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1、天然药物化学成分提取分离方法天然药物化学成分提取分离方法1 化学成分提取分离方法化学成分提取分离方法天然药物化学研究常从有效成分或生理活性成分的提取、分天然药物化学研究常从有效成分或生理活性成分的提取、分离工作开始。在进行提取之前，应了解所用材料的基源（如离工作开始。在进行提取之前，应了解所用材料的基源（如动、植物的学名）、产地、药用部位、采集时间与方法等。动、植物的学名）、产地、药用部位、采集时间与方法等。目的物为已知成分或已知化学结构类型，如从甘草中提取甘目的物为已知成分或已知化学结构类型，如从甘草中提取甘草酸、麻黄中提取麻黄碱，或从植物中提取某类成分如总生草酸、麻黄中提取麻黄碱，或从植物
2、中提取某类成分如总生物碱或总酸性成分时，工作比较简单。一般宜先查阅有关资物碱或总酸性成分时，工作比较简单。一般宜先查阅有关资料，搜集比较该种或该类成分的各种提取方案，尤其是工业料，搜集比较该种或该类成分的各种提取方案，尤其是工业生产方法，在根据具体条件加以选用。生产方法，在根据具体条件加以选用。从中草药或天然药物中寻找未知有效成分或有效部位时，情从中草药或天然药物中寻找未知有效成分或有效部位时，情况就比较复杂。只能根据预先确定的目标，在适当的活性测况就比较复杂。只能根据预先确定的目标，在适当的活性测试体系指导下，进行提取、分离并以相应的动物模型筛选、试体系指导下，进行提取、分离并以相应的动物模
3、型筛选、临床验证、反复实践，才能达到目的。临床验证、反复实践，才能达到目的。2一、有效成分的提取一、有效成分的提取 溶剂提取法溶剂提取法 水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法 升华法升华法3 溶剂提取法溶剂提取法溶剂提取法系选择适当溶剂将中草药中的化学成分从药材中溶剂提取法系选择适当溶剂将中草药中的化学成分从药材中提取出来。提取出来。天然药物中的化学成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有天然药物中的化学成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为水、亲水性有机溶剂和亲脂性有机溶剂。一关。溶剂可分为水、亲水性有机溶剂和亲脂性有机溶剂。一些常见溶剂的脂性的强弱顺序如下：些常见溶剂的脂性的强弱顺序如下：石油
4、醚石油醚 苯苯 氯仿氯仿 乙醚乙醚 乙酸乙酯乙酸乙酯 丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇甲醇 水水天然药物化学成分可通过结构估计它们的极性。天然药物化学成分可通过结构估计它们的极性。4 溶剂提取法溶剂提取法甙类的分子中结合有糖分子，羟基数目多，能表现强亲水性，甙类的分子中结合有糖分子，羟基数目多，能表现强亲水性，而甙元则属于亲脂性化合物，而生物碱盐，能够离子化，加而甙元则属于亲脂性化合物，而生物碱盐，能够离子化，加大了极性，就变成了亲水性化合物。鞣质是多羟基衍生物，大了极性，就变成了亲水性化合物。鞣质是多羟基衍生物，列为亲水性化合物。油脂、挥发油、蜡、脂溶性色素都是强列为亲水性化合物。油脂、挥发油、蜡、
5、脂溶性色素都是强亲脂性成分。亲脂性成分。萜类、甾体等脂环类及芳香类化合物因为极性较小，易溶于萜类、甾体等脂环类及芳香类化合物因为极性较小，易溶于氯仿、乙醚等亲脂性溶剂中；氯仿、乙醚等亲脂性溶剂中；糖苷、氨基酸等成分极性较大，易溶于水及含水醇中；糖苷、氨基酸等成分极性较大，易溶于水及含水醇中；酸性、碱性及两性化合物，因为存在状态（分子或离子形式）酸性、碱性及两性化合物，因为存在状态（分子或离子形式）随溶液而异，故溶解度将随随溶液而异，故溶解度将随pHpH而改变。而改变。5 溶剂提取法溶剂提取法只要中草药成分的亲水性和亲脂性与溶剂的此只要中草药成分的亲水性和亲脂性与溶剂的此项性质相当，就会在其中有
6、较大的溶解度，即项性质相当，就会在其中有较大的溶解度，即所谓所谓“相似相溶相似相溶”的规律。这是选择适当溶剂的规律。这是选择适当溶剂自中草药中提取所需要成分的依据之一。自中草药中提取所需要成分的依据之一。6 水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法只适用于具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。天然药物中的挥发油、某些小分子生物碱如麻黄碱、烟碱、槟榔碱以及某些小分子的酚性物质如牡丹酚等的提取可采用水蒸气蒸馏法。7 升华法升华法某些固体物质如水杨酸、苯甲酸、樟脑等受热在某些固体物质如水杨酸、苯甲酸、樟脑等受热在低于其熔点的温度下，不经过熔化就可直接转化低于
