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1、第十三章 基因工程与蛋白质工程一、基因工程的定义及主要内容一、基因工程的定义及主要内容二、重组二、重组DNADNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定分子引入宿主细胞和筛选鉴定三、克隆基因的表达三、克隆基因的表达四、基因工程的成就和展望四、基因工程的成就和展望五、蛋白质工程五、蛋白质工程一、基因工程定义及主要内容w基因工程也称基因重组技术、基因克隆或分基因工程也称基因重组技术、基因克隆或分子克隆子克隆w是指利用是指利用DNADNA重组技术生产或改造生物产品、重组技术生产或改造生物产品、创建或改良动植物品种以及开发特殊用途的创建或改良动植物品种以及开发特殊用途的微生物等微生物等w是生物工程的重要内容之一是
2、生物工程的重要内容之一返回w主要步骤：主要步骤：1.1.带有目的基因的带有目的基因的DNADNA片段的获得片段的获得2 2、构建、构建DNADNA重组分子重组分子3 3、重组、重组DNADNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定分子引入宿主细胞和筛选鉴定4 4、基因的表达、基因的表达一、基因工程定义及主要内容返回返回基基因因工工程程基基本本程程序序真核染色体真核染色体DNA克隆载体克隆载体（质粒）（质粒）限制酶切割限制酶切割限制酶切割并限制酶切割并分离所需片断分离所需片断重组载体重组载体细菌宿主细细菌宿主细胞的转化胞的转化细胞分离细胞分离培养增值培养增值构建DNA重组分子w工具酶工具酶w目的基因的制备目
3、的基因的制备w克隆载体克隆载体wDNADNA分子的体外重组分子的体外重组返回工具酶w限制性内切酶是基因工程中最主要的工具酶限制性内切酶是基因工程中最主要的工具酶wDNADNA连接酶（连接酶（DNA ligaseDNA ligase）、）、DNADNA聚合酶聚合酶（DNA polymeraseDNA polymerase）、末端转移酶）、末端转移酶（terminal transferaseterminal transferase）、逆转录酶）、逆转录酶（reverse transcriptasereverse transcriptase）、核酸酶）、核酸酶S1S1（nuclease S1nucl
4、ease S1）和核酸外切酶）和核酸外切酶（exonucleaseexonuclease）返回限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶w由由SmithSmith在在19701970年从流感噬血菌中发现年从流感噬血菌中发现w细菌体内有特异的限制修饰系统，这种修饰细菌体内有特异的限制修饰系统，这种修饰系统是通过特殊的修饰酶在细菌本身系统是通过特殊的修饰酶在细菌本身DNADNA的特的特异识别序列处进行甲基化修饰，从而与外源异识别序列处进行甲基化修饰，从而与外源DNADNA相区别。这样，限制性核酸内切酶就能去相区别。这样，限制性核酸内切酶就能去切割破坏外源切割破坏外源DNADNA，而对本身无影响。，而对本身无
5、影响。w目前已从原核生物中分离出目前已从原核生物中分离出400400500500多种限多种限制性核酸内切酶制性核酸内切酶限制性核酸内切酶w能识别能识别DNADNA特定核苷酸序列的核酸内切酶特定核苷酸序列的核酸内切酶分类分类:三类三类.命名命名:分布：主要来源于原核生物。分布：主要来源于原核生物。特特点点：特特异异性性，即即识识别别特特定定核核苷苷酸酸序序列列，切割特定切点。切割特定切点。结结果果：产产生生黏黏性性未未端端（碱碱基基互互补补配配对对）或或平平端。端。举举例例：大大肠肠杆杆菌菌的的一一种种限限制制酶酶能能识识别别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开。
