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1、微生物工程微生物工程利用生物特性和发酵理利用生物特性和发酵理论，通过现代化的工程论，通过现代化的工程技术手段，进行工业化技术手段，进行工业化规模生产，使受培养的规模生产，使受培养的微生物或动植物细胞积微生物或动植物细胞积累所需产品的一门技术累所需产品的一门技术学科学科 微生物发酵技术v 1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”v 巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；随着科学技术的发展，可以用加热处理等方法来杀死有害的微生物，防止酒发生质变。同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人工培养，根据不
2、同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。利用微生物的特点v发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌 利用微生物的特点：(1)对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力 (2)有极强的消化能力 (3)有极强的繁殖能力 一、发酵的定义1 1、传统发酵、传统发酵2 2、生化和生理学意义的发酵、生化和生理学意义的发酵3 3、工业上的发酵、工业上的发酵1、传统发酵v最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。2、生化和生理学意义的发酵v指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为
3、电子受体的氧化还原产能反应。v如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。图示总结E1E2葡萄糖葡萄糖ATPADP葡萄糖葡萄糖-6-磷酸磷酸果糖果糖-6-磷酸磷酸ATPADP1，6-二磷酸二磷酸果糖果糖乳酸乳酸NAD+NADH+H+E3E1：己糖激酶己糖激酶E2：6-磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶-1E3：丙酮酸激酶丙酮酸激酶3-磷酸甘油酸磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸丙酮酸ATPADP1，3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛NAD+NADH+H+ADPATPPiH2O3、工业上的发酵v泛指利用微生物制造或生
4、产某些产品的过程 包括：1.厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2.通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。v产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。二、发酵工业1.定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。v适宜的微生物v保证或控制微生物进行代谢的各种条件v进行微生物发酵的设备v精制成产品的方法的设备2.获得发酵产品的条件三、发酵工业的发展历史v天然发酵阶段v纯培养技术的建立：巴斯德，科赫等。人为地控制微生物的发酵进程。v通气搅拌发酵技术的建立：青霉素的生产深层培养v代谢控制发酵技术：微生物进行甾体化合物的转化，Glu和Lys发酵生产。
5、对微生物具有高度专一性的酶反应作为合成手段的一部分加以利用，进行合理的代谢。v开拓发酵原料时期：石油发酵，醋酸生产谷氨酸v基因工程阶段：采用酶学的方法，将不同来源的DNA进行体外重组，再把重组DNA设法转入受体细胞内，并进行繁殖和遗传下去。人们能够根据自己的意愿将微生物以外的基因件导入微生物细胞中，从而达到定向地改变生物性状与功能创新的物种，使发酵工业能够生产出自然界微生物所不能合成的产物。四、发酵工业的范围1、以微生物细胞为产物的发酵工业2、以微生物代谢产物为产品的发酵工业3、以微生物酶为产品的发酵工业4、生物转化或修饰化合物的发酵工业5、微生物废水处理和其他1、生产微生物细胞物质v定义：是
6、以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。v特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。2、微生物酶发酵v酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。v分类：胞内酶 和胞外酶v生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。3、微生物代谢产物发酵v包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。v对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。v各
7、种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。4、微生物的生物转化v定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。v最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。5、微生物特殊机能的利用v利用微生物消除环境污染v利用微生物发酵保持生态平衡v微生物湿法冶金v利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域。五、发酵工业的特征v发酵过程中离不开微生物的作用1、发酵原料的选择及预处理2、微生物菌种的选育及扩大培养3、发酵设备选择及工艺条件控制：常温、常压。种子扩大培养和发酵
8、采用不同的工艺。4、发酵产物的分离提取5、发酵废物的回收和利用(1)发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。(2)微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种选育，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。(3)发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件简单。(4)发酵对杂菌的污染的防治至关重要。反应必需在无菌条件下进行。(5)由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行
9、特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。(6)发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单一的代谢产物。(7)工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快，并可以取得较显著的经济效益。(8)除利用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的遗传工程菌进行反应。六、发酵方法的类别与流程v1、类别：根据对氧的需要区分：厌氧和有氧发酵 根据培养基物理性状区分：液体和固体发酵 根据从微生物生长特性区分：分批发酵和连续发酵2、发酵的流程空气空气净化处理保藏菌种斜面活化扩大培养种子罐主发酵碳源、氮源、无机盐等营养物质灭菌产物分离纯化成品2.