7、其熔点的温度下，不经过熔化就可直接转化为蒸气，蒸气遇冷后又凝结成固体称为升华。天为蒸气，蒸气遇冷后又凝结成固体称为升华。天然药物中有一些成分具有升华性质，能利用升华然药物中有一些成分具有升华性质，能利用升华法直接中药材中提取出来。但天然药物成分一般法直接中药材中提取出来。但天然药物成分一般可升华的很少。可升华的很少。8二、有效成分的分离与精制二、有效成分的分离与精制9化学成分分离精制常用方法原理化学成分分离精制常用方法原理 根据物质溶解度差别进行分离根据物质溶解度差别进行分离 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 根据物质的吸附性差别进行分离根据物质
8、的吸附性差别进行分离 根据物质分子大小差异进行分离根据物质分子大小差异进行分离10 根据物质溶解度差别进行分离根据物质溶解度差别进行分离 1、利用温度不同引起溶解度的改变、利用温度不同引起溶解度的改变2、改变混合溶剂的极性、改变混合溶剂的极性3、调节溶液的、调节溶液的pH值，改变分子的存在状态值，改变分子的存在状态4、沉淀法、沉淀法 5、盐析法、盐析法 111 1、利用温度不同引起溶解度的改变、利用温度不同引起溶解度的改变鉴鉴定定中中草草药药化化学学成成分分，研研究究其其化化学学结结构构，必必须须首首先先将将中中草草药药成成分分制制备备成成单单体体纯纯品品。中中草草药药化化学学成成分分在在常常
9、温温下下多多半半是是固固体体的的物物质质，常常具具有有结结晶晶性性的的通通性性，可可以以根根据据溶溶解解度度的的不不同用结晶法来达到分离精制的目的。同用结晶法来达到分离精制的目的。中中草草药药化化学学成成分分，一一旦旦获获得得结结晶晶，就就能能有有效效地地进进一一步步精精制制成成为为单单体体纯纯品品。纯纯化化合合物物的的结结晶晶有有一一定定的的熔熔点点和和结结晶晶学学的的特特征征，有有利利于于鉴鉴定定。因因此此，求求得得结结晶晶并并制制备备成成单单体体纯纯品品，就成为鉴定中草药成分、研究其分子结构重要的一步。就成为鉴定中草药成分、研究其分子结构重要的一步。121 1、利用温度不同引起溶解度的改
10、变、利用温度不同引起溶解度的改变结晶法是选用合适的溶剂，将混合物加热溶解，形成有效结晶法是选用合适的溶剂，将混合物加热溶解，形成有效成分的饱和溶液，趁热过滤除去不溶的杂质，滤液低温放成分的饱和溶液，趁热过滤除去不溶的杂质，滤液低温放置或蒸去部分溶剂后再低温放置，使有效成分大部分析出置或蒸去部分溶剂后再低温放置，使有效成分大部分析出结晶，由于初析出的结晶总会带一些杂质，因此需要通过结晶，由于初析出的结晶总会带一些杂质，因此需要通过反复结晶即所谓重结晶的方法，才能得到高纯度的晶体。反复结晶即所谓重结晶的方法，才能得到高纯度的晶体。13 杂质的除去杂质的除去结晶法所用的样品必须是已经用其它方法结晶法
11、所用的样品必须是已经用其它方法提得比较纯的时候才能采用此法精制。提得比较纯的时候才能采用此法精制。结晶乃同类分子自相排列，如果杂质过多，结晶乃同类分子自相排列，如果杂质过多，则阻碍分子的排列。如果粗提取部分的纯则阻碍分子的排列。如果粗提取部分的纯度很差则很难得到结晶。度很差则很难得到结晶。14 杂质的除去杂质的除去 用溶剂溶出杂质，或只溶出所需要的成分。用溶剂溶出杂质，或只溶出所需要的成分。用少量活性炭等进行脱色处理，以除去有色杂质。用少量活性炭等进行脱色处理，以除去有色杂质。通过氧化铝、硅胶柱色谱处理（注意所需要的成分通过氧化铝、硅胶柱色谱处理（注意所需要的成分也可能被吸附而损失）。也可能被
12、吸附而损失）。制备其晶态的衍生物（如游离生物碱可制备各种生制备其晶态的衍生物（如游离生物碱可制备各种生物碱盐类，羟基化合物可转变成乙酰化物，碳基化合物碱盐类，羟基化合物可转变成乙酰化物，碳基化合物可制备成苯腙衍生物结晶）。物可制备成苯腙衍生物结晶）。15 溶剂的选择溶剂的选择适适宜宜的的溶溶剂剂是是在在冷冷时时对对所所需需要要的的成成分分溶溶解解度度较较小小，而而热热时时溶溶解解度度较较大大。溶溶剂剂的的沸沸点点亦亦不不宜宜太太高高。一一般般常常用用甲甲醇醇、丙丙酮酮、氯氯仿仿、乙醇、乙酸乙酯等。乙醇、乙酸乙酯等。有有些些化化合合物物在在一一般般溶溶剂剂中中不不易易形形成成结结晶晶，而而在在某
