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1、月季的花药培养月季的花药培养课题课题目目标标1、说说出被子植物花粉出被子植物花粉发发育的育的过过程及花程及花药药培养培养产产生花粉植株的两种途径；生花粉植株的两种途径；2、说说出影响花出影响花药药培养的因素，学培养的因素，学习习花花药药培养的培养的基本技基本技术术；3、尝试尝试用月季或其他植物的花用月季或其他植物的花药进药进行培养。行培养。课题课题重点、重点、难难点点 重点：重点：选选取适宜的取适宜的培养材料培养材料和和培养基培养基；难难点：点：选选取适宜的取适宜的培养材料培养材料和和培养基培养基.课题课题背景背景1、1964年印度科学家首次培养毛叶曼陀年印度科学家首次培养毛叶曼陀罗罗花花药药
2、，由由花粉粒花粉粒发发育育获获得得单单倍体植株：倍体植株：说说明：明：生殖生殖细细胞胞在离体条件下也具有在离体条件下也具有发发育全能性。育全能性。2、自、自20世世纪纪60年代以来，花年代以来，花药药培养的研究迅速培养的研究迅速发发展，据展，据记载记载已有已有250多种高等植物的花多种高等植物的花药药培养培养获获得得成功，成功，近近50多种花粉再生植株由我国科技人多种花粉再生植株由我国科技人员员首先首先培育成功。培育成功。知识回顾单单倍体育种的倍体育种的过过程？程？花花药药离体培养（离体培养（N）单单倍体植株（倍体植株（N）秋水仙素秋水仙素处处理，使染理，使染色体加倍色体加倍植株植株（2N）特
3、点：特点：1 明明显缩显缩短育种年限短育种年限2 后代植株都后代植株都为纯为纯合子（后代无性状分离）合子（后代无性状分离）正常植株（正常植株（2N）一、基础知识一、基础知识（一）被子植物的花粉（一）被子植物的花粉发发育育（二）（二）产产生花粉植株的两种途径生花粉植株的两种途径（三）影响花（三）影响花药药培养的因素培养的因素（一）被子植物的花粉发育（一）被子植物的花粉发育（1）被子植物定）被子植物定义义：凡是种子有果皮包被着，胚珠凡是种子有果皮包被着，胚珠有子房壁包被着的植物，就叫做被子植物（有子房壁包被着的植物，就叫做被子植物（绿绿色开花色开花植物）植物）被子植物和裸子植物被子植物和裸子植物（
4、2）裸子植物定）裸子植物定义义：凡是胚珠裸露，外面没有子房凡是胚珠裸露，外面没有子房壁包被，种子外面没有果皮包被的植物称壁包被，种子外面没有果皮包被的植物称为为裸子植物裸子植物（无真正意（无真正意义义上的花）上的花）实实例：玉米、大豆、梨、杏例：玉米、大豆、梨、杏实实例：松、杉、柏例：松、杉、柏（被子植物）花的结构（被子植物）花的结构花托花托花萼花萼花瓣花瓣雄蕊雄蕊花药花药花丝花丝雌蕊雌蕊柱头柱头花柱花柱子房子房花粉囊花粉囊 当花粉囊的壁当花粉囊的壁组织组织逐步逐步发发育分化育分化时时，会形成，会形成大量的大量的花粉母花粉母细细胞（小胞（小孢孢子母子母细细胞胞）。）。花粉花粉 花粉粒是由花粉粒
5、是由花粉母花粉母细细胞胞经过经过减数分裂减数分裂而形成，而形成，因此，花粉粒是因此，花粉粒是单单倍体的生殖倍体的生殖细细胞胞。被子植物花粉的被子植物花粉的发发育要育要经历经历：四分体四分体时时期、期、单单核期和双核期核期和双核期等等阶阶段。段。被被子子植植物物花花粉粉发发育育过过程程中中的的四四分分体体时时期期与与减减数数分分裂裂过过程中的四分体程中的四分体时时期是同一期是同一阶阶段段吗吗？【提示提示】不是同一不是同一阶阶段。前者的四分体段。前者的四分体时时期是期是指指4个个单单倍体倍体细细胞胞连连在一起的在一起的时时期；后者的四分期；后者的四分体体时时期是指同源染色体配期是指同源染色体配对对
6、后，一后，一对对同源染色体同源染色体含有四条染色含有四条染色单单体的体的阶阶段。段。二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉管细花粉管细胞核和生殖细胞核胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成）。（精子在花粉管中形成）三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有的花粉在成熟时，含有一个营养核和两个精子。一个营养核和两个精子。注意注意：花粉粒类型花粉粒类型一个成熟的一个成熟的一个成熟的一个成熟的花粉粒即为雄配子花粉粒即为雄配子花粉粒
