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1、LAMP技技术对猪呼吸道主要病原猪呼吸道主要病原诊断的建立与断的建立与应用用 学院：学院：动物科技学院物科技学院 年年级：2009级姓名：夏姓名：夏伟研究意义研究意义研究意义研究意义 猪猪支原体性肺炎是由猪肺炎支原体引起的一支原体性肺炎是由猪肺炎支原体引起的一种慢性肺炎，种慢性肺炎，还称作猪地方流行性肺炎，称作猪地方流行性肺炎，Mare、Switzer和和Goodwin等在等在1965年分年分别从患肺从患肺炎猪的肺炎猪的肺组织中分离出其病原，中分离出其病原，经过试验后成功后成功复制了本病，将此病原被命名复制了本病，将此病原被命名为M.hyopneumoniae。到目前。到目前为止，猪支原体止，
2、猪支原体性肺炎都被养猪性肺炎都被养猪业人士看做是重要疫病之一，它人士看做是重要疫病之一，它可能会造成重大可能会造成重大经济损失，失，发生生频次次较高，而且高，而且该病流行最广，是最病流行最广，是最难预防的。本病防的。本病虽然然发现的的很早，但是近年来很早，但是近年来还是由于是由于经常常发生，生，发生的方生的方式是与式是与PRRS、圆环病毒等其它病原引起猪的混病毒等其它病原引起猪的混合感染，并且合感染，并且对养猪养猪业造成重大的造成重大的经济损失。失。研究意研究意研究意研究意义义 猪猪传染性胸膜肺炎是一种接触性呼吸道染性胸膜肺炎是一种接触性呼吸道传染病，染病，是感染猪胸膜肺炎放是感染猪胸膜肺炎放
3、线杆菌而引起的。主要的杆菌而引起的。主要的临床床特征包括急性出血性特征包括急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎。猪胸膜肺炎放素性坏死性胸膜肺炎。猪胸膜肺炎放线杆菌杆菌Actinobacilluspleuropneumoniae(App)的血清型的血清型现在大概有在大概有12种，其中有一些毒力种，其中有一些毒力较弱且弱且不具有致病性，其他一些不具有致病性，其他一些则会引起会引起严重的疾病。重的疾病。检测后毒力很后毒力很强的是的是1、5、9、11和和12型，而毒力型，而毒力温和的是温和的是3、6型。胸膜肺炎放型。胸膜肺炎放线杆菌寄生在上呼吸杆菌寄生在上呼吸道和扁
4、桃体。病原的道和扁桃体。病原的传播途径主要是通播途径主要是通过飞沫或气沫或气雾在短距离内在短距离内传播，胸膜肺炎放播，胸膜肺炎放线杆菌在体外只能杆菌在体外只能存活存活几天。几天。研究意研究意研究意研究意义义 猪猪巴氏杆菌病（巴氏杆菌病（swine pasteurellosis）又被称作猪肺疫、猪出血性）又被称作猪肺疫、猪出血性败血症，俗称血症，俗称为“锁喉喉风”，是一种因感染多，是一种因感染多杀性性巴氏杆菌而引起的巴氏杆菌而引起的传染病，染病，败血症血症为该病急性型病急性型的主要特征，的主要特征，临床症状包括咽喉部出床症状包括咽喉部出现急性急性肿胀，病猪呼吸困病猪呼吸困难；急性型的主要；急性型
5、的主要临床特征是出床特征是出现纤维素性胸膜肺炎；而慢性型的素性胸膜肺炎；而慢性型的临床症状并不明床症状并不明显，一般表一般表现为慢性肺炎、关慢性肺炎、关节炎和胃炎和胃肠炎等，而且炎等，而且病猪逐病猪逐渐消瘦消瘦，国内，国内的猪群主要是散的猪群主要是散发性的感染。性的感染。近些年来，我国集近些年来，我国集约化养猪化养猪业发展迅速，展迅速，进而猪而猪群感染巴氏杆菌的群感染巴氏杆菌的报道也逐道也逐渐增多。增多。研究意研究意研究意研究意义义 在在黑黑龙江地区的江地区的规模化养猪模化养猪场，疾病控制一，疾病控制一直是十分棘手的直是十分棘手的问题，特，特别是猪的呼吸系是猪的呼吸系统疾病疾病呈蔓延呈蔓延扩大
6、大态势，发病率病率较高，死亡率在高，死亡率在5%15%或以上，猪的各个日或以上，猪的各个日龄阶段均存在呼吸道段均存在呼吸道疾病的危害。呼吸系疾病的危害。呼吸系统疾病除直接造成死亡疾病除直接造成死亡损失失外，外，还因因饲料料报酬大大降低，酬大大降低，继发感染等而造成感染等而造成治治疗费用升高，用升高，给集集约化猪化猪场和养猪和养猪户造成造成严重重的的经济损失。把失。把LAMP技技术运用运用对猪病猪病进行早期行早期快速快速诊断和流行病学断和流行病学调查意意义重大。同重大。同时对规模模化猪化猪场的的发病情况病情况进行流行病学行流行病学调查，根据黑，根据黑龙江省江省规模化猪模化猪场实际制定有效的制定有