13、某些些溶溶剂剂中中则则易易于于形形成成结结晶晶。例例如如葛葛根根素素、逆逆没没食食子子酸酸（ellagicacidellagicacid）在在冰冰醋醋酸酸中中易易形形成成结结晶晶，大大黄黄素素）在在吡吡啶啶中中易易于于结结晶晶，萱萱草草毒毒素素在在DMFDMF中中易易得得到到结结晶晶，而而穿穿心心莲莲亚亚硫硫酸酸氢氢钠钠加加成成物物在在丙丙酮酮一一水水中中较较易易得得到到结结晶晶。又又如如蝙蝙蝠蝠葛葛碱碱通通常常为为无无定定形形粉粉未未，但但能能和和氯氯仿仿或乙醚形成为加成物结晶。或乙醚形成为加成物结晶。16 结晶溶液的制备结晶溶液的制备制备结晶的溶液为过饱和的溶液。一般是应用适量的溶剂制备结
14、晶的溶液为过饱和的溶液。一般是应用适量的溶剂在加温的情况下，将化合物溶解再放置冷处。如果在室温在加温的情况下，将化合物溶解再放置冷处。如果在室温中可以析出结晶，就不一定放置于冰箱中，以免伴随结晶中可以析出结晶，就不一定放置于冰箱中，以免伴随结晶析出更多的杂质。析出更多的杂质。无定形的粉未状物质，远较晶体物质的溶解度大，易于形无定形的粉未状物质，远较晶体物质的溶解度大，易于形成过饱和溶液。一般经过精制的化合物，在蒸去溶剂抽松成过饱和溶液。一般经过精制的化合物，在蒸去溶剂抽松为无定形粉未，加入少量溶剂，往往立即可以溶解，稍稍为无定形粉未，加入少量溶剂，往往立即可以溶解，稍稍放置即能析出结晶。例如长
15、春花总弱碱部分抽松后加入放置即能析出结晶。例如长春花总弱碱部分抽松后加入1.51.5倍量的甲醇溶解，放置后很快析出长春碱结晶。又如倍量的甲醇溶解，放置后很快析出长春碱结晶。又如蝙蝠葛碱在乙醚中很难溶解，但当其盐的水溶液用氨液碱蝙蝠葛碱在乙醚中很难溶解，但当其盐的水溶液用氨液碱化，并立即用乙醚萃取，所得的乙醚溶液，放置后即可析化，并立即用乙醚萃取，所得的乙醚溶液，放置后即可析出蝙蝠葛碱的乙醚加成物结晶。出蝙蝠葛碱的乙醚加成物结晶。17 结晶溶液的制备结晶溶液的制备制备结晶溶液，除用单一溶剂外，也常采用混合溶剂。制备结晶溶液，除用单一溶剂外，也常采用混合溶剂。一一般般是是先先将将化化合合物物溶溶于
16、于易易溶溶的的溶溶剂剂中中，再再在在室室温温下下滴滴加加适适量量的的难难溶溶的的溶溶剂剂，直直至至溶溶液液微微呈呈浑浑浊浊，并并将将此此溶溶液液微微微微加加温，使溶液完全澄清后放置。温，使溶液完全澄清后放置。一一细细辛辛醚醚重重结结晶晶时时，可可先先溶溶于于乙乙醇醇，再再滴滴加加适适量量水水，即即可析出很好的结晶。可析出很好的结晶。虎虎杖杖中中提提取取水水溶溶性性的的虎虎杖杖甙甙时时，在在已已精精制制饱饱和和的的水水溶溶液液上上添添加加一一层层乙乙醚醚放放置置，既既有有利利于于溶溶出出其其共共存存的的脂脂溶溶性性杂杂质质，又可降低水的极性，促使虎杖甙的结晶化。又可降低水的极性，促使虎杖甙的结晶
17、化。18(4)(4)结晶纯度的判定结晶纯度的判定结结晶晶的的纯纯度度可可由由化化合合物物的的晶晶形形、色色泽泽、熔熔点点和和熔熔距距、薄薄层层色谱或纸色谱等作初步鉴定。色谱或纸色谱等作初步鉴定。一一个个单单体体纯纯化化合合物物一一般般都都有有一一定定的的熔熔点点和和较较小小的的熔熔距距，同同时时在在薄薄层层色色谱谱或或纸纸色色谱谱中中经经数数种种不不同同展展开开剂剂系系统统检检定定，也也为一个斑点者，一般可以认为是一个单体化合物。为一个斑点者，一般可以认为是一个单体化合物。19 结晶纯度的判定结晶纯度的判定注注意意，有有的的化化合合物物在在一一般般层层析析条条件件下下，虽虽然然只只呈呈现现一一
18、个个斑斑点点，但但并并不不一一定定是是单单体体成成分分。例例如如鹿鹿含含草草中中主主成成分分为为高高熊熊果果甙甙、异异高高熊熊果果甙甙极极难难用用一一般般方方法法分分离离，经经反反复复结结晶晶后后，在在纸纸层层及及聚聚酞酞胺胺薄薄层层上上都都只只有有一一个个斑斑点点，易易误误认认为为单单一一成成分分，但但测测其其熔熔点点在在115125，熔熔距距很很长长。经经制制备备其其甲甲醚醚后后，再再经经纸纸层层层层析析检检定定，可可以以出出现现两两个个斑斑点点，异异高高熊熊果果甙甙的比移值大于高熊果甙。的比移值大于高熊果甙。HPLC是近年来可以用作判断有效成分纯度的一种重要手段。是近年来可以用作判断有效
19、成分纯度的一种重要手段。此外，此外，GC、UV光谱等，均有助于检识结晶样品的纯度。光谱等，均有助于检识结晶样品的纯度。20单晶的结构测定单晶的结构测定单晶单晶X X射线衍射射线衍射 单晶单晶X X射线射线分析分析是提供晶态下分是提供晶态下分子三维结构，确子三维结构，确定分子的立体结定分子的立体结构（构型、构象构（构型、构象等）的最有效方等）的最有效方法。法。212 2、改变混合溶剂的极性、改变混合溶剂的极性 在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。分物质沉淀析出，从而实现分离。在药材浓缩水提取液中加入数倍