7、即为雄配子花粉粒即为雄配子体，有两种情况：体，有两种情况：体，有两种情况：体，有两种情况：（二）产生花粉植株的两种途径（二）产生花粉植株的两种途径花粉花粉花粉花粉胚状胚状体体愈伤愈伤组织组织丛芽丛芽生根生根移栽移栽脱分化脱分化分化分化再分化再分化诱导诱导脱分化脱分化说明：说明：1、两种途径之间并没有绝对的界限，主要两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中取决于培养基中激素的种类及其浓度配比激素的种类及其浓度配比。2、无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导无论哪种产生方式，都要先诱导生芽，再诱导生根。生根。体细胞胚（胚状体）体细胞胚（胚状体）：在组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为
8、在组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子发育成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子胚类似，被称为与合子胚类似，被称为体细胞胚（胚状体）体细胞胚（胚状体）。人工种子人工种子又称人造种子、合成种子或无性种子，就是将组织培又称人造种子、合成种子或无性种子，就是将组织培养所产生的养所产生的体细胞胚、不定芽、顶芽、腋芽或小鳞茎体细胞胚、不定芽、顶芽、腋芽或小鳞茎等繁殖体等繁殖体，包裹在能提供营养的胶囊（，包裹在能提供营养的胶囊（人造胚乳人造胚乳）里，）里，再在外面包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外再在外面包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜（膜（
9、人造种皮人造种皮），造成一种类似种子的结构，能在一），造成一种类似种子的结构，能在一定的条件下萌发生长，形成完整植株。定的条件下萌发生长，形成完整植株。人工种子：人工种子：胚状体胚状体/顶芽顶芽/不顶芽等不顶芽等+人工种皮人工种皮+人工胚乳人工胚乳（三）影响花药培养的因素（三）影响花药培养的因素1、影响花药培养的主要因素有哪些？、影响花药培养的主要因素有哪些？2、诱导成功率的重要因素是？、诱导成功率的重要因素是？选择选择合适的花粉合适的花粉发发育育时时期期材料的材料的选择选择与培养基的与培养基的组组成成a.材料选择什么时期最好，为什么？材料选择什么时期最好，为什么？b.如何选择单核期细胞？如何
10、选择单核期细胞？花期为初花期，花粉发育在单核靠边期，成功率最高。花期为初花期，花粉发育在单核靠边期，成功率最高。选择完全未开放的花蕾选择完全未开放的花蕾 1.不不选择单选择单核期之前花核期之前花药药原因：原因：2.不不选择单选择单核期之后花核期之后花药药原因原因3.选择选择完全未开放花蕾的原因完全未开放花蕾的原因 花花药质药质地幼嫩，容易破碎地幼嫩，容易破碎花瓣开始松花瓣开始松动动，给给材料消毒材料消毒带带来困来困难难困困难难完全未开放的花蕾，可挑完全未开放的花蕾，可挑选选到到单单核期的核期的花花药药，菌少、易消毒，菌少、易消毒为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？为什么花瓣松动会给材料的消毒
11、带来困难？花瓣松动后，花瓣松动后，微生物微生物就可能就可能侵入侵入到花药，给到花药，给材料的消毒带来困难。材料的消毒带来困难。花花药药培养所采用的培养基各成分中植物生培养所采用的培养基各成分中植物生长调节剂长调节剂的水平和配比起决定作用。的水平和配比起决定作用。诱导诱导愈愈伤组织伤组织或胚状体或胚状体产产生的培养基：广泛使用生的培养基：广泛使用 2，4-D、IAA；诱导诱导分化的培养基常除去分化的培养基常除去2，4-D而以而以IBA代之。代之。亲亲本植株的生本植株的生长长条件、材料的低温条件、材料的低温预处预处理、接种密理、接种密度等度等对诱导对诱导的成功率都有一定的影响。的成功率都有一定的影
12、响。培养基的培养基的组组成：成：3、其他因素：、其他因素：实验操作实验操作材料选取材料选取材料和材料和消毒消毒接种和接种和培养培养二、实验操作二、实验操作（一）材料选取（一）材料选取 2、通、通过过镜检镜检来确定是否来确定是否处处于适宜的于适宜的发发育期育期。最常用方法：最常用方法：醋酸洋醋酸洋红红法法(将染色体染成将染色体染成红红色色)焙花青焙花青-铬矾铬矾法法(花粉花粉细细胞核染成胞核染成蓝蓝黑色黑色)。1、从花从花药药看看：月季的初花期：月季的初花期 从花粉看：从花粉看：单单核期核期 从花蕾看从花蕾看：完全未开放的：完全未开放的 花花药药（载载玻片上）玻片上）1%的醋酸洋的醋酸洋红红1滴