7、效的综合防病措施，合防病措施，减少因呼吸道疾病减少因呼吸道疾病给猪猪场带来的来的损失。失。研究内容研究内容研究内容研究内容猪呼吸道疾病的流行病学猪呼吸道疾病的流行病学调查猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立方法的建立LAMP方法的方法的现场应用及用及综合防治措施的制定合防治措施的制定猪呼吸道疾病的流行病学猪呼吸道疾病的流行病学猪呼吸道疾病的流行病学猪呼吸道疾病的流行病学调查调查 采集的病例主要来自黑采集的病例主要来自黑龙江省不同地区的江省不同地区的18个猪个猪场，每个猪，每个猪场采取了不同的病料数，并且采取了不同的病料数，并且了解了解记录了猪了猪场内猪只的内猪只的
8、发病情况。病情况。猪呼吸道疾病的流行病学猪呼吸道疾病的流行病学猪呼吸道疾病的流行病学猪呼吸道疾病的流行病学调查调查采用血清学和采用血清学和PCR分子生物学分子生物学检测方法方法检测病原菌病原菌猪猪猪猪呼吸道疾病流行病学呼吸道疾病流行病学呼吸道疾病流行病学呼吸道疾病流行病学调查调查黑龙江省各地区猪场猪呼吸道疾病流行病学调查柱状图黑龙江省各地区猪场猪呼吸道疾病流行病学调查柱状图猪呼吸道疾病流行病学猪呼吸道疾病流行病学猪呼吸道疾病流行病学猪呼吸道疾病流行病学调查调查 经过统计，在黑，在黑龙江地区的养猪江地区的养猪场，90的猪的猪场都有猪的呼吸都有猪的呼吸道道综合症的合症的发生，在黑生，在黑龙江屠宰江
9、屠宰场时有有发现有肺炎病有肺炎病变的猪肺。猪的猪肺。猪场爆爆发猪呼吸道猪呼吸道综合症后很合症后很难清除，它除了造成直接死亡之外，更清除，它除了造成直接死亡之外，更为严重的是使猪增重重的是使猪增重缓慢，慢，饲料利用率减少，出料利用率减少，出栏时间推推迟，并，并长期携期携带多种相关病原体。有些猪多种相关病原体。有些猪场PRDC的的发病率可达病率可达40%-80%，直接，直接死亡率在死亡率在20%以上，增重下降或生以上，增重下降或生长停滞的可达停滞的可达70%，有的猪，有的猪场甚至被迫将甚至被迫将该阶段的猪全部淘汰。很多呼吸道段的猪全部淘汰。很多呼吸道综合症的病原体所引合症的病原体所引发的的临床症状
10、极床症状极为相似，很相似，很难通通过临床症状做出正确的床症状做出正确的诊断。有些疾病断。有些疾病（如猪（如猪蓝耳病）已耳病）已经不能表不能表现出其出其临床的特异性症状，有些病原体床的特异性症状，有些病原体还有相当有相当长的潜伏期。因此更加的潜伏期。因此更加难以做出准确的以做出准确的诊断。血清学断。血清学诊断断虽然然能在一定程度上做出确能在一定程度上做出确诊，但，但时间较长，难以以满足足现场需要。因此，需要。因此，研究出能研究出能够同同时对多种病原多种病原进行行诊断的方法断的方法势在必行。同在必行。同时对规模化模化猪猪场的的发病情况病情况进行流行病学行流行病学调查，根据黑，根据黑龙江省江省规模化
11、猪模化猪场实际制制定有效的定有效的综合防病措施，减少因呼吸道疾病合防病措施，减少因呼吸道疾病给猪猪场带来的来的损失。失。猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测检测LAMPLAMP方法的建立方法的建立方法的建立方法的建立引物设计与合成引物设计与合成猪支原体、猪胸膜肺炎放猪支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌、杆菌、猪巴氏杆菌基因猪巴氏杆菌基因组的提取的提取 LAMP 诊断方法反断方法反应条件的条件的优化化实验方法实验方法PCR扩增及鉴定扩增及鉴定猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测检测LAMPLA