20、量高浓度乙醇，以沉淀除在药材浓缩水提取液中加入数倍量高浓度乙醇，以沉淀除去多糖、蛋白质等水溶性杂质（水去多糖、蛋白质等水溶性杂质（水/醇法）；醇法）；在浓缩乙醇提取液中加入数倍两量水稀释，放置以沉淀除在浓缩乙醇提取液中加入数倍两量水稀释，放置以沉淀除去去 树脂、叶绿素等水不溶性杂质（醇树脂、叶绿素等水不溶性杂质（醇/水法）；水法）；在乙醇浓缩液中加数倍两乙醚（醇在乙醇浓缩液中加数倍两乙醚（醇/醚法）或丙酮（醇醚法）或丙酮（醇/丙丙酮法），可使皂苷沉淀析出，而脂溶性的树脂等类杂质则酮法），可使皂苷沉淀析出，而脂溶性的树脂等类杂质则留在母液中。留在母液中。223 3、加酸碱调节溶液的、加酸碱调节溶
21、液的pHpH值值 对酸性、碱性或两性有机化合物来说，常可通过加入酸、对酸性、碱性或两性有机化合物来说，常可通过加入酸、碱以调节溶液的碱以调节溶液的pHpH值，改变分子的存在状态（游离型或解值，改变分子的存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。离型），从而改变溶解度而实现分离。内酯类化合物不溶于水，但遇碱开环生成羧酸盐溶于水，内酯类化合物不溶于水，但遇碱开环生成羧酸盐溶于水，再加酸酸化，又重新形成内酯环从溶液中析出，从而与其再加酸酸化，又重新形成内酯环从溶液中析出，从而与其它杂质分离（碱它杂质分离（碱/酸法）；酸法）；生物碱一般不溶于水，遇酸生成生物碱盐而溶于水，再加生物碱一般不溶
22、于水，遇酸生成生物碱盐而溶于水，再加碱碱化，又重新生成游离生物碱（酸碱碱化，又重新生成游离生物碱（酸/碱法）。这些化合碱法）。这些化合物可以利用与水不相混溶的有机溶剂进行萃取分离。物可以利用与水不相混溶的有机溶剂进行萃取分离。可以分为强酸性、弱酸性和酚性三种，它们分别溶于碳酸可以分为强酸性、弱酸性和酚性三种，它们分别溶于碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化钠，借此可进行分离。氢钠、碳酸钠和氢氧化钠，借此可进行分离。234 4、沉淀法、沉淀法在中草药提取液中加入某些试剂使产生沉淀，以在中草药提取液中加入某些试剂使产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质的方法。获得有效成分或除去杂质的方法。铅盐沉淀法铅盐沉淀法 试
23、剂沉淀法试剂沉淀法 24 铅盐沉淀法铅盐沉淀法 铅盐沉淀法为分离某些中草药成分的经典方法之一。铅盐沉淀法为分离某些中草药成分的经典方法之一。醋酸铅及碱式醋酸铅，能与多种化学成分生成难溶的铅盐醋酸铅及碱式醋酸铅，能与多种化学成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。中性醋酸铅可与酸性物质或某些酚性物质结合成不溶性铅中性醋酸铅可与酸性物质或某些酚性物质结合成不溶性铅盐。因此，常用以沉淀有机酸、氨基酸、蛋白质、粘液质、盐。因此，常用以沉淀有机酸、氨基酸、蛋白质、粘液质、鞣质、树脂、酸性皂甙、部分黄酮等。鞣质、树脂、酸性皂甙、
24、部分黄酮等。与碱式醋酸铅产生不溶性铅盐或络合物的范围更广。与碱式醋酸铅产生不溶性铅盐或络合物的范围更广。25 试剂沉淀法试剂沉淀法在生物碱盐的溶液中，加入某些生物碱沉淀试剂（见生物在生物碱盐的溶液中，加入某些生物碱沉淀试剂（见生物碱性质下），则生物碱生成不溶性复盐而析出。水溶性生碱性质下），则生物碱生成不溶性复盐而析出。水溶性生物碱难以用萃取法提取分出，常加入雷氏铵盐使生成生物物碱难以用萃取法提取分出，常加入雷氏铵盐使生成生物碱雷氏盐沉淀析出碱雷氏盐沉淀析出用明胶、蛋白溶液沉淀鞣质；胆甾醇也常用以沉淀洋地黄用明胶、蛋白溶液沉淀鞣质；胆甾醇也常用以沉淀洋地黄皂甙等。皂甙等。265 5、盐析法、盐
25、析法 盐析法是在中草药的水提液中、加入无机盐至一定浓度，盐析法是在中草药的水提液中、加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质分离。析出，而与水溶性大的杂质分离。盐析用的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。盐析用的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。三七的水提取液中加硫酸镁至饱和状态，三七皂甙乙即可三七的水提取液中加硫酸镁至饱和状态，三七皂甙乙即可沉淀析出，自黄藤中提取掌叶防己碱，自三颗针中提取小沉淀析出，自黄藤中提取掌叶防己碱，自三颗针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠或硫酸铵盐