6、之间切开。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶w限制性内切酶可识别限制性内切酶可识别4 4或或6 6个特异核苷酸序列个特异核苷酸序列w粘性末端：指限制性内切酶的切割部位不在粘性末端：指限制性内切酶的切割部位不在识别序列的中心轴，在断段产生一个短的单识别序列的中心轴，在断段产生一个短的单股突伸出来的不齐末端。股突伸出来的不齐末端。w钝性末端：指限制性内切酶的切割部位在识钝性末端：指限制性内切酶的切割部位在识别序列的中心轴处，即产生平齐末端。别序列的中心轴处，即产生平齐末端。返回限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶w同裂酶:来源不同,但有相同的识别序列.或称异源同工酶.w同切点酶:不仅识别序列相同,而且切
7、点也相同.w同尾酶:酶的识别序列不完全相同,但切出的粘性末端相同.几种限制性内切酶的作用位点几种限制性内切酶的作用位点返回几种限制性内切酶的作用位点几种限制性内切酶的作用位点返回目的基因的制备w目的基因就是所需要克隆的外源基因w制备方法：1、人工合成法2、逆转录法3、用限制性内切酶直接从染色体DNA中分离4、用PCR法扩增目的基因片段返回目的基因的制备：人工合成法w较小分子基因可用人工化学合成的方法获得较小分子基因可用人工化学合成的方法获得wDNADNA化学人工合成的方法已经自动化化学人工合成的方法已经自动化w人工合成目的基因的先决条件是基因的核苷人工合成目的基因的先决条件是基因的核苷酸序列是
8、已知的酸序列是已知的w缺点是：缺点是：1 1、不能合成太大的基因；、不能合成太大的基因；2 2、合成、合成基因时遗传密码的兼并现象会为选择密码带基因时遗传密码的兼并现象会为选择密码带来很大困难；来很大困难；3 3、费用较高、费用较高返回目的基因的制备：逆转录法w若所需基因较大，人工合成有困难，从组织若所需基因较大，人工合成有困难，从组织中分离提取也不容易，则可利用逆转录法合中分离提取也不容易，则可利用逆转录法合成。成。w该法是：以编码某特异多肽的该法是：以编码某特异多肽的mRNAmRNA为模板，为模板，在逆转录酶的作用下反转录成该多肽在逆转录酶的作用下反转录成该多肽mRNAmRNA的的互补互补
9、DNADNA（cDNAcDNA）；再以）；再以cDNAcDNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶聚合酶I I作用下，最终合成编码该多肽的双链作用下，最终合成编码该多肽的双链DNADNA（dsDNAdsDNA）。）。w可用于真核生物目的基因的获得可用于真核生物目的基因的获得返回目的基因的制备：逆转录法返回返回目的基因的制备：逆转录法w用逆转录法合成用逆转录法合成cDNAcDNA的主要问题是：的主要问题是：1 1、mRNAmRNA必需提得很纯必需提得很纯2 2、逆转录中常产生各种不完全的逆转录产物、逆转录中常产生各种不完全的逆转录产物.3 3、以单链、以单链cDNAcDNA为模板往往难以合成与
10、单链为模板往往难以合成与单链cDNAcDNA一样长的一样长的dsdscDNAcDNA，这与实验技术有关。，这与实验技术有关。返回用限制酶切法直接从染色体DNA中分离w此方法主要适用于制备原核基因此方法主要适用于制备原核基因w对于物理图谱已清楚的原核基因，可用限制酶把目对于物理图谱已清楚的原核基因，可用限制酶把目的基因切出来的基因切出来w鸟枪法是指把目的基因从已用限制酶降解的染色体鸟枪法是指把目的基因从已用限制酶降解的染色体片段群中分离纯化出的方法，即把包括目的基因在片段群中分离纯化出的方法，即把包括目的基因在内的全部内的全部DNADNA片段插入到载体片段插入到载体DNADNA（如（如pBR32
