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1、第第16章章.示踪技术在植物病理学示踪技术在植物病理学研究中的应用研究中的应用中国农业大学中国农业大学齐孟文齐孟文第第16章章.示踪技术在植物病理学研究中的示踪技术在植物病理学研究中的应用应用1 1 病原微生物的标记病原微生物的标记 1.11.1直接法直接法 通通过过标标记记培培养养基基而而标标记记病病原原微微生生物物的的方方法法。将将适适合合的的放放射射性性核核素素或或其其标标记记化化合合物物,加加入入培培养养基基,然然后后接接种种病病原原微微生生物物,通通过过培培养养使使其其摄摄取取放放射射性性而而获获得得标标记记,该该法法仅仅限限于于非专性寄生微生物的标记。非专性寄生微生物的标记。q方法
2、要点方法要点1)1)培养基培养基 适合的普通培养基。适合的普通培养基。2)2)标标记记核核素素 常常用用1414C C、3232P P、3535S S，如如1414C-C-葡葡萄萄糖，糖，1414C-C-蔗糖，蔗糖，3232P-KHP-KH2 2POPO4 4。3)3)放射性活度放射性活度 MBq/mlMBq/ml的范围的范围 为为了了避避免免刮刮取取菌菌落落时时被被放放射射性性培培养养基基粘粘污可用双层培养法。污可用双层培养法。平板培养时，先在含放射性的培养平板培养时，先在含放射性的培养基上接种培养，待菌落铺满后，再在上基上接种培养，待菌落铺满后，再在上面铺上一层非放射性培养基，经过一段面铺
3、上一层非放射性培养基，经过一段时间，菌絲将透过上层培养基，这样获时间，菌絲将透过上层培养基，这样获得的标记菌落，可避免放射性培养基污得的标记菌落，可避免放射性培养基污染。染。1.2 1.2 间接法间接法 对专性寄生菌，如锈菌，白粉菌，病毒等应对专性寄生菌，如锈菌，白粉菌，病毒等应先标记寄主，通过寄生关系使病原微生物得到标先标记寄主，通过寄生关系使病原微生物得到标记。记。1 1）寄主植物）寄主植物 先标记后接种，用一般植物标记先标记后接种，用一般植物标记法进行标记，干组织应具有法进行标记，干组织应具有0.37 0.37 10104 4 3.7 3.7 10104 4 Bq/mlBq/ml。2 2
4、）寄主真菌）寄主真菌 如以真菌为食料的线虫体如以真菌为食料的线虫体,先培养先培养并并标标记记交交链链孢孢霉霉菌菌,取取得得标标记记的的孢孢霉霉菌菌后后,在在其其体体上上接种线虫体进行标记。接种线虫体进行标记。3 3）寄主细菌）寄主细菌 通过标记细菌使其专性寄生噬通过标记细菌使其专性寄生噬菌体得到标记。先标记细菌，菌体得到标记。先标记细菌，洗去放射性洗去放射性粘污，配成放射性菌液，然后接种噬菌斑，粘污，配成放射性菌液，然后接种噬菌斑，经培养止混浊悬浮液变清，表明细菌已几经培养止混浊悬浮液变清，表明细菌已几乎被吞食，用细菌过滤器过滤，可获得纯乎被吞食，用细菌过滤器过滤，可获得纯的标记噬菌体。的标记
5、噬菌体。1.31.3标记检测标记检测 制备的标记病原微生物可用于病原微生物与寄制备的标记病原微生物可用于病原微生物与寄主间相互关系、病害侵染规律、致病机理等方面主间相互关系、病害侵染规律、致病机理等方面研究。在应用前要洗净表面的放射性粘污和测定研究。在应用前要洗净表面的放射性粘污和测定其浓度或比活度。其浓度或比活度。1 1）洗涤）洗涤 一般采用徒手振荡，减压抽滤或离心洗一般采用徒手振荡，减压抽滤或离心洗涤法，洗至下洗液无明显放射性或接近本底为止。涤法，洗至下洗液无明显放射性或接近本底为止。2 2）测定）测定 3232P P标记的真菌，可用固型闪烁倍杯法测标记的真菌，可用固型闪烁倍杯法测量，量，