26、析制备。有些成分檗碱在生产上都是用氯化钠或硫酸铵盐析制备。有些成分如原白头翁素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在提取时，如原白头翁素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在提取时，亦往往先在水提取液中加入一定量的食盐，再用有机溶剂亦往往先在水提取液中加入一定量的食盐，再用有机溶剂萃取。萃取。27 根据物质在两相溶剂中的分配根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离比不同进行分离分配系数（分配系数（K K）两种相互不能任意混溶的溶剂（如氯仿两种相互不能任意混溶的溶剂（如氯仿与水）如置分液漏斗中充分振摇，放置后即可分成两相。与水）如置分液漏斗中充分振摇，放置后即可分成两相。此时如果其中含有溶质，则溶质在两相溶
27、剂中的分配比此时如果其中含有溶质，则溶质在两相溶剂中的分配比（K）在一定温度及压力下为一常数，可以下式表示：）在一定温度及压力下为一常数，可以下式表示：K=CU/CLK：分配系数；：分配系数；CU：溶质在上相溶剂中的浓度；：溶质在上相溶剂中的浓度；CL：溶质：溶质在下相溶剂中的浓度。在下相溶剂中的浓度。28 根据物质在两相溶剂中的分配根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离比不同进行分离1、液、液-液萃取法液萃取法2、逆流连续萃取法、逆流连续萃取法3、逆流分配法（、逆流分配法（CounterCurrent Distribution，CCD）4、液滴逆流色谱法（、液滴逆流色谱法（DCCC）5、高
28、速逆流色谱法（、高速逆流色谱法（HSCCC）6、气液分配色谱（、气液分配色谱（GC或或GLC）7、液、液-液分配色谱（液分配色谱（LC或或LLC）291 1、液、液-液萃取法液萃取法利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。分离的方法。萃取时如果各成分的分配系数相差越大，分离效率越高。萃取时如果各成分的分配系数相差越大，分离效率越高。水提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，水提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行两相萃取；有效成分是偏于亲水性的物
29、质，需如苯、氯仿或乙醚进行两相萃取；有效成分是偏于亲水性的物质，需用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。提取黄酮类成分多用乙酸乙脂和水的两相萃取。提取亲水性强的皂甙提取黄酮类成分多用乙酸乙脂和水的两相萃取。提取亲水性强的皂甙则多选用正丁醇、异戊醇和水作两相萃取。则多选用正丁醇、异戊醇和水作两相萃取。30液液-液萃取法操作注意事项液萃取法操作注意事项 先用小试管猛烈振摇约先用小试管猛烈振摇约1 1分钟，观察萃取后二液层分层分钟，观察萃取后二液层分层现象。如果容易产生乳化，大量提取时要避免猛烈振摇，现象。如果容易产生乳化，大量提取时要避免猛烈振摇，可延长萃
30、取时间。如碰到乳化现象，可将乳化层分出，再可延长萃取时间。如碰到乳化现象，可将乳化层分出，再用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤，或将乳化层稍稍加热；用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤，或将乳化层稍稍加热；或较长时间放置并不时旋转，令其自然分层。乳化现象较或较长时间放置并不时旋转，令其自然分层。乳化现象较严重时，可以采用二相溶剂逆流连续萃取装置。严重时，可以采用二相溶剂逆流连续萃取装置。水提取液的浓度最好在比重水提取液的浓度最好在比重1.11.11.21.2之间，过稀则溶剂之间，过稀则溶剂用量太大，影响操作。用量太大，影响操作。312 2、高速逆流色谱、高速逆流色谱 (High-speed Counterc
31、urrent Chromatography，HSCCC)大多数色谱法都需要有固相载体某种形式的选择性吸附作大多数色谱法都需要有固相载体某种形式的选择性吸附作用。在应用固相载体色谱分离中，往往会存在不同程度的用。在应用固相载体色谱分离中，往往会存在不同程度的不可逆吸附，造成被分离样品的损失，尤其在分离微量样不可逆吸附，造成被分离样品的损失，尤其在分离微量样品时受到限制。品时受到限制。高速逆流色谱，是近十年迅速发展起来的新型液高速逆流色谱，是近十年迅速发展起来的新型液液分配液分配色谱技术。与其它液相色谱分离方法相比它不使用固相色谱技术。与其它液相色谱分离方法相比它不使用固相载体作固定相，被分离物质