11、2pBR322）中，）中，转化大肠杆菌，做成基因文库。再用目的基因的转转化大肠杆菌，做成基因文库。再用目的基因的转录产物作探针，通过分子杂交，选择出含有所需基录产物作探针，通过分子杂交，选择出含有所需基因的因的DNADNA片段。片段。l基因文库的构建将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转转化化大大肠肠杆杆菌菌,便构成了该生物的基因文库。用限制酶切法直接从染色体DNA中分离w此方法的优点是获得的目的基因的组织结构此方法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因一样，也具有间隔顺序。与天然基因一样，也具有间隔顺序。w此方法的缺点是：由于含有插入顺序，原始此方法的缺点是：由于含
12、有插入顺序，原始转录本不能被原核细胞识别，并将插入顺序转录本不能被原核细胞识别，并将插入顺序切除，以形成成熟转录本，因此也得不到目切除，以形成成熟转录本，因此也得不到目的基因的产物多肽或蛋白质。的基因的产物多肽或蛋白质。返回用PCR方法扩增目的基因片段wPCRPCR是聚合酶链反应的缩写是聚合酶链反应的缩写w是一种在体外模拟天然是一种在体外模拟天然DNADNA复制过程的核酸扩复制过程的核酸扩增技术增技术w在有少量在有少量DNADNA模板、引物、四种模板、引物、四种dNTPdNTP、TaqDNATaqDNA聚合酶、合适的缓冲系统下，通过仪器控制聚合酶、合适的缓冲系统下，通过仪器控制DNADNA变性
13、、退火及延伸的温度与时间，来合成变性、退火及延伸的温度与时间，来合成新的新的DNADNA链，新合成的链，新合成的DNADNA链又可作为下一轮链又可作为下一轮循环的模板。理论上经循环的模板。理论上经n n次循环后，次循环后，DNADNA链可链可达达2 2n n返回用PCR方法扩增目的基因片段返回克隆载体w目的基因若无合适的载体协助，就很难进入受目的基因若无合适的载体协助，就很难进入受体细胞；体细胞；w为了保证目的基因能够繁殖，必需将它与载体为了保证目的基因能够繁殖，必需将它与载体连接连接w理想的载体理想的载体1 1、较小的、能进行复制的分子，具有高拷贝数、较小的、能进行复制的分子，具有高拷贝数.
14、2 2、具有较少的限制酶的切点，最好是单一切割、具有较少的限制酶的切点，最好是单一切割点，以便所要克隆的点，以便所要克隆的DNADNA片段能被插入载体片段能被插入载体.克隆载体w3 3、外源、外源DNADNA片段插入载体后，不得使载体的片段插入载体后，不得使载体的复制功能丧失复制功能丧失w4 4、具有某种明显的标志，例如抗药性标记，、具有某种明显的标志，例如抗药性标记，以便利用这些标志筛选阳性克隆以便利用这些标志筛选阳性克隆w5 5、携带外源、携带外源DNADNA的幅度较宽的幅度较宽w6 6、生物防护是安全的、生物防护是安全的克隆载体pBR322pBR322克隆载体w常用的克隆载体有：质粒、噬
15、菌体及病毒常用的克隆载体有：质粒、噬菌体及病毒w质粒是某些细菌中独立于染色体外的共价闭合环状质粒是某些细菌中独立于染色体外的共价闭合环状双链双链DNADNA。质粒具有复制能力，它的存在与否一般对。质粒具有复制能力，它的存在与否一般对细菌的生存没有决定性影响。细菌的生存没有决定性影响。w噬菌体是一种能感染大肠杆菌的病毒，其噬菌体是一种能感染大肠杆菌的病毒，其DNADNA中的中的1/31/3对噬菌体的生长并非绝对需要，因此可被外源性对噬菌体的生长并非绝对需要，因此可被外源性DNADNA所替代，同时它可在体外包装成病毒颗粒，高效所替代，同时它可在体外包装成病毒颗粒，高效感染大肠杆菌。克隆容量小于感染