12、MP方法的建立方法的建立方法的建立方法的建立重重组质粒粒的的鉴定定结果果pMD18-T-Mh载体PCR鉴定结果1-2：扩增Mh基因；3-4：扩增App基因；5：扩增Sp基因；6：阳性对照；7：阴性对照1-5:The PCR identification result of the pMD18-T-Mh、pMD18-T-App、pMD18-T-Sp plasmid6:The positive control;7:The negative controlM 1 2 3 4 5 6 72000bp1000bp750bp500bp250bp100bp猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道
13、疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测检测LAMPLAMP方法的建立方法的建立方法的建立方法的建立LAMP 检测方法反方法反应条件的条件的优化化猪肺炎支原体内外引物的猪肺炎支原体内外引物的优化化外引物不同浓度下电泳结果1-4的浓度：0.1 pmol/L、0.15 pmol/L、0.2 pmol/L、0.25 pmol/L；5：阳性对照6：阴性对照 2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 内引物不同浓度下电泳结果1-4的浓度：0.4 pmol/L、0.
14、5 pmol/L、0.6 pmol/L、0.7 pmol/L；5：阳性对照6：阴性对照 猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测检测LAMPLAMP方法的建立方法的建立方法的建立方法的建立猪放猪放线杆菌内外引物的杆菌内外引物的优化化外引物不同浓度下电泳结果1-5的浓度：0.1 pmol/L、0.15 pmol/L、0.2 pmol/L、0.25 pmol/L；5：0.3 pmol/L；6：阳性对照2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM 1 2 3 4 5 6 2000bp1000bp750bp500bp250bp1
15、00bpM 1 2 3 4 5 内引物不同浓度下电泳结果1-4的浓度：0.4 pmol/L、0.5 pmol/L、0.6 pmol/L、0.7 pmol/L；5：阳性对照猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测检测LAMPLAMP方法的建立方法的建立方法的建立方法的建立猪巴氏杆菌内外引物的优化猪巴氏杆菌内外引物的优化外引物不同浓度下电泳结果1-4的浓度：0.1 pmol/L、0.15 pmol/L、0.2 pmol/L、0.25 pmol/L；5：阴性对照2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM 1 2 3 4 5内
16、引物不同浓度下电泳结果1-3的浓度：0.4 pmol/L、0.5 pmol/L、0.6 pmol/L；4：阴性对照 2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM 1 2 3 4 猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测检测LAMPLAMP方法的建立方法的建立方法的建立方法的建立dNTPdNTP+浓度的浓度的优化浓度的浓度的优化2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM 1 2 3 4 5 6 7 dNTP+不同浓度下电泳结果1-4 的浓度：0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmo
17、l/L、0.6 mmol/L；5：阳性对照；6-7：阴性对照猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测检测LAMPLAMP方法的建立方法的建立方法的建立方法的建立Bst DNA 聚合聚合酶用量的用量的优化化2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM 1 2 3 4 5 6 7 M不同Bst DNA聚合酶下电泳结果1-5的体积：3 U、4.8 U、6.4 U、8 U、9.6 U；6：阳性对照；7：阴性对照猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测检测LAMPLAMP方法的建