32、在互不相溶两相分配分离，克载体作固定相，被分离物质在互不相溶两相分配分离，克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等缺点。且花费溶剂少，分辨率高，可进行纯品制备。利用缺点。且花费溶剂少，分辨率高，可进行纯品制备。利用HSCCC，中草药粗提物的分离纯化制备可同步完成，被，中草药粗提物的分离纯化制备可同步完成，被分离物可定量回收。分离物可定量回收。32 HSCCC HSCCC的工作原理的工作原理两两种种互互不不相相溶溶的的溶溶剂剂在在聚聚四四氟氟乙乙烯烯管管内内作作高高速速行行星星运运转转，其其中中一一相相溶溶剂剂作作固固定定相相，用用恒
33、恒流流泵泵输输送送载载有有样样品品的的另另一一相相溶溶剂剂穿穿过过固固定定相相，两两相相溶溶剂剂在在螺螺旋旋管管中中实实现现高高效效的的接接触触、混混合合、分分配配和和传传递递。由由于于样样品品中中各各组组分分在在两两相相中中的的分分配配能能力力不不同同，导导致致在在聚聚四四氟氟乙乙烯烯管管中中移移动动的的速速度度也也不不同同，从从而而使使样品中各组分得到分离。样品中各组分得到分离。33 HSCCC的特点的特点1 1、应应用用范范围围广广，适适应应性性好好 由由于于溶溶剂剂系系统统的的组组成成与与配配比比可可以以是是无无限限多多，因因而而HSCCCHSCCC适适用用于于任任何何极极性性范范围围
34、的的品品的的分分离离，特特别别适适用用于于分分离离极极性性大大的的组组分分以以及及一一些些生生物物大大分子。分子。2 2、操操作作简简便便，容容易易掌掌握握 对对样样品品的的预预处处理理要要求求低低，一般的粗提物即可进行一般的粗提物即可进行HSCCC的制备分离或分析。的制备分离或分析。34 HSCCC的特点的特点3 3、回回收收率率高高 固固定定相相为为液液体体，无无需需固固体体作作载载体体，克克服服气气、液液相相色色谱谱使使用用固固相相载载体体带带来来的的样样品品吸吸附附、损损失失、污污染染、峰形拖尾等缺点。峰形拖尾等缺点。4 4、重重现现性性好好 分分离离过过程程稳稳定定、峰峰的的保保留留
35、相相对对标标准准偏偏差差小小于于2 2，35 HSCCC的特点的特点5 5、分分离离效效率率高高，分分离离量量较较大大 与与一一般般色色谱谱的的分分离离方方式式不不同同，能能实实现现梯梯度度操操作作和和反反相相操操作作、亦亦能能进进行行重重复复进进样样，特特别别适适用用于于制制备备性性分分离离，产产品品纯纯度度高高，制制备备量量大大，溶溶剂剂消耗少。消耗少。较较大大的的制制备备型型HSCCC，柱柱容容积积可可达达530ml，一一次次最最多多进进样样可可达达20g粗粗品品；较较小小的的分分析析型型的的HSCCC柱柱容容积积为为8mL，进进样样量量为为几几十十微微克克，最最大大转转速速可可达达40
36、00rmin.因因此此，被广泛地应用于植物化学成分的分离制备研究。被广泛地应用于植物化学成分的分离制备研究。36 HSCCC的特点的特点根根据据以以上上特特点点，HSCCC适适合合于于中中药药成成分分的的分分离离和和分分析析。目目前前高高速速逆逆流流色色谱谱仪仪已已成成功功地地开开发发出出分分析析型型和和制制备备型型两两大大系系列列。制制备备或或半半制制备备HSCCC的的特特点点是是高高流流速速、高高浓浓度度，不不但但适适用用于于非非极极性性化化合合物物的的分分离离，也也适适用用于于极极性性化化合合物物的的分分离离。在在制制备备分分离离方方面面，可可用用于于中中药药粗粗提提物物中中各各组组分分
37、的的分分离离，也也可可进进一一步步精精制制，甚甚至至直直接接从从从从粗粗提提物物步纯化到纯品，来步纯化到纯品，来制备中药化学成分标准品制备中药化学成分标准品。37 HSCCC的应用的应用HSCCC的分离效率与气相色谱和高效液相色谱等技术相比较，前者不适宜用它完成组成复杂的混合物的全谱分离分析。而其对于样品的预处理条件较放松及回收率高，制备量大，特别适用于特定部位和特定组分的分离纯化与制备。38 HSCCC HSCCC的应用的应用制备制备中药化学对照品中药化学对照品 中中草草药药化化学学对对照照品品应应具具有有高高度度均均匀匀性性，量量值值准准确确性性和和良良好好稳稳定定性性，其其纯纯度度要要求