16、大肠杆菌。克隆容量小于23kb23kb克隆载体w粘性质粒（粘性质粒（CosmidCosmid），是人工构建的、兼具），是人工构建的、兼具质粒与噬菌体双重特性的大容量载体。克隆质粒与噬菌体双重特性的大容量载体。克隆容量可达容量可达45kb45kb。w酵母人工染色体：酵母人工染色体：2020世纪世纪8080年代发展起来的年代发展起来的大片段外源基因克隆体系，其克隆容量可达大片段外源基因克隆体系，其克隆容量可达2001000kb2001000kb。返回DNA分子的体外重组w所谓重组所谓重组DNADNA分子就是把外源分子就是把外源DNADNA分子（目的分子（目的基因）插入到载体中，使两种基因）插入到载
17、体中，使两种DNADNA分子连接起分子连接起来来w体外体外DNADNA分子重组有两种方法：分子重组有两种方法：1 1、粘性末端连接法粘性末端连接法2 2、平头末端连接法平头末端连接法返回粘性末端连接法w用同一种或两种限制酶去消化载体和外源用同一种或两种限制酶去消化载体和外源DNADNA分子，分子，可产生相同的粘性末端，这些粘性末端能退火互补，可产生相同的粘性末端，这些粘性末端能退火互补，进一步用进一步用DNADNA连接酶将断端封口，即可获得重组连接酶将断端封口，即可获得重组DNADNA分子。分子。w用同一种限制酶处理外源用同一种限制酶处理外源DNADNA和载体，重组时可导致和载体，重组时可导致
18、外源外源DNADNA特别是质粒的自我环化特别是质粒的自我环化w用碱性磷酸脂酶（不处理外源用碱性磷酸脂酶（不处理外源DNADNA分子）处理粘性末分子）处理粘性末端的端的55磷酸基，能促使载体与外源磷酸基，能促使载体与外源DNADNA分子连接。分子连接。重组体每条链仍残留的一个缺口，待进入宿主细胞重组体每条链仍残留的一个缺口，待进入宿主细胞内可被修复内可被修复返回磷磷酸酸脂脂酶酶能能防防止止载载体体的的自自我我环环化化返回用用两两种种限限制制酶酶处处理理载载体体也也可可防防止止环环化化钝性末端连接法w用前述的化学合成法、逆转录法获得的用前述的化学合成法、逆转录法获得的DNADNA或或cDNAcDN
19、A片断，以及某些限制酶切生成的片断，以及某些限制酶切生成的DNADNA片断，片断，均为钝性末端，可用均为钝性末端，可用T4DNAT4DNA连接酶连接，也可连接酶连接，也可将其改造成粘性末端再行连接：将其改造成粘性末端再行连接：1 1、加接头：这种人工接头含某种限制酶的单切、加接头：这种人工接头含某种限制酶的单切点，用限制酶消化该接头可产生粘性末端。点，用限制酶消化该接头可产生粘性末端。2 2、加尾巴：应用末端转移酶在载体与外源、加尾巴：应用末端转移酶在载体与外源DNADNA分子上加上互补的同聚核苷酸，经过退火可分子上加上互补的同聚核苷酸，经过退火可使两者形成重组体使两者形成重组体返回钝性末端连
20、接法返回末端转移酶处理末端转移酶处理退火退火二、重组DNA引入宿主细胞和筛选鉴定w重组重组DNADNA引入宿主细胞引入宿主细胞1 1、转染：将噬菌体、转染：将噬菌体DNADNA引入宿主细胞的过程引入宿主细胞的过程2 2、转化：将质粒或染色体、转化：将质粒或染色体DNADNA引入宿主细胞的过程引入宿主细胞的过程转化是否成功取决:1)制备感受态细胞;2)重组DNA避免受体细胞核酸酶的降解.w重组体克隆的筛选与鉴定重组体克隆的筛选与鉴定1 1、插入灭活法插入灭活法2 2、噬菌斑形成筛选法、噬菌斑形成筛选法3 3、核酸杂交法、核酸杂交法返回插入灭活法w目前使用的质粒载体都有抗药标记。被转化目前使用的质