6、1414C-C-标记的真菌、线虫、细菌等病原生物，标记的真菌、线虫、细菌等病原生物，可取其悬浮液，用液闪测量，感病生物的患病部可取其悬浮液，用液闪测量，感病生物的患病部位，可用相应制样法制备样品并测量。位，可用相应制样法制备样品并测量。2 2 病害侵染途经的研究病害侵染途经的研究 探明病害的侵染途经可为制定防冶措施提供探明病害的侵染途经可为制定防冶措施提供依据。通过一定方法接种病菌后，定时对客体依据。通过一定方法接种病菌后，定时对客体进行空间取样检测或进行自显影，便可确定病进行空间取样检测或进行自显影，便可确定病菌的侵染途经、过程及规律。菌的侵染途经、过程及规律。2.1 2.1 土壤病害侵染途
7、经土壤病害侵染途经 土传病害，主要由真菌或线虫引起。进行研究土传病害，主要由真菌或线虫引起。进行研究时，病原微生物常用直接拌土壤法时，病原微生物常用直接拌土壤法,或制成菌液或制成菌液或孢子悬浮液浇灌植株周围土壤的方法引进或孢子悬浮液浇灌植株周围土壤的方法引进,使使其繁殖达到侵染的目的其繁殖达到侵染的目的,然后定期对植珠取样进然后定期对植珠取样进行放射测定或自显影行放射测定或自显影,判明示踪菌的侵染途经及判明示踪菌的侵染途经及其在寄主中的分布。其在寄主中的分布。2.2 2种子传播病害途经种子传播病害途经 种种子子传传播播的的病病害害也也为为数数不不少少,如如水水稻稻白白叶叶枯枯病病,小小麦麦黑黑
8、粉粉病病,棉棉花花炭炭疽疽病病。通通常常用用侵侵种种法法标标记记病病原原生生物物,检检测测病病原原菌菌由由种种子子侵侵入入幼幼苗苗及及其其过过程程,以以揭揭示示侵侵染染规规律律和和发发病病机机制制,开开花花期期侵侵染染的的病病菌菌,可可在在花花期期于于穗穗部部微微喷喷孢孢子子悬悬浮浮液方法接种液方法接种,接种后要套代保湿。接种后要套代保湿。2.3 2.3 虫媒病害侵染途经虫媒病害侵染途经 常常用用间间接接标标记记法法,即即先先标标记记病病原原植植物物,再再接接种种昆昆虫虫使使其其吸吸取取标标记记毒毒原原而而标标记记,然然后后将将其其接种于寄主接种于寄主,研究虫媒侵染过程。研究虫媒侵染过程。2.
9、4 4 其它病害侵染途经其它病害侵染途经 主主要要通通过过杂杂草草,空空气气与与雨雨水水等等途途经经的的传传播播。因因为为可可能能招招致致环环境境放放射射污污染染,使使用用受受到到限限制制,但但在在严严格格控控制制的的条条件件下下,一一些些研研究究可可能能提提供供有有价价值值的的信信息息。禹禹王王树树（19861986）在在稻稻株株接接种种1414C C白白叶叶枯枯细细菌菌，不不但但当当年年发发病病期期在在田田边边杂杂草草能能检检测测出出放放射射性性，而而且且次次年年1515种种杂杂草草也也能能检检出出，表表明明水水稻稻白白叶叶枯枯病病可可以以通过田边杂草传播病害。通过田边杂草传播病害。3 3
10、 植物病害检测与诊断植物病害检测与诊断 植物病害诊断与植物检疫工作中，放射植物病害诊断与植物检疫工作中，放射免疫分析以及后来发展起来的酶联吸附免免疫分析以及后来发展起来的酶联吸附免疫分析（疫分析（ELISAELISA）法）法,因较传统的血清检验因较传统的血清检验（琼脂糖平板）等方法要灵敏得多，可以（琼脂糖平板）等方法要灵敏得多，可以检测已感染带毒而尚无症状的植物、定量检测已感染带毒而尚无症状的植物、定量检测病原菌侵染的数量或产生的代谢毒素，检测病原菌侵染的数量或产生的代谢毒素，因此被作为病害初期诊断与预报及检疫的因此被作为病害初期诊断与预报及检疫的重要手段，用于作为进一步进行其它研究重要手段，