18、立方法的建立方法的建立方法的建立MgSO4 浓度的度的优化化2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpMgSO4不同浓度下电泳结果1-5的浓度：2.5 mmol/L、3.75 mmol/L、5 mmol/L、6.25 mmol/L、7.5 mmol/L;2.10：阳性对照；7：阴性对照M 1 2 3 4 5 6 7猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测检测LAMPLAMP方法的建立方法的建立方法的建立方法的建立优化后建立化后建立 LAMP 检测方法方法组成组成体系（体系（L）外引物（支外引物（支F3、支、支R3）（）（
19、10 pmol/L）内引物（支内引物（支F1/F2、支、支R1/R2）（）（10 pmol/L）dNTP（10 mmol/L）MgSO4（25 mmol/L）10LAMP反应缓冲液反应缓冲液Bst DNA 聚合酶（聚合酶（8 U/L）模板模板DNAddH2O合计合计0.41.01.03.02.01.01.010.620.0LAMP 扩增反增反应体系体系 猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测检测LAMPLAMP方法的建立方法的建立方法的建立方法的建立猪支原体肺炎特异性猪支原体肺炎特异性检测2000bp1000bp750bp500bp250b
20、p100bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M特异性检验电泳结果特异性检验电泳结果1：阳性对照；：阳性对照；2：支原体肺炎；：支原体肺炎；3-8：多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、：多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌；肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌；9：阴性对照：阴性对照猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测检测LAMPLAMP方法的建立方法的建立方法的建立方法的建立多多杀性巴氏杆菌特异性性巴氏杆菌特异性检测2000bp1000bp750bp500bp25
21、0bp100bpM 1 2 3 4 M特异性检验电泳结果1：肺炎双球菌；2：副猪嗜血杆菌；3：多杀性巴氏杆菌4：阴性对照猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测检测LAMPLAMP方法的建立方法的建立方法的建立方法的建立猪胸膜肺炎放猪胸膜肺炎放线杆菌特异性杆菌特异性检测2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM 1 2 3 4特异性检验电泳结果1：阴性对照；2：肺炎双球菌3：副猪嗜血杆菌；4：猪胸膜肺炎放线杆菌猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测检测LAMPLAM
22、P方法的建立方法的建立方法的建立方法的建立敏感性敏感性检验结果果2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM 1 2 3 4 5 6 M不同模板浓度下电泳结果1-5的浓度：10-5、10-4、10-3、10-2、10-1；6：10-6猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原猪呼吸道疾病的主要病原检测检测LAMPLAMP方法的建立方法的建立方法的建立方法的建立 试验中以支原体肺炎、多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌基因组为模板，试验中以支原体肺炎、多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌基因组为模板，通过对内外引物的比例、通过对内外引物的比例、dNTP+