10、工业发酵步骤和工艺流程(1)用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制(2)培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌(3)将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发 酵罐中(4)将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物(5)将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品(6)回收或处理发酵过程中产生的废物和废水菌种筛选菌种筛选摇瓶试验摇瓶试验发酵罐中试发酵罐中试由实验室研究到产业化的过程由实验室研究到产业化的过程发酵生产发酵生产发酵工程生产产品的流程图发酵工程生产产品的流程图Theessentialcomponentsofafermentor发酵的主体设备发酵的主体设备2.1发酵原料的预
11、处理原料不同处理方法也有所差异。1.淀粉利用前需变成糊精或葡萄糖方法：酸水解（高压、耐酸）、酶水解法2.糖蜜加热杀菌和用水冲稀，也可加酸处理后再补充无机盐3.碳氢化合物：石油脱蜡一定馏分的石油经冷却脱蜡而获得的凝固点在-10的油，加入适量无机盐进行接种发酵2.2菌种斜面培养v菌种：已有的优良生产菌种和选育的新菌种v方法：一般都是由保存于冷冻管及砂土管或冰箱中的斜面菌种开始，在正式使用前要先转接到新鲜斜面培养基上活化后，再用于种子扩大培养。2.3 种子扩大培养v扩大培养的方法可以根据需要采用固体培养或液体培养两级不同方式。v固体种子扩大培养一般采用传统的制曲工艺，一般先用克氏瓶或匣子瓶进行扩大，
12、再转接到曲盘扩大培养。需氧微生物：将克氏瓶表面培养的菌种接到装有液体培养基的三角瓶中，在摇床上振荡培养。厌氧微生物：将有菌种的试管斜面或克氏瓶转接到三角瓶液体培养基中静置培养。2.4 微生物发酵和控制v发酵方式可分为固体发酵和液体发酵两种。v固体发酵：适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产比较简单的产品。v液体深层发酵：适合于大规模工业化生产。影响发酵的因素很多，如温度、pH、通风、搅拌、罐压力等等，必须适当地控制影响发酵的各种条件，掌握发酵的动态，并进行杂菌的检查和产物测定，使整个发酵过程顺利进行。2.5 发酵产物的分离提取v利用菌体：离心沉淀或板框压滤法使菌体与醪液分开，也可以用喷雾干燥法直
13、接做成粉剂。v酒精发酵醪蒸馏塔蒸馏；v抗菌素及有机酸根据产物的不同特性，采用离子交换树脂吸附处理、脱色过滤、减压浓缩等方法提取精制。v获得的产物都要按照有关部门制定的国家标准进行质量检验和性能测定，符合要求后才为合格产品。常见的工业微生物微生物是个体微小的生物的总称，v包括原核类（细菌）v真核类（真菌、原生动物、单细胞藻类）v非细胞类（病毒）。菌种的来源菌种的来源菌种的来源菌种的来源微生物的类群庞杂1.原核生物界：例如细菌、蓝藻原核生物界：例如细菌、蓝藻2.真菌界：例如酵母菌真菌界：例如酵母菌3.原生生物界：例如草履虫、变形虫原生生物界：例如草履虫、变形虫4.病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
14、病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒 目前已经知道的微生物约有10万种，分布在以下各界中：农田上层15cm处微生物的数量微生物每克土壤中的数量细菌9.8107放线菌2.0106真菌1.2105藻菌2.5104原生动物3.0104菌落数与空气清洁度的关系空气清洁度菌落数菌落数最清洁的空气最清洁的空气1-21-2洁净空气洁净空气3030个以下个以下普通空气普通空气30-15030-150轻度污染空气轻度污染空气300以下严重污染空气严重污染空气301301以上以上人体微生态中微生物的含量部位含量部位含量眼睛眼睛1g1g肺肺20g20g鼻腔鼻腔10g10g肠道肠道1000g1000g口腔口腔20g20
15、g生殖道生殖道20 g20 g皮肤皮肤200g200g总量1271g1271g人体消化系统中微生物群体(个/g)回肠结肠直肠或粪便双歧杆菌1041071010拟杆菌1031081010肠杆菌103106106肠球菌107乳杆菌104一、细菌1、细菌的结构一、细菌2、细菌的繁殖：细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖细菌主要是以二分裂的方式进行繁殖一、细菌3、细菌的菌落1.定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做群落。2.特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。3.功
16、能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。4.举例：如啤酒酵母菌落、红酵母菌落等。几种菌落二、放线菌1、放线菌的形态二、放线菌2、放线菌的结构气气生生菌菌丝丝孢孢子子丝丝孢子孢子基内基内菌丝菌丝培养基培养基二、放线菌3、放线菌的分布放线菌在自然界分布很广，在土壤、堆肥和湖底、河底的淤泥等处，尤其在土壤中种类和数量很多。4、放线菌的繁殖放线菌没有有性繁殖，主要通过形成无性抱子形式进行无性繁殖，成熟的分生孢子或孢囊孢子在适宜环境里发芽形成新的菌丝体。三、病毒1、病毒的形态三、病毒2、病毒的繁殖吸附吸附吸附吸附注入核酸注入核酸注入核酸注入核酸合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质合