38、求很很高高。制制备备型型HPLC曾曾是是国国外外常常用用的的主主要要手手段段。但但是是其其设设备备和和载载体体填填料料价价格格很很高高对对样样品品前前期期处处理理要要求求严严格格，存存在在不不可可逆逆吸吸附附，溶溶剂剂用用量量大大的的缺缺点点。因因此此致致力力于于HSCCC分分离离、统统化化、制制备备中草药有效成分对照品的研究和产业化，具有现实意义。中草药有效成分对照品的研究和产业化，具有现实意义。从从银银杏杏叶叶中中制制备备异异鼠鼠李李素素、山山奈奈酚酚、槲槲皮皮索索、白白果果内内酯酯和和橙橙皮皮甙甙；从从大大黄黄制制备备大大黄黄羟羟基基蒽蒽醌醌甙甙元元；从从洋洋地地黄黄叶叶中中制制备备洋洋
39、地地黄黄毒毒甙甙；从从虎杖中分离提纯白藜芦醇和白藜芦醇甙等。虎杖中分离提纯白藜芦醇和白藜芦醇甙等。393 3、高效液相色谱、高效液相色谱(HPLC)HPLC是在经典液相色谱基础上引入气相色谱的塔板理是在经典液相色谱基础上引入气相色谱的塔板理论，并采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度的检论，并采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度的检测器，具有分析速度快、分离效率高和操作自动化特点测器，具有分析速度快、分离效率高和操作自动化特点的一种色谱技术。的一种色谱技术。HPLC特别适合高沸点、大分子和热稳定性差的化合物特别适合高沸点、大分子和热稳定性差的化合物的分离分析。的分离分析。中药的成分非常复杂，
40、以往常用的薄层色中药的成分非常复杂，以往常用的薄层色谱等方法因其精密度、准确度、灵敏度、重现性差而不谱等方法因其精密度、准确度、灵敏度、重现性差而不能满足中药现代化发展的需要。高效液相色谱正是以其能满足中药现代化发展的需要。高效液相色谱正是以其稳定、可靠、高效的特点成为中药研究的最重要的分析稳定、可靠、高效的特点成为中药研究的最重要的分析方法。方法。常用于常用于中药质量的控制、天然药物化学成分的分中药质量的控制、天然药物化学成分的分离及分析测定等。离及分析测定等。403 3、高效液相色谱、高效液相色谱(HPLC)检测器是液相色谱的三大关键部件（高压输液泵、高效检测器是液相色谱的三大关键部件（高
41、压输液泵、高效色谱柱和检测器）之一。其发展在某种意义上决定着色谱柱和检测器）之一。其发展在某种意义上决定着HPLCHPLC技术的进步。理想的检测器应具有以下特点：技术的进步。理想的检测器应具有以下特点：灵敏度高；灵敏度高；对温度变化和流量波动不敏感；对温度变化和流量波动不敏感；死体积小，不使峰额外地扩展；死体积小，不使峰额外地扩展；对溶剂无响应，能用于梯度洗脱操作对溶剂无响应，能用于梯度洗脱操作 线性范围宽；线性范围宽；对所有样品都有响应；对所有样品都有响应；对样品无破坏性。对样品无破坏性。413 3、高效液相色谱、高效液相色谱(HPLC)检测器的种类繁多，至今还没有一种检测器可以同时满检测器
42、的种类繁多，至今还没有一种检测器可以同时满足以上几点要求。有紫外足以上几点要求。有紫外可见分光检测器、荧光检测可见分光检测器、荧光检测器、示差折光检测器、电化学检测器、二极管阵列检测器、示差折光检测器、电化学检测器、二极管阵列检测器、测定大分子绝对分子量的多角度激光光散射仪。另器、测定大分子绝对分子量的多角度激光光散射仪。另外还有蒸发光检测器、化学发光检测器、手性检测器外还有蒸发光检测器、化学发光检测器、手性检测器(旋旋光检测器、圆二色检测器光检测器、圆二色检测器)、分子量检测器、放射性检测、分子量检测器、放射性检测器、热学性质检测器、光电导检测器、磁旋光检测器等。器、热学性质检测器、光电导检
43、测器、磁旋光检测器等。42常用的常用的HPLC检测器检测器 紫外紫外-可见分光检测器可见分光检测器 示差折光检测器示差折光检测器 二极管阵列检测器二极管阵列检测器 蒸发光检测器蒸发光检测器43 紫外检测器（紫外检测器（UVD）优优点点 UVD结结构构简简单单，使使用用方方便便，售售价价便便宜宜、高高灵灵敏敏度度和和稳定性。稳定性。局局限限性性 UVD检检测测的的物物质质必必须须具具有有吸吸收收紫紫外外光光的的生生色色团团，而而相相应应的的流流动动相相在在检检测测波波长长下下则则应应当当是是无无紫紫外外吸吸收收的的。这这一一特性大大限制了其能检测的物质范围和一些良好溶剂的使用。特性大大限制了其能
44、检测的物质范围和一些良好溶剂的使用。许许多多成成分分没没有有紫紫外外吸吸收收或或为为紫紫外外末末端端吸吸收收，有有时时可可用用低低波波长长紫紫外外检检测测器器，但但梯梯度度洗洗脱脱时时出出现现基基线线漂漂移移，溶溶剂剂峰峰干干扰扰，溶溶剂选择受其截止波长限制。剂选择受其截止波长限制。44 示差折光检测器示差折光检测器(RID)RID是是一一种种通通用用的的检检测测器器，它它基基于于色色谱谱柱柱流流出出物物光光折折射射率的变化来连续测定样品浓度。率的变化来连续测定样品浓度。特特点点 稳稳定定、易易于于操操作作，样样品品不不被被破破坏坏和和具具有有较较好好的的灵灵敏度。敏度。缺缺点点 对对工工作作