23、浓度、浓度、Mg2+浓度和浓度和Bst DNA聚合酶用量等条件聚合酶用量等条件逐一优化。在逐一优化。在1.2的琼脂糖电泳结果表明：其内、外引物的体积分别为的琼脂糖电泳结果表明：其内、外引物的体积分别为1.0L、0.4L，其，其dNTP+的体积为的体积为1.0L，其，其Bst DNA聚合酶的体积为聚合酶的体积为1L，MgSO4 的体的体积为积为3L，整个试验仅需约，整个试验仅需约1h左右，比一些常规的方法时间上要短，在这个条件左右，比一些常规的方法时间上要短，在这个条件下能够得到较为特异的目的梯状条带，与常规下能够得到较为特异的目的梯状条带，与常规PCR 反应相比，大大缩短了检测反应相比，大大缩
24、短了检测时间。并且时间。并且LAMP的反应结果是一种梯状的条带，与肺炎双球菌、支气管败血波的反应结果是一种梯状的条带，与肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌相比，氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌相比，LAMP分析结果能够特异性的鉴别猪肺炎分析结果能够特异性的鉴别猪肺炎支原体，该方法表现出了很高的可靠性，且操作简单。支原体，该方法表现出了很高的可靠性，且操作简单。LAMP方法检测多杀性巴方法检测多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌比常规方法检测及血清学检测时间要缩短很多，而氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌比常规方法检测及血清学检测时间要缩短很多，而且明显增加了检测的敏感性和准确性。且明显增加
25、了检测的敏感性和准确性。从结果中表明可以成功建立了肺炎支原体、放线杆菌和巴氏杆菌的从结果中表明可以成功建立了肺炎支原体、放线杆菌和巴氏杆菌的LAMP诊断诊断方法，为我们国家临床上诊断支原体肺炎、放线杆菌和巴氏杆菌提供了灵敏有效方法，为我们国家临床上诊断支原体肺炎、放线杆菌和巴氏杆菌提供了灵敏有效的分子生物学的方法的分子生物学的方法。LAMPLAMP方法的方法的方法的方法的现场应现场应用及用及用及用及综综合防治措施的制定合防治措施的制定合防治措施的制定合防治措施的制定猪肺炎支原体的防制措施：猪肺炎支原体的防制措施：（l）做好猪）做好猪场环境境卫生工作：定期生工作：定期对猪猪场内内进行行卫生清生清
26、扫和消毒工作。采取自和消毒工作。采取自繁自养的原繁自养的原则，避免引，避免引进种猪或仔猪种猪或仔猪时从外地或其他猪从外地或其他猪场引引进，特，特别是是购猪猪的的车辆进入厂区必入厂区必须经过严格消毒才能格消毒才能进入。入。（2）加）加强饲养管理：养管理：严格注意猪舍内部的温度，格注意猪舍内部的温度，预防突防突发情况，注意猪舍内通情况，注意猪舍内通风顺畅，时刻保持猪舍空气新刻保持猪舍空气新鲜。冬季每天。冬季每天查看猪舍是否有漏看猪舍是否有漏风，夏季注意，夏季注意降低猪舍内的温度。做到合理的降低猪舍内的温度。做到合理的饲养密度：保育舍养密度：保育舍23头/m2；育肥舍；育肥舍0.8头/m2；一个；一
27、个饲养小养小组应该在在1013头猪。猪。饲养使用全价养使用全价饲料，料，这样可以提高猪的抵抗力，同可以提高猪的抵抗力，同时定期定期进行行驱虫。虫。（3）做好疫苗）做好疫苗预防：在仔猪出生防：在仔猪出生721天，注射支原体活苗，通天，注射支原体活苗，通过免疫接种有免疫接种有效地效地预防和控制支原体肺炎。防和控制支原体肺炎。这样对预防支原体肺炎具有防支原体肺炎具有显著效果。著效果。（4）药物控制：定期在物控制：定期在饲料中添加某些料中添加某些药物是物是预防支原体肺炎的重要手段。防支原体肺炎的重要手段。药物有：土霉素、四物有：土霉素、四环素、大素、大环内脂内脂类、替米考星、林克霉素、泰妙菌素、氟、替
