1ml1ml1ml1ml供试液供试液9mlNacl9mlNacl1:101:1001:1000检验方法 将每样取5份平行样（取一份样品，根据限值制备好
7、供试液后，取5份1:10，取5份1:100，取5份1:1000，）初始污染菌检测结果计算公式：结果计算公式：结果计算公式：结果计算公式：平均菌落数平均菌落数平均菌落数平均菌落数稀释倍数菌数稀释倍数菌数稀释倍数菌数稀释倍数菌数 菌数菌数菌数菌数/每件次（或每件次（或每件次（或每件次（或g g）=件次或重量（件次或重量（件次或重量（件次或重量（g g）注意事项：注意事项：注意事项：注意事项：uu供试品的取样必须在万级环境中供试品的取样必须在万级环境中供试品的取样必须在万级环境中供试品的取样必须在万级环境中100100级净化条件下，无菌操作，防止级净化条件下，无菌操作，防止级净化条件下，无菌操作，防
8、止级净化条件下，无菌操作，防止污染。污染。污染。污染。uu应严格遵守无菌操作，同时消除抑菌成份的干扰。应严格遵守无菌操作，同时消除抑菌成份的干扰。应严格遵守无菌操作，同时消除抑菌成份的干扰。应严格遵守无菌操作，同时消除抑菌成份的干扰。产品初始污染菌数限值：n n灭菌产品管道类内腔10cfu/件次，外部100cfu/件次，非管道类100cfu/件次，敷料类100cfu/g；消毒产品1000cfu/件次或重量（g）初始污染菌检测初始污染菌检测供试液制备供试液制备推荐的制备方法样样 品品 制制 备备供试液制备供试液制备梯度稀释梯度稀释加加 样样用灭菌剪刀将纱布剪成小块，称取用灭菌剪刀将纱布剪成小块，
9、称取10g，移入，移入100ml灭菌生理盐水中，灭菌生理盐水中，不时振摇。作为不时振摇。作为1：10供试液。供试液。供试液供试液10倍递减稀释。倍递减稀释。尽量避免丝线等杂物的混入。尽量避免丝线等杂物的混入。（1）每个稀释级各吸取）每个稀释级各吸取1ml至每个灭至每个灭 菌平皿，每个稀释级注菌平皿，每个稀释级注5个平皿。个平皿。（2）经灭菌完毕的营养琼脂培养基冷却至）经灭菌完毕的营养琼脂培养基冷却至45-50 时，倾注上述各个平皿时，倾注上述各个平皿15ml，另，另倾注一个注入倾注一个注入1ml稀释液（灭菌生理盐水）稀释液（灭菌生理盐水）灭菌空平皿作阴性对照。按一个方向快速灭菌空平皿作阴性对照
10、。按一个方向快速转动平皿，使供试液与培养基充分混匀。转动平皿，使供试液与培养基充分混匀。纱布模拟纱布模拟培养培养琼脂凝固后，倒置，琼脂凝固后，倒置，37 培培养养48h细细 菌菌 计计 数数基本概念 细菌数测定是微生物的定量检查，对非规定灭菌产品中污染的活细菌数测定是微生物的定量检查，对非规定灭菌产品中污染的活菌数量进行测定，通常以每克或每毫升供试品作为计量单位。菌数量进行测定，通常以每克或每毫升供试品作为计量单位。限制条件 平板菌落计数法的特点是先使细胞分散、定位，增生可见菌落后平板菌落计数法的特点是先使细胞分散、定位，增生可见菌落后计数。它是一种有条件的计数法，其限制条件大致如下：计数。它
11、是一种有条件的计数法，其限制条件大致如下：以菌落数为基础。以菌落数为基础。CFU(colony forming units):一个菌落就是一个细菌形成单位，它一个菌落就是一个细菌形成单位，它 可以由一个也可以由多个菌细胞形成。可以由一个也可以由多个菌细胞形成。受特定培养基和培养条件限制。受特定培养基和培养条件限制。有繁殖能力的菌细胞才能认定有繁殖能力的菌细胞才能认定“活菌活菌”。细菌计数细菌计数n n先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5-105-10倍倍倍倍的放大镜检查，以投射
12、光衬以暗色背景，以防遗漏的放大镜检查，以投射光衬以暗色背景，以防遗漏的放大镜检查，以投射光衬以暗色背景，以防遗漏的放大镜检查，以投射光衬以暗色背景，以防遗漏（可辅助菌落计数器）记下各平皿的菌落数后，求出（可辅助菌落计数器）记下各平皿的菌落数后，求出（可辅助菌落计数器）记下各平皿的菌落数后，求出（可辅助菌落计数器）记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数（每个稀释度的同一稀释度各平皿生长的平均菌落数（每个稀释度的同一稀释度各平皿生长的平均菌落数（每个稀释度的同一稀释度各平皿生长的平均菌落数（每个稀释度的5 5个平板值，相加后除以个平板值，相加后除以个平板值，相加后除以个平板值，