17、成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质释放释放释放释放装配装配装配装配微生物工业对菌种的要求微生物工业对菌种的要求 培养基原料来源广、廉价；培养条件易控制；发酵周期短；菌株高产；抗病毒（噬菌体）能力强；菌株性状稳定，不易变异退化；菌体本身不能是病原菌；真菌（青霉素、头孢等）放线菌（链霉素四环素；红霉素等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：目前发现的生物来源如下：菌种的来源v已工业化产品生产菌的介绍二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵代
18、谢控制发酵：用用人工诱变的方法人工诱变的方法，有意识地改变微生，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50,6050,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：发酵工业发展历史上的一个转折点：HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成和异亮氨酸的合成调节机制调节机制 HT:高
19、丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶葡萄糖葡萄糖-磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸-丙酮酸丙酮酸-丙氨酸丙氨酸.亮氨酸等亮氨酸等乙酰辅酶乙酰辅酶A A草酰乙酸草酰乙酸PS:2,3-PS:2,3-二氢吡啶二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶三、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌生产菌种的保藏与选育生产菌种的保藏与选育 菌种保藏（1）目的：存活，不丢失，不污染；防止优良性状丢失；随时为生产、科研
20、提供优良菌种。（2）基本原理：根据菌种的生理生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态。（3）常用的菌种保藏方法：斜面低温保藏法、石蜡油封保藏法、砂土保藏法、硅胶保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温冻结法等。几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类产孢子微生物各大类36月612月12年110年515年以上简便简便简便简便有效简便有效菌种选育（1）目的：改善菌种的特性，使提高产量，改进质量，降低成本，改革工艺，方便管理及
21、综合利用等。（2）方法：A、自然选育；B、生产选育；C、抗噬菌体菌株选育；D、诱变育种；E、代谢控制育种；F、基因重组育种；一、菌种分离的一般过程土样的采取土样的采取 预处理预处理 培养培养 菌落的选择菌落的选择 菌种的鉴定菌种的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物问题问题：v自然界中有目的微生物分离的原则菌种保藏菌种保藏从自然界分离的菌种从自然界分离的菌种从自然界分离的菌种从自然界分离的菌种产 品基因工程基因工程基因
22、工程基因工程诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种诱变育种生产用菌种生产用菌种生产用菌种生产用菌种扩大培养扩大培养扩大培养扩大培养原原原原 料料料料微生物菌体微生物菌体微生物菌体微生物菌体代谢产物代谢产物代谢产物代谢产物分离提纯分离提纯分离提纯分离提纯接种接种接种接种培养基配置培养基配置培养基配置培养基配置灭菌灭菌灭菌灭菌二、采样时要注意的问题l 气候、水分、空气气候、水分、空气l 来源要广来源要广l 结合产品的特点结合产品的特点l 标签：地点、时间、气候等标签：地点、时间、气候等富集的三种方案：l 定向培养定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的采用特定的有利于目的微生物
23、富集的 条件，进行培养。条件，进行培养。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让让目的微生物在种群中占优势，使筛选变目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。得可能。l 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，类学中考虑，l 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法时只能通过随机分离的办法定向培养的富集方法1 1、底物、底物2 2、pHpH条件条件3 3、培养时间、培养时间4 4、培养温度培养温度等等一切能提高目的微生物相对生长速一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养
24、（固体、液体；分批度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优连续）后使目的微生物在种群中占优势。势。四、菌落的选出四、菌落的选出q 从产物角度出发从产物角度出发在在培养时以产物的形成有目的的设计培养基培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素q 从形态的角度从形态的角度 菌菌落落的的外外观观形形态态，是是微微生生物物的的一一个个重重要要表表征征。如如多多糖糖产产生生菌菌在在适适当当的的培培养养基基上上生生长长，从从具具有有粘粘液液性性的的菌菌落落外外观观上就可以初步识别。上就可以初步识别。实例：碱性纤维素酶产生