21、粒载体都有抗药标记。被转化的细菌在含有这种（些）抗生素的培养基中的细菌在含有这种（些）抗生素的培养基中能够生长，而未被转化的细菌则不能生长或能够生长，而未被转化的细菌则不能生长或被杀死。然而，当限制酶作用于载体被杀死。然而，当限制酶作用于载体DNADNA的某的某一抗药基因上并在此插入外源一抗药基因上并在此插入外源DNADNA时，载体上时，载体上原有的抗药基因即被破坏。由此重组体转化原有的抗药基因即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，则对这个抗生素敏感，这样便的宿主细胞，则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出转化菌株。可筛选出转化菌株。返回返回插插入入灭灭活活法法限制酶切限制酶切转化转化含四环素含四环
22、素TAT三、克隆基因的表达w外源基因在大肠杆菌体系中的表达外源基因在大肠杆菌体系中的表达w外源基因在真核细胞体系中的表达外源基因在真核细胞体系中的表达返回四、基因工程的成就与展望w在农业上的成就与意义在农业上的成就与意义w在工业方面的成就与意义在工业方面的成就与意义w在制药工业中的成就与意义在制药工业中的成就与意义w癌症的研究与治疗癌症的研究与治疗w遗传病的预防与治疗遗传病的预防与治疗“后后基基因因组组时时代代”将将是是“蛋蛋白白质质组组学学时时代代”，即即从从对对基基因因信信息息的的研研究究转转向向对对蛋蛋白白质质信信息息的的研研究究，包包括括研研究究蛋蛋白白质质结结构构、功功能能与与应应用
23、用及及蛋蛋白白质相互关系和作用。质相互关系和作用。蛋蛋白白质质工工程程就就是是在在对对蛋蛋白白质质的的化化学学、晶晶体体学学、动动力力学学等等结结构构与与功功能能认认识识的的基基础础上上，对对蛋蛋白白质质人工改造与合成，最终获得商业化的产品。人工改造与合成，最终获得商业化的产品。五.蛋白质工程蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1 1）从生物体中分离纯化目的蛋白；）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2 2）测定其氨基酸序列；）测定其氨基酸序列；（3 3）借借助助核核磁磁共共振振和和X X射射线线晶晶体体衍衍射射等
24、等手手段段，尽尽可可能能地地了了解解蛋蛋白质的二维重组和三维晶体结构白质的二维重组和三维晶体结构;n 蛋白质工程蛋白质工程（4 4）设设计计各各种种处处理理条条件件，了了解解蛋蛋白白质质的的结结构构变变化化，包包括括折折叠叠与与去折叠等对其活性与功能的影响；去折叠等对其活性与功能的影响；（5 5）设设计计编编码码该该蛋蛋白白的的基基因因改改造方案，如点突变；造方案，如点突变；（6 6）分分离离、纯纯化化新新蛋蛋白白，功功能能检测后投入实际使用。检测后投入实际使用。思考题1.目的基因获得的方法有哪些？2.基因工程包括哪些步骤？插入灭活法w目前使用的质粒载体都有抗药标记。被转化目前使用的质粒载体都有抗药标记。被转化的细菌在含有这种（些）抗生素的培养基中的细菌在含有这种（些）抗生素的培养基中能够生长，而未被转化的细菌则不能生长或能够生长，而未被转化的细菌则不能生长或被杀死。然而，当限制酶作用于载体被杀死。然而，当限制酶作用于载体DNADNA的某的某一抗药基因上并在此插入外源一抗药基因上并在此插入外源DNADNA时，载体上时，载体上原有的抗药基因即被破坏。由此重组体转化原有的抗药基因即被破坏。由此重组体转化的宿主细胞，则对这个抗生素敏感，这样便的宿主细胞，则对这个抗生素敏感，这样便可筛选出转化菌株。可筛选出转化菌株。返回