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1、RNA的提取及定量检测RNA的提取及定量检测nRNA降解的主要因素及RNase的去除nDNA污染的解决方案nRNA的质量检测RNA降解的主要因素n体内RNase的影响1.样品取材要新鲜，并且在液氮或-70冰箱中冻存。2.RNA提取试剂的选择，TRIzol Reagent 或试剂盒。3.匀浆器或是研钵；破碎细胞要快速；尽量在低温下进行。n体外RNase的影响1.空气中的RNase2.试剂中带有的RNase3.实验耗材4.实验者本身体外RNase的去除n玻璃仪器的处理 高温烘烤n塑料材料的处理 DEPC-H2O浸泡，氯仿擦n有机材料的处理 DEPC-H2O浸泡n电泳设备的处理方法 水70乙醇 1M
2、 NaOH DEPC-H2On实验者本身 手套、口罩n操作环境 操作台、周围环境用TRIzol Reagent提取总RNA1.将处理好的叶片剪下，约100mg，放入处理过的研钵中，加入1mL Trizol，研磨。2.抽吸上清液，转移到用DEPC-H2O处理过的灭菌的1.5 mL离心管中。3.加入100 L氯仿剧烈震荡混匀30秒。4.用台式离心机，12,000 rpm，低温离心5分钟。5.重复步骤3一次。6.将上清（450 L）小心转移到RNase-free 1.5 mL离心管中，加入900 L异丙醇，混匀静置5分钟。7.12,000rpm室温离心10分钟。8.弃去上清，用70乙醇清洗沉淀2次。
3、9.弃去乙醇，在室温下干燥沉淀15分钟。10.DEPC-H2O溶解沉淀，室温或5580放置2分钟，促进溶解。离心管内的溶液为RNA样品，可立即使用或者-80保存。上海生工 UNIQ-10柱式Trizol 总RNA抽提试剂盒提取RNA1.将处理好的叶片剪下，约100mg，放入处理过的匀浆器中，加入1mL Trizol，匀浆。2.抽吸匀浆液，转移到用DEPC-H2O处理过的灭菌的1.5 mL离心管中。3.加入100 L氯仿剧烈震荡混匀30秒。4.用台式离心机，12,000 rpm，室温离心5分钟。5.将上清（450 L）小心转移到RNase-free 1.5 mL离心管中，加入150 L无水乙醇，
4、混匀。6.小心将步骤5中的溶液全部转移到套放于收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2分钟，8,000rpm室温离心1分钟。可适当降低离心转速。7.小心取出柱，弃去收集管中的废液，将柱放回收集管中，加入450 L RPE Solution，10,000rpm室温离心30秒。8.重复步骤7一次。9.小心取出柱，弃去收集管中的废液，将柱放回收集管中，10,000rpm室温离心1分钟。10.小心取出柱，放到无菌RNase-free 1.5 mL离心管里，在柱内膜的中央小心加入40 L DEPC-H2O，室温或5580放置2分钟。11.10,000rpm，室温离心1分钟。离心管内的溶液为RNA样品，可
5、立即使用或者80保存。DNA污染的解决方案1.在微量Tube中配置下列反应液，总量50L 总RNA 2050g 10 X DNaseBuffer 5L DNase(RNase-free)2L RNase Inhibitor(40U/L)1L DEPC 水 up to 50L2.37反应3045分钟。3.加入50L的DEPC处理的水。4.加入100L（等量）的苯酚/氯仿（1:1），充分混匀。5.离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。6.加入100L（等量）的氯仿，充分混匀。7.离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。8.加入10L（1/10量）的3M NaAc(pH5.2)。9.加入250
6、L（2.5倍量）的冰无水乙醇，-80放置过夜。10.离心回收沉淀，用70的冰乙醇清洗沉淀，真空干燥。11.用适量的DEPC处理水溶解后，进行Agarose电泳确认是否除去基因组DNA。DNase进行处理RNA的质量检测n紫外定量和检测紫外定量和检测用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD=40ug/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度,纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.92.1之间)。n变性胶电泳质检变性胶电泳质检n变性胶的配制（变性胶的配制（配制100mL 1.2%的电泳胶）10 MOPS Gel Buffer 10.0 ml Agrose 1.2 g RNase-Free Water 90.0 mln加热溶解Agrose，稍微冷却，加入 37%甲醛 1.8 ml EB(10mg/ml)1.0 uln摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1 MOPS Gel Buffer中平衡10分钟，待用。样品变性 5Loading Buffer 2 ul RNA样品 1 ug RNase-Free water 调节至10uln在65，变性5分钟，立即置于冰上冷却。电泳n将处理好的RNA样品，稍微离心，70V恒压电泳1小时。在凝胶成像仪上观察结果。28S18S5S 图图 总总RNA Fig Total RNA