25、菌的筛选实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选采样（造纸厂）采样（造纸厂）80度度30分钟处理分钟处理文献文献:产生菌为中性牙孢杆菌，产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34天，选择有凹陷圈的菌落天，选择有凹陷圈的菌落目的l 提高生产能力提高生产能力l 提高产品质量提高产品质量l 开发新产品开发新产品l 解决生产实际问题解决生产实际问题l 防止菌种退化防止菌种退化v菌株选育、分子改造方法基因突变：自然选育、诱变育种自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程杂
26、交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点点突变、易错突变、易错PCR、同序、同序法法DNAShuffling等等v菌株选育、分子改造自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9自然突变有两种情况自然突变有两种情况：一一种种是是我我们们生生产产上上所所不不希希望望看看到到的的，表表现现为为菌菌株株的的衰衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另另一一种种是是我我们们生生产产上上希希望望看看到到的的，对对生生产产有有利利，这这种种突突变成为正突变。变成为正突变。一、自然选育一、自然选育v菌株选育、分子改造自
27、然选育在工业生产上的意义自然选育在工业生产上的意义自自然然选选育育虽虽然然突突变变率率很很低低，但但却却是是工工厂厂保保证证稳稳产产高高产产的的重要措施。重要措施。回回复复突突变变：高高产产菌菌株株在在传传代代的的过过程程中中，由由于于自自然然突突变变导导致致高高产产性性状状的的丢丢失失，生生产产性性能能下下降降，这这种种情情况况我我们们称称为为回回复复突变突变问题：问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？高产菌株是正突变高，还是负突变高？v菌株选育、分子改造自然选育操作步骤：自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞单细胞(孢子孢
28、子)悬液的制备悬液的制备平板分离平板分离挑选单菌落挑选单菌落(注意形态的观察注意形态的观察)发酵试验发酵试验v菌株选育、分子改造诱变育种用用各各种种物物理理、化化学学的的因因素素人人工工诱诱发发基基因因突突变变进进行行的的筛筛选选，称为诱变育种称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂.常用诱变剂的使用方法常用诱变剂的使用方法v物理诱变剂：紫外辐射、电离辐射v化学诱变剂：碱基类似物：5-溴尿密啶-碱基错配羟化剂羟胺-C变成N-4-羟基胞嘧啶(只能与A配对)脱氨剂：亚硝酸-是A、G、C脱落或DNA交联烷化剂：亚硝基胍、甲基磺酸乙酯、硫
29、酸二乙酯-碱基错配或脱落紫外线这是一种使用方便、诱变效果很好的常用诱变剂。在诱变处理前，先开紫外灯预热20分钟，使光波稳定。然后，将35ml细胞悬浮液置6cm培养皿中，置于诱变箱内的电磁搅拌器上，照射35分钟进行表面杀菌。打开培养皿盖，开启电磁搅拌器，边照射边搅拌。处理一定时间后，在红光灯下，吸取一定量菌液经稀释后，取0.2ml涂平板，或经暗培养一段时间后再涂平板。5-溴尿嘧啶(5BU)v称取5-BU，加入无菌生理盐水微热溶解，使浓度为2mg/ml。将细胞培养至对数期并重悬浮于缓冲液或生理盐水中过夜，使其尽量消耗自身营养物质。将5BU加入培养基内，使其终浓度一般为1020g/ml，混匀后倒平板
30、，涂布菌液，使其在生长过程中诱变，然后挑单菌落进行测定。HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶结构类似物抗性结构类似物抗性：Lys的的类似物类似物AEC,Thr的的类似物类似物AHV营养缺陷型营养缺陷型：如如Thr缺陷型缺陷型v菌株选育、分子改造v抗性突变型抗性突变型筛选各种抗性突变型也是生产上常用来提高某些代谢产物的重要途径。如：解烃棒状菌(C.h ydrocarbaclastus)可以产生棒杆菌素(Carynecin)，它是氯霉素的类似物。抗氯霉素的解烃棒杆菌突
31、变株能产生4倍于亲株的棒杆菌素。枯草杆菌的衣霉素抗性突变株的-淀粉酶的产量较亲本提高了5倍代谢工程育种v代谢工程，又称代谢途径工程或途径工程，是利用基因工程技术改造细胞的代谢，以改善细胞的性能的一门新兴学科。v代谢工程可以在对细胞的整个代谢网络的代谢流进行定性、定量分析的基础上，找出制约目标产物积累的关键酶催化反应，并利用基因重组技术直接对代谢途径中的关键酶进行修饰基因工程育种vDNA重排-创造新基因-插入载体-转移宿主细胞表达-不同性状的重组菌株筛选培养基培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微
32、生所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。物培养提供除营养外的其它所必须的条件。发酵培养基发酵培养基发酵培养基的作用：发酵培养基的作用：满足菌体的生长满足菌体的生长促进产物的形成促进产物的形成发酵培养基的要求发酵培养基的要求培养基能够满足产物最经济的合成。培养基能够满足产物最经济的合成。发酵后所形成的副产物尽可能的少。发酵后所形成的副产物尽可能的少。培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。