28、米考星、林克霉素、泰妙菌素、氟苯尼考、恩苯尼考、恩诺沙星、泰沙星、泰乐菌素、菌素、强力霉素等力霉素等对支原体都有支原体都有较好的好的预防效果。防效果。LAMPLAMP方法的方法的方法的方法的现场应现场应用及用及用及用及综综合防治措施的制定合防治措施的制定合防治措施的制定合防治措施的制定猪巴氏杆菌病的防制猪巴氏杆菌病的防制（1）对于本病的于本病的预防要制定合理的免疫程序，及防要制定合理的免疫程序，及时预防接种。目前主要使用猪防接种。目前主要使用猪繁殖与呼吸繁殖与呼吸综合症合症灭活疫苗和猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三活疫苗和猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗苗进行接种。行接种。蓝耳耳病疫苗在仔猪病疫苗在仔猪45日
29、日龄进行首免，每行首免，每头肌肉注射肌肉注射2毫升。首免后一个月可用相毫升。首免后一个月可用相同同剂量的疫苗加量的疫苗加强免疫一次，后免疫一次，后备母猪在母猪在70日日龄前同仔猪一前同仔猪一样免疫。免疫。怀孕孕母猪在分娩前一个月加母猪在分娩前一个月加强免疫一次，免疫一次，剂量量为每每头4毫升。种公猪在毫升。种公猪在70日日龄前前接种同仔猪一接种同仔猪一样免疫，以后每隔免疫，以后每隔6个月免疫一次，个月免疫一次，剂量量为每每头4毫升。要注毫升。要注意的是已意的是已经发病的猪和屠宰前病的猪和屠宰前21天的猪不宜接种。猪瘟、猪丹毒、猪肺疫天的猪不宜接种。猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三三联苗在接种苗在接种蓝耳
30、病疫苗后耳病疫苗后7天天给予接种。苗猪在予接种。苗猪在阉割割时接种，每接种，每头1毫升，毫升，转群或出售群或出售时再用同再用同样剂量免疫一次。公猪每隔量免疫一次。公猪每隔6个月免疫一次，每个月免疫一次，每头3毫毫升。母猪在苗猪升。母猪在苗猪阉割割时接种，每接种，每头3毫升。毫升。（2）对混合感染的病例，建混合感染的病例，建议联合使用抗菌和抗病毒合使用抗菌和抗病毒药物。可用青霉素、物。可用青霉素、链霉霉素、土霉素、素、土霉素、强力霉素、力霉素、头孢类药、环丙沙星、氟苯尼考等丙沙星、氟苯尼考等药物交替使用。物交替使用。对体温升高的重症病例，在使用抗生素的同体温升高的重症病例，在使用抗生素的同时，可
31、在，可在饮水中加入适量的多种水中加入适量的多种维生素、葡萄糖、生素、葡萄糖、氯化化钾、钠等等补液，以液，以维持机体的内持机体的内环境境稳定。有条件的定。有条件的猪猪场可用干可用干扰素、高免血清、免疫球蛋白等素、高免血清、免疫球蛋白等药物物进行特异性治行特异性治疗。也可用中。也可用中药方方剂清清热败毒散，拌料毒散，拌料饲喂，有一定喂，有一定疗效。效。LAMPLAMP方法的方法的方法的方法的现场应现场应用及用及用及用及综综合防治措施的制定合防治措施的制定合防治措施的制定合防治措施的制定猪猪传染性胸膜肺炎控制措施：染性胸膜肺炎控制措施：（1）注意保持）注意保持环境境卫生：生：环境的境的变化等化等应激
32、刺激可能会促激刺激可能会促进该病的病的发生，因此要减少或生，因此要减少或避免各种避免各种应激因素的影响，加激因素的影响，加强饲养管理，保持养管理，保持为猪群提供足猪群提供足够均衡的均衡的营养。注意保养。注意保持持饲养舍内通养舍内通风良好，空气清新，及良好，空气清新，及时清除清除粪便和垃圾，减少便和垃圾，减少尘埃和氨的含量。埃和氨的含量。（2）加）加强饲养管理：如果条件允养管理：如果条件允许应该采用全采用全进全出的全出的饲养方式，即在猪出养方式，即在猪出栏后后对圈舍圈舍进行行彻底的清底的清洁和消毒和消毒1周后才能再次使用。周后才能再次使用。（3）当引）当引进的公猪和后的公猪和后备母猪母猪时应该确
33、保没有感染确保没有感染过APP，或者引，或者引进的猪接种的猪接种过3次多次多价价APP疫苗。而且接种的疫苗。而且接种的APP疫苗疫苗项目目应该包括主要流行菌株和本包括主要流行菌株和本场分离株的分离株的灭活疫活疫苗。苗。（4）如果爆）如果爆发严重，重，应该制定用制定用药规划。如在混群或划。如在混群或进行其它操作行其它操作处理前理前12d，应该给与猪群一些敏感、广与猪群一些敏感、广谱的抗菌的抗菌药物；也可以物；也可以连续5 d在在饲料中添加料中添加0.04%SM2+TMP。发现有有该病病发生的养殖生的养殖场可以根据根据可以根据根据实际情况，在情况，在发病猪群病猪群饲料中适当增加添加抗生素的料中适当