13、滴用用镊镊柄将花柄将花药药捣捣碎，盖上盖玻片碎，盖上盖玻片镜检镜检（花粉粒的（花粉粒的细细胞核被染成胞核被染成红红色）色）花花药药（在卡（在卡诺诺氏固定液中氏固定液中处处理理20min）取出，置于取出，置于载载玻片上玻片上焙花青焙花青铬矾铬矾溶液染色溶液染色盖上盖玻片盖上盖玻片镜检镜检（花（花粉粒的粉粒的细细胞核被染成胞核被染成蓝蓝黑色）黑色）（二）材料的消毒（二）材料的消毒5、无菌水冲洗35次 花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态1、花蕾用、花蕾用体体积积分数分数为为70%的酒精的酒精浸泡浸泡30秒秒2、无菌水清洗、无菌水清洗3、无菌吸水、无菌吸水纸纸吸干花蕾表面的水分吸干花蕾表面的
14、水分4、放入、放入质质量分数量分数为为0.1%的的氯氯化汞化汞溶液中溶液中24分分钟钟 （质质量分数量分数为为1%的的次次氯氯酸酸钙钙溶液溶液或或饱饱和漂白粉溶液和漂白粉溶液）月季花蕾的消毒与菊花外植体的消毒相比较，月季花蕾的消毒与菊花外植体的消毒相比较，二者有何不同？二者有何不同？在酒精消毒前，花药不需要预先用流水冲洗、在酒精消毒前，花药不需要预先用流水冲洗、洗衣粉洗涤和软刷刷洗洗衣粉洗涤和软刷刷洗。因为月季花蕾外面有花萼、花瓣或颖片保护，因为月季花蕾外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。穗消毒即可。（三）接种
15、和培养（三）接种和培养 1 灭菌后花蕾，要在 下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。3 通常每瓶接种花通常每瓶接种花药药 ，温度控制在，温度控制在 左右，左右，。幼小植株形成后才。幼小植株形成后才 。2 在剥离花在剥离花药时药时，要尽量，要尽量 （否否则则接种后，接种后，容易从受容易从受伤伤部位部位产产生二倍体的愈生二倍体的愈伤组织伤组织），同），同时还时还要要彻彻底底 ，因因为为与花与花丝丝相相连连的花的花药药不利于愈不利于愈伤组织伤组织或或胚状体的形成胚状体的形成。一般一般经过经过20-30天培养后，会天培养后，会发现发现花花药药开裂，开裂，长长出出愈愈伤组织伤组织或或释释放出胚状
16、体放出胚状体。将愈。将愈伤组织伤组织及及时转时转移到分化培养基上，以便移到分化培养基上，以便进进一步分化出再生植株。一步分化出再生植株。4 进进一步一步鉴鉴定和定和筛选筛选：常常会出常常会出现现染色体倍性的染色体倍性的变变化化无菌条件无菌条件 不不损伤损伤花花药药去除花去除花丝丝7-10个个25不需要光照不需要光照需要光照需要光照主要原因是主要原因是花花粉管核和生殖粉管核和生殖核融合核融合造成的造成的或花粉壁或花粉壁细细胞胞发发育成的植株育成的植株（四）（四）结果分析与评价结果分析与评价1、选材是否恰当、选材是否恰当 选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。
17、2、无菌技术是否过关、无菌技术是否过关 如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。3、接种是否成功、接种是否成功 如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。选材消毒接种培养筛选和诱导移栽栽培选育制备培养基外植体消毒接种培养移栽栽培操作流程高度不育，染色体加倍后可育可育可育性单倍体植株正常植株培养结果有性生殖无性生殖繁殖方式生殖细胞体细胞材料选取选材、营养、激素、pH、温度、光照等影响因素脱分化再分化基本过程植物细胞的全能性理论依据月季的花药培养菊花的组织培养项目内容植物组织培
18、养技术与花药培养技术的比较植物组织培养技术与花药培养技术的比较项目相同点不同点植物组织培养技术离体的植物组织经脱分化形成愈伤组织，再分化成丛芽，诱导出根，然后进行移栽。外植体为体细胞，染色体数无需加倍。花药培养技术取材为花药，培养的为单倍单倍体幼苗体幼苗，植株弱小，高度不育，必须用秋水仙素处理，使染色体加倍，恢复正常植株的染色体数，而且为纯种纯种。基础基础知识知识实验操作实验操作被子植被子植物的花物的花粉发育粉发育花粉花粉双核期双核期其他因素其他因素接种密度接种密度小孢子四分体时期小孢子四分体时期影响因素影响因素花粉发育经花粉发育经历的时期历的时期花粉囊花粉囊单核期单核期亲本植株的生长条件亲本植株的生长条件材料低温预处理材料低温预处理月月季季的的花花药药培培养养材料与培养基材料与培养基材料的选取材料的选取产生途径产生途径结果分析与评价结果分析与评价消毒消毒花粉花粉培养条件培养条件接种和培养接种和培养课堂小结课堂小结