33、供应。所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。通气、提取、纯化及废物处理等。培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型 一、按纯度一、按纯度合成培养基合成培养基:原料其化学成分明确、稳定原料其化学成分明确、稳定 q适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律 q培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业生产生产 天然培养基天然培养基:采用天然原料采用天然原料
34、q 原料来源丰富原料来源丰富(大多为农副产品大多为农副产品)、价格低廉、适于工业、价格低廉、适于工业 化生产化生产 q 原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性 发酵培养基v培养基的类型及功能M培养基培养基(1L)：Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，CaCl2 0.011g，葡萄糖葡萄糖 2-10,pH 7.0 YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母酵母提取物（英国提取物（英国Oxoid）5g,NaCl 10g，PH 7.2 培养大肠杆菌
35、常用两种培养基培养大肠杆菌常用两种培养基发酵培养基二、按状态固体培养基固体培养基:适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产 半固体培养基半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为脂，一般用量为0.5%0.8%,主要用于微生物的鉴定。主要用于微生物的鉴定。液体培养基液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不是水，其中配有可溶性的或不溶性溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。的营养成分，是发酵工业大规模使用
36、的培养基。三、按用途（从发酵生产应用考虑）三、按用途（从发酵生产应用考虑）培养基按其用途可分为培养基按其用途可分为孢子（斜面）孢子（斜面）培养基、培养基、种子种子培养基培养基和和发酵发酵培养基三种培养基三种 一、碳源一、碳源1、作用、作用提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分的碳成分 提供合成目的产物所必须的碳成分提供合成目的产物所必须的碳成分2、来源、来源糖类、油脂、有机酸、正烷烃糖类、油脂、有机酸、正烷烃v发酵培养基的成分及来源3、工业上常用的糖类、工业上常用的糖类 葡萄糖葡萄糖所有的微生物都能利用葡萄糖所有的微生物都能
37、利用葡萄糖但是会引起葡萄糖效应但是会引起葡萄糖效应q 工业上常用淀粉水解糖工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质但是糖液必须达到一定的质 量指标量指标不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大v发酵培养基的成分及来源 淀粉、糊精淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：难利用、缺点：难利用、发酵液比较稠、一般发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的时加入一定的-淀粉酶淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格底优点：来源广泛、价格
38、底 难利用，可以解除葡萄糖效应难利用，可以解除葡萄糖效应例：地衣牙孢杆菌生产例：地衣牙孢杆菌生产-淀粉酶淀粉酶碳源对碳源对生长和产酶的影响生长和产酶的影响碳碳源源细胞量细胞量-淀粉酶淀粉酶葡萄糖葡萄糖4.20蔗糖蔗糖4.020糊精糊精3.0638.2淀粉淀粉3.0940.2发酵培养基v发酵培养基的成分及来源李江华，无锡轻工大学学报，2004发酵培养基v发酵培养基的成分及来源二、氮源二、氮源 氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源
39、。氮源和无机氮源。1、无机氮源、无机氮源种类种类：氨盐、硝酸盐和氨水氨盐、硝酸盐和氨水特点：特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变的变化如：化如：(NH4)2SO42NH3+2H2SO4 NaNO3+4H2 NH3+2H2O+NaOH 无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫性物质的无机氮
40、源叫生理酸性物质生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质生理碱性物质，如，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的的pH有积极作用。有积极作用。所以选择合适的无机氮源有两层意义：所以选择合适的无机氮源有两层意义：q 满足菌体生长满足菌体生长q 稳定和调节发酵过程中的稳定和调节发酵过程中的pH毛霉产毛霉产蛋白酶的研究蛋白酶的研究初始pH的影响:pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大无机氮源的影响：硫酸铵硝酸铵硝酸钠尿素2、有机氮源、有机