45、环环境境要要求求很很苛苛刻刻，要要求求恒恒温温、恒恒流流速速，且且无法采用梯度洗脱其检测灵敏度也不够高。无法采用梯度洗脱其检测灵敏度也不够高。45 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器(DAD)原原理理 光光源源经经光光学学反反射射镜镜通通过过流流动动池池，再再经经分分光光系系统统、狭狭缝缝照照射射到到一一组组光光电电二二极极管管上上，由由数数据据收收集集系系统统实实时时记记录下组分的光谱吸收，得到三维的立体谱图。录下组分的光谱吸收，得到三维的立体谱图。用用一一组组光光电电二二极极管管同同时时检检测测透透过过样样品品的的所所有有波波长长紫紫外外光光，而而不不是是某某一一个个或或几几个个波波
46、长长，和和普普通通的的紫紫外外可可见见分分光光检检测测器器不不同同的的是是进进入入流流动动池池的的光光不不再再是是单单色色光光。它它具具有有以以下优点：下优点：可得任意波长的色谱图，极为方便；可得任意波长的色谱图，极为方便；可得任意时间的光谱图，相当于与紫外联用；可得任意时间的光谱图，相当于与紫外联用；提供组分的定性信息。提供组分的定性信息。46 蒸发光检测器（蒸发光检测器（ELSD）ESLDESLD是是质质量量型型、高高灵灵敏敏度度的的通通用用液液相相色色谱谱检检测测器器。它它检检测的三个主要过程：测的三个主要过程：雾雾化化 色色谱谱柱柱流流出出物物经经过过针针头头式式的的细细导导管管进进入
47、入雾雾化化器器，与气体混合喷成均匀一致的雾滴；与气体混合喷成均匀一致的雾滴；蒸蒸发发 雾雾滴滴经经过过加加热热的的漂漂移移管管，流流动动相相被被蒸蒸发发，溶溶质质形成极细的颗粒；形成极细的颗粒；检检测测 溶溶质质颗颗粒粒气气体体在在检检测测池池发发生生散散射射作作用用，经经光光电电倍增管成电信号输出。倍增管成电信号输出。47ESLDESLD的优点的优点 适适用用范范围围广广 原原则则上上对对所所有有的的化化合合物物都都能能测测定定，不不论论化合物是否存在生色团或电活性基团。化合物是否存在生色团或电活性基团。适用于梯度洗脱适用于梯度洗脱 流动相在样品检测前挥去；流动相在样品检测前挥去；高灵敏度高
48、灵敏度 与示差检测器与示差检测器(RI)RI)及低波长紫外检测相比。及低波长紫外检测相比。由由于于它它的的这这些些优优点点，它它有有可可能能像像气气相相色色谱谱中中的的氢氢火火焰焰检检测器测器(FID)那样成为液相色谱的高灵敏度通用检测器。那样成为液相色谱的高灵敏度通用检测器。48ESLD的应用的应用 没有紫外吸收或为紫外末端弱吸收的样品没有紫外吸收或为紫外末端弱吸收的样品ELSDELSD的的响响应应与与被被测测物物的的质质量量成成正正比比，而而不不依依赖赖于于被被测测物物的的光光学学特特性性及及官官能能团团。理理论论上上可可用用于于挥挥发发性性低低于于流流动动相相的的任任何何组组分分的的检检
49、测测。在在天天然然药药物物化化学学成成分分中中常常见见的的有有糖糖类类、皂皂甙甙类类（皂皂甙甙无无紫紫外外吸吸收收或或仅仅为为末末端端吸吸收收，使使得得皂皂甙甙测测定定在在应应用用HPLC-UV法法及及选选择择流流动动相相优优化化分分离离时时均均存存在在一一定定的的困困难难。ELSD检检测测则则较较好好地地解解决决了了这这个个问问题题。从从目目前前国国内内文文献献报报道道来来看看，ELSD的的应应用用亦亦以以分分析析这这类类成分及甾类等最多。成分及甾类等最多。流流动动相相有有紫紫外外吸吸收收干干扰扰或或梯梯度度洗洗脱脱时时基基线线漂漂移移影影响响测测定定的的情情况况 用用ELSD检检测测，流流
50、动动相相在在漂漂移移管管便气化蒸发，不影响样品检测。便气化蒸发，不影响样品检测。49高效液相色谱的应用高效液相色谱的应用中药化学成分分析中药化学成分分析成分分离制备成分分离制备 (1)特别适用于极性较大的成分特别适用于极性较大的成分(如皂苷类如皂苷类)分离；分离；(2)先以分析色谱摸索分离条件；先以分析色谱摸索分离条件；(3)样品一定要用流动相溶解，再以滤膜过滤。样品一定要用流动相溶解，再以滤膜过滤。50 根据物质的吸附性差别进行分离根据物质的吸附性差别进行分离在天然有机化合物分离及精制工作中，吸附现象利用得十分广泛。其在天然有机化合物分离及精制工作中，吸附现象利用得十分广泛。其中又以固中又以