13、相加后除以5 5）。）。）。）。n n若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数，若片状菌落不到平皿中的一半，而该平皿不宜计数，若片状菌落不到平皿中的一半，而该平皿不宜计数，若片状菌落不到平皿中的一半，而该平皿不宜计数，若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌
14、落计数后乘菌落计数后乘菌落计数后乘菌落计数后乘2 2，以代表全皿菌落数。，以代表全皿菌落数。，以代表全皿菌落数。，以代表全皿菌落数。菌落特征菌落特征 形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡褐色、淡褐色、淡褐色、淡黄色（如果培养基中加入淡黄色（如果培养基中加入淡黄色（如果培养基中加入淡黄色（如果培养基中加入0.1%TTC0.1%TTC(氯化三苯基四氮唑试剂氯化三苯基四氮唑试剂)，菌落为菌落为菌落为菌落为红色）红色）红色）红色）边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱边缘整齐或
15、不整齐，表面有光滑、粗糙，皱边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱褶、突起或扁平。褶、突起或扁平。褶、突起或扁平。褶、突起或扁平。大小差异很大。大小差异很大。大小差异很大。大小差异很大。平皿号细菌数平行行间1 1：10101:1001:100阴性阴性阴性阴性对对对对照照照照373748h48h菌落菌落菌落菌落计计计计数数数数373737374848h h h h菌落菌落菌落菌落计计计计数数数数 菌落均菌落均菌落均菌落均值值值值1、选取平均菌落数在、选取平均菌落数在30300之间的稀释级作为报告菌落数测定范围。之间的稀释级作为报告菌落数测定范围。如只有如只有
16、1个稀释级平均菌落数在个稀释级平均菌落数在30300之间，则将稀释级的菌落数乘以稀之间，则将稀释级的菌落数乘以稀 释倍数报告。释倍数报告。2、如有两个相邻稀释级的平均菌落数在、如有两个相邻稀释级的平均菌落数在30300之间，则先计算两稀释级菌落之间，则先计算两稀释级菌落数的比值。数的比值。高稀释级的平均平板菌落数高稀释级的平均平板菌落数稀释倍数稀释倍数比值比值=低稀释级的平均平板菌落数低稀释级的平均平板菌落数稀释倍数稀释倍数当比值当比值2时，则以时，则以2个稀释级的平均菌落数均值报告。个稀释级的平均菌落数均值报告。当比值当比值2时，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告。时，则以低稀释级的平
17、均菌落数乘以稀释倍数报告。补充：如有补充：如有3个稀释级，平均菌落数均在个稀释级，平均菌落数均在30300之间，则以后之间，则以后2级计算级间比级计算级间比值报告。（增加解释值报告。（增加解释2）菌落计数基本规则菌落计数基本规则3、如各稀释级平均菌落数均在、如各稀释级平均菌落数均在300以上，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀以上，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在30以下，则按稀释度最低的平均菌以下，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。落数乘以稀释倍数报告。4、如各稀释级平均菌落数均不在、如各稀释级平均菌落数均不在3
18、0300之间，则以最接近之间，则以最接近30或或300的稀释级平的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。均菌落数乘以稀释倍数报告。5、如各稀释级平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均菌落数小于、如各稀释级平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均菌落数小于1时，应报时，应报告菌数为告菌数为10个个/g或或ml。6、菌落计数的报告，菌落数在、菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告。大于以内时，按实有数值报告。大于100时，采用时，采用二位有效数字，在两位有效数值后面，应以四舍五入法计算。在报告菌落数二位有效数字，在两位有效数值后面，应以四舍五入法计算。在报告菌落数为为“不可计不可计”时，应表