41、氮源来源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟糟。成分复杂成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。盐及生长因子。例例 玉米浆：玉米浆：可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸较多的乳酸 硫、磷、微量元素等硫、磷、微量元素等发酵培养基v
42、发酵培养基的成分及来源 有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响v发酵培养基的成分及来源氮源使用的一些相关问题：q 有机氮源和无机氮源应当混合使用有机氮源和无机氮源应当混合使用早期：容易利用易同化的氮源早期：容易利用易同化的氮源无机氮源无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质q 有些产物会受氮源的诱导和阻遏有些产物会受氮源的诱导和阻遏q 有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力q 开发效果好开发效果好
43、、有、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣 的课题的课题三、无机盐和微量元素三、无机盐和微量元素1、作用：各种不一样、作用：各种不一样2、来源：来源：C、N源，以盐的形式补充源，以盐的形式补充3、用量：根据具体的产品，以实验决定用量：根据具体的产品，以实验决定4、使用注意点使用注意点A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑微量元素在发酵过程中必须加以考虑v发酵培养基的成分及来源例：铁离子例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml发酵罐必须
44、进行表面处理发酵罐必须进行表面处理B、使用时注意盐的形式（使用时注意盐的形式（pH的变化）的变化）例例：黑黑曲酶曲酶NRRL-330,生产生产-淀粉酶，淀粉酶，P对酶活的影响对酶活的影响pH酶活酶活不加不加4.25120分钟分钟加加K2HPO45.4530分钟分钟加加KH2PO44.6275分钟分钟v发酵培养基的成分及来源四、生长因子、前体和产物促进剂四、生长因子、前体和产物促进剂 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。1、生长因子、生长因子
45、 如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重生长因子对发酵的调控起到重要的作用要的作用。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子少的生长因子前前体体指指某某些些化化合合物物加加入入到到发发酵酵培培养养基基中中，能能直直接接彼彼微微生生物物在在生生物物合合成成过过程程中中合合成成到到产产物物物物分分子子中中去去，
46、而而其其自自身身的的结结构构并并没没有有多多大大变变化化，但但是是产产物物的的产产量量却却因因加加入入前前体体而而有有较较大大的提高。的提高。2、前体、前体青霉素：分子量青霉素：分子量356苯苯乙酸乙酸:分子量分子量136作用作用：前：前体体有助于提高产量和组份有助于提高产量和组份用量用量：前：前体的体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化率的问题率的问题例：例：6000单位单位/ml的青霉素的青霉素G,需要多少苯乙酸需要多少苯乙酸青霉素青霉素6000*0.6（微克）（微克）36mg/ml苯乙酸（苯乙酸（36*136）/356=13.8mg/ml=1.3
47、8%实际使用时的转化率在实际使用时的转化率在46-90%之间之间例某厂单耗为：例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素）亿青霉素）转化率为：转化率为：13.8/(0.337/0.6)*36=68%用法用法：前体使用时普遍采用流加的方法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化.流加也有利于提高前提的转化率流加也有利于提高前提的转化率3、产物促进剂、产物促进剂所
48、谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。面的。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促
49、进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。五、水五、水对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。水源质量的主要考虑参数包括水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于酿造行业，水的重要性不言而喻对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的对于常规发酵，可靠、持久，能
50、提供大量成分一致清洁的水。水。目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。和实验方法选择出较为适合的培养基。v发酵培养