34、增加添加抗生素的剂量，如量，如连续35 d在在饲料中添加土霉素料中添加土霉素600 g/t，或或连续57 d添加添加(林肯霉素林肯霉素+壮壮观霉素霉素)5001000 g/t，可防止新的病例出，可防止新的病例出现。（5）加）加强养殖养殖场疾病疾病预防，可以通防，可以通过剖剖检和病原分离的方法确定本病是否在本养殖和病原分离的方法确定本病是否在本养殖场内内存在，一旦存在，一旦发现患病猪，患病猪，应该立即隔离立即隔离饲养。如果养。如果发现病猪，病猪，应该及及时进行治行治疗，注，注射青霉素、新霉素、泰射青霉素、新霉素、泰乐菌素、四菌素、四环素等素等疗效效较为显著。感染本病著。感染本病较严重的猪重的猪场
35、可用可用血清学方法血清学方法检查，逐步清除，逐步清除带菌猪。并在菌猪。并在饲料中添加料中添加药物物进行防治，建立健康猪群。行防治，建立健康猪群。LAMPLAMP方法的方法的方法的方法的现场应现场应用用用用病料编号来源时间发病情况病料数阳性结果1-3桦川县猪场2011.09 40日龄左右保育猪咳喘、消瘦334-9桦川县猪场2011.09 60日龄保育猪咳喘、贫血、死亡9810-12肇东猪场2011.09 25日龄咳嗽、消瘦、衰竭死亡3313-19桦川县猪场2011.1035日龄咳嗽、消瘦、衰竭死亡7520肇东猪场2011.10 育肥猪咳嗽、喘、死亡1121-26香坊猪场2011.10 50日龄左
36、右群体性咳喘、死亡率高6527-30肇源猪场2011.10 30日龄左右突然咳喘、发烧、厌食4331呼兰猪场2011.10 80日龄生长猪腹式呼吸、用药无效1132-33呼兰猪场2011.10 外购仔猪，群体咳喘、呼吸困难用药无效2134-38安达猪场2011.11 断奶仔猪消瘦、贫血、治疗无效5539-42肇东猪场2011.11 外购仔猪，群体咳喘、呼吸困难用药无效4243-45大庆猪场2011.11 120日龄育成猪、咳喘、治疗效果差3246-48双城猪场2011.12 45日龄保育猪突然死亡、其他咳喘3349-50平房猪场2011.12 60日龄保育猪咳喘、贫血、死亡2251-53肇东猪
37、场2011.12 60日龄保育猪咳喘、贫血、死亡3354-58宾县猪场2012.01 60-80日龄猪，顽固性咳喘、治疗效果差5359-60肇源猪场2012.01 育肥猪慢性消瘦、治疗效果差、死亡2261-63呼兰猪场2012.01 外购仔猪，突然群体发病，呼吸困难3264双城猪场2012.01 保育40多日龄突然死亡10合计6454阳性率84.38%LAMP检测肺炎支原体阳性肺炎支原体阳性结果果LAMPLAMP方法的方法的方法的方法的现场应现场应用用用用来源时间发病情况病料数阳性结果肇东猪场2011.0925日龄咳嗽、消瘦、衰竭死亡22桦川县猪场2011.135日龄咳嗽、消瘦、衰竭死亡54肇
38、东猪场2011.1育肥猪咳嗽、喘、死亡22香坊猪场2011.150日龄左右群体性咳喘、死亡率高11肇源猪场2011.130日龄左右突然咳喘、发烧、厌食11呼兰猪场2011.1外购仔猪，群体咳喘、呼吸困难用药无效21安达猪场2011.11断奶仔猪消瘦、贫血、治疗无效32大庆猪场2011.11120日龄育成猪、咳喘、治疗效果差33双城猪场2011.1245日龄保育猪突然死亡、其他咳喘43平房猪场2011.1260日龄保育猪咳喘、贫血、死亡11肇东猪场2011.1260日龄保育猪咳喘、贫血、死亡11宾县猪场2012.0160-80日龄猪，顽固性咳喘、治疗效果差33肇源猪场2012.01育肥猪慢性消瘦
39、、治疗效果差、死亡10呼兰猪场2012.01外购仔猪，突然群体发病，呼吸困难22双城猪场2012.01保育40多日龄突然死亡11合计3227阳性率84.38%LAMP检测巴氏杆菌阳性巴氏杆菌阳性结果果LAMPLAMP方法的方法的方法的方法的现场应现场应用用用用LAMP检测胸膜肺炎放胸膜肺炎放线杆菌阳性杆菌阳性结果果来源时间发病情况病料数阳性结果肇东猪场2011.0925日龄咳嗽、消瘦、衰竭死亡11桦川县猪场2011.135日龄咳嗽、消瘦、衰竭死亡22肇东猪场2011.1育肥猪咳嗽、喘、死亡10香坊猪场2011.150日龄左右群体性咳喘、死亡率高54肇源猪场2011.130日龄左右突然咳喘、发烧