19、明样品的稀释度时，应表明样品的稀释度细菌计数结果及报告方法例次例次例次例次不同稀不同稀不同稀不同稀释释释释度的平均菌落数度的平均菌落数度的平均菌落数度的平均菌落数两稀两稀两稀两稀释释释释度菌数度菌数度菌数度菌数之比之比之比之比菌落菌落菌落菌落总总总总数数数数个个个个/g/g或个或个或个或个/ml/ml报报报报告方式告方式告方式告方式个个个个/g/g或个或个或个或个/ml/ml1010-1-11010-2-21010-3-31 113651365164164202016400164001600016000或或或或1 1.6 610104 42 22760276029529546461 1.6 6
20、38000380003800038000或或或或3 3.8 810104 43 32890289027127160602 2.2 227100271002700027000或或或或2 2.7 710104 44 4不可不可不可不可计计计计46504650513513513000513000510000510000或或或或5 5.1 110105 55 5272711115 5270270270270或或或或2 2.7 710102 26 6不可不可不可不可计计计计305305121230500305003100031000或或或或3 3.1 110104 4空气中细菌总数检测方法空气中细菌总数
21、检测方法 n n测定空气中动态下细菌总数。测定空气中动态下细菌总数。采用采用平板暴露法平板暴露法：车间在：车间在30m230m2以上者，以上者，于东、西、南、北（距墙于东、西、南、北（距墙1m1m处）、中五点；处）、中五点；小于小于30m230m2者，于一条对角线里、中、外三点，者，于一条对角线里、中、外三点，高度均在高度均在1.5m1.5m处采样，将普通营养琼脂平板处采样，将普通营养琼脂平板（9cm9cm直径）按上述采样点和高度布放，暴直径）按上述采样点和高度布放，暴露露15min15min后立即关盖，于后立即关盖，于3737温箱培养温箱培养24h24h后后观察后果，求出观察后果，求出5 5
22、个或个或3 3个采样点的平均菌数个采样点的平均菌数计算公式计算公式n n菌数菌数/m3=/m3=式中：式中：AA平板面积，平板面积，cm2cm2；TT平板暴露时间，平板暴露时间，minmin；NN平均菌落数。平均菌落数。n n标准限值：标准限值：灭菌和消毒产品分别灭菌和消毒产品分别 500500和和 2000cfu/m32000cfu/m3物体表面和生产人员手细菌总物体表面和生产人员手细菌总数检测方法数检测方法 采样方法采样方法:n n将内径为将内径为5cm5cm5cm5cm的灭菌规格板，放在被检物体表的灭菌规格板，放在被检物体表面，根据物体表面积大小，采平行样面，根据物体表面积大小，采平行样
23、1 14 4个，用浸个，用浸有灭菌生理盐水的棉拭子，在规格板内涂抹有灭菌生理盐水的棉拭子，在规格板内涂抹1010次次（往返计为（往返计为1 1次），将棉拭子放入次），将棉拭子放入10ml10ml灭菌生理盐水灭菌生理盐水的采样管中。的采样管中。n n对生产人员手采样：被检人五指并拢，将浸有灭菌生对生产人员手采样：被检人五指并拢，将浸有灭菌生理盐水的棉拭子在右手指曲面，从指尖、甲沟至指根理盐水的棉拭子在右手指曲面，从指尖、甲沟至指根处往返涂抹处往返涂抹1010次后，将棉拭子放入次后，将棉拭子放入10ml10ml灭菌生理盐灭菌生理盐水的试管中。水的试管中。检验方法和结果计算检验方法和结果计算n n将每个采样管震打80次，混匀，10倍递减稀释，对每个稀释度(取3个稀释度)，分别取1ml放于灭菌平皿内，每个稀释度倾注2块平板），用普通琼脂培养基作倾注培养，置37温箱倒置培养24h，观察结果，取菌落数为30300的平板计算，求出平均菌落数。n n菌数菌数/cm2=/cm2=n n菌数菌数/每只手每只手=平均菌数平均菌数 稀释倍数稀释倍数