40、、厌食32呼兰猪场2011.1外购仔猪，群体咳喘、呼吸困难用药无效11安达猪场2011.11断奶仔猪消瘦、贫血、治疗无效44大庆猪场2011.11120日龄育成猪、咳喘、治疗效果差33双城猪场2011.1245日龄保育猪突然死亡、其他咳喘10平房猪场2011.1260日龄保育猪咳喘、贫血、死亡11肇东猪场2011.1260日龄保育猪咳喘、贫血、死亡54宾县猪场2012.0160-80日龄猪，顽固性咳喘、治疗效果差43肇源猪场2012.01育肥猪慢性消瘦、治疗效果差、死亡11呼兰猪场2012.01外购仔猪，突然群体发病，呼吸困难22双城猪场2012.01保育40多日龄突然死亡21合计3629阳性
41、率80.56%LAMPLAMP方法的方法的方法的方法的现场应现场应用用用用健康猪鼻拭子的检测结果健康猪鼻拭子的检测结果病料来源时间检测份数阳性数阳性率鼻拭子桦川县猪场2011.09 363186.11%鼻拭子肇东猪场2011.09 352982.8%鼻拭子香坊猪场2011.10 272488.89%鼻拭子肇源猪场2011.10 323093.75%鼻拭子呼兰猪场2011.10 181583.33%鼻拭子大庆猪场2011.11 2828 100%合计176 157阳性率89.2%LAMPLAMP方法的方法的方法的方法的现场应现场应用用用用LAMP检测方法与血清学方法与血清学检测法、法、细菌培养菌
42、培养检测法法对比比结果果检测例数阳性例数阳性率（%）LAMP检测法646296.88血清学检测法645484.38细菌培养检测法643757.81结论结论 本研究根据本研究根据 GenBank上发表的猪肺炎支原体、巴氏杆菌和胸膜上发表的猪肺炎支原体、巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌的核苷酸序列，针对该核苷酸序列设计肺炎放线杆菌的核苷酸序列，针对该核苷酸序列设计 4 条特异性引条特异性引物，通过对内外引物的比例、物，通过对内外引物的比例、dNTP+浓度、浓度、Mg2+浓度和浓度和 Bst DNA 聚合酶用量等条件逐一优化后，成功建立的猪支原体、巴氏杆菌和聚合酶用量等条件逐一优化后，成功建立的猪支原体、
43、巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增方法（胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增方法（LAMP）。）。LAMP 方法在方法在恒温恒温 60 条件下条件下 1h 特异性较强，其敏感性为当其猪肺炎支原体、特异性较强，其敏感性为当其猪肺炎支原体、巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌的拷贝数低于为巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌的拷贝数低于为 36 时，不能检测到时，不能检测到该病原体。且经特异性试验中检测肺炎双球菌、支气管败血波氏杆该病原体。且经特异性试验中检测肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌均呈阴性。与常规菌、副猪嗜血杆菌和链球菌均呈阴性。与常规 PCR 反应相比，反应相比，LAMP 法大大缩短了检测时间，且能够特异性鉴别猪肺炎支原体、法大大缩短了检测时间，且能够特异性鉴别猪肺炎支原体、巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌，其敏感性与常规巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌，其敏感性与常规 PCR 方法一致，但方法一致，但该方法具有较好的临床应用性。该方法具有较好的临床应用性。