11、用于作为进一步进行其它研究的基础。的基础。3.1 1检测的一般程序检测的一般程序 1 1）试剂制备）试剂制备 培养病原菌培养病原菌 免疫免疫 标记标记 普通普通 杂交瘤杂交瘤 标记抗原标记抗原 多克隆抗体多克隆抗体 单克隆抗体单克隆抗体 （PcAbPcAb）(McAb)(McAb)标记标记 标记抗体标记抗体2)样品制备样品制备 植植物物试试样样经经匀匀浆浆或或液液氮氮冷冷冻冻研研磨磨用用缓缓冲冲液液提提取取，上清液用于测试。上清液用于测试。3)测试程序测试程序 测测定定可可采采用用基基于于饱饱和和竞竞争争结结合合的的放放射射免免疫疫（RIA)RIA)或免疫放射分析。或免疫放射分析。固相载体（聚
12、乙烯）固相载体（聚乙烯）包被抗体（包被液）包被抗体（包被液）拍干洗涤（洗涤液）拍干洗涤（洗涤液）封板（封闭液）封板（封闭液）加入样品或标准加入样品或标准+抗原抗原*（反应液）（反应液）温浴温浴 （T.tT.t）洗涤洗涤 （洗涤液）（洗涤液）测量测量B B，B/BB/B。=f(Ag):Ag=f=f(Ag):Ag=f-1-1 (B/B(B/B。)。3.23.2应用举例应用举例序号序号 检测对象检测对象 方法方法作者作者年代年代1水稻白叶枯病菌水稻白叶枯病菌 RIA RIA 董以德董以德198119812水稻矮缩病毒水稻矮缩病毒 IRMAIRMA金子渔金子渔198619863水稻细菌性条斑病水稻细菌
13、性条斑病 125125I-AI-A蛋白蛋白 王公金王公金199019904小麦花叶病毒小麦花叶病毒 ELISAELISA刘常宏刘常宏199519955棉铃虫核多角体病毒棉铃虫核多角体病毒 ELISAELISA陆字融陆字融199519956香蕉束顶病毒香蕉束顶病毒 ELISAELISA范国成范国成199919997玉米种子携带的玉米种子携带的MDMV MDMV ELISA ELISA 马占鸿马占鸿199719978葡萄扇叶病毒葡萄扇叶病毒 ELISAELISA 谷洪包谷洪包19941994 4 4病理学研究的相关技术病理学研究的相关技术 阐明病源微生物与寄主之间致病与抗病这一对阐明病源微生物与寄
14、主之间致病与抗病这一对矛盾的相互作用机理，对于充分利用抗病资源，克矛盾的相互作用机理，对于充分利用抗病资源，克服植物病害具有重要意义。在分子水平上，病原微服植物病害具有重要意义。在分子水平上，病原微生物在侵染寄主时，首先会释放某种称为激发子的生物在侵染寄主时，首先会释放某种称为激发子的信号物质，通过与寄主细胞表面受体作用，启动相信号物质，通过与寄主细胞表面受体作用，启动相应的基因开关，使其表达并产生一系列次级代谢物，应的基因开关，使其表达并产生一系列次级代谢物，以决定寄主对侵染的反应，致病微生物可以避开寄以决定寄主对侵染的反应，致病微生物可以避开寄主的防卫系统，而使其染病，产生诸如如下破坏：主
15、的防卫系统，而使其染病，产生诸如如下破坏：真菌产生破坏寄主细胞的酶类（如角质酶，果胶酶，真菌产生破坏寄主细胞的酶类（如角质酶，果胶酶，纤维素酶，磷酸酶，蛋白酶等），纤维素酶，磷酸酶，蛋白酶等），使寄主组织软腐坏死，利用寄主的蛋白和核使寄主组织软腐坏死，利用寄主的蛋白和核酸合成系统进行自身繁殖，多数病毒属于酸合成系统进行自身繁殖，多数病毒属于此类；分泌毒素破坏寄主正常代谢；分泌此类；分泌毒素破坏寄主正常代谢；分泌阻塞寄主导管的物质，致使其枯萎；产生阻塞寄主导管的物质，致使其枯萎；产生植物激素，破坏寄主的激素平衡。而植物植物激素，破坏寄主的激素平衡。而植物的诱导抗病性则是由植物抗病基因与病原的诱导
16、抗病性则是由植物抗病基因与病原无毒基因相互识别后，诱导的防卫反应决无毒基因相互识别后，诱导的防卫反应决定的。寄主可以通过多种方式抵御病原侵定的。寄主可以通过多种方式抵御病原侵染，如加固细胞进行屏蔽，合成植保素，染，如加固细胞进行屏蔽，合成植保素，诱导各种病程相关蛋白等诱导各种病程相关蛋白等 。在植物各个病理反应阶段的研究，可以在植物各个病理反应阶段的研究，可以使用的示踪相关技术如下：使用的示踪相关技术如下：4.14.1显微免疫定位显微免疫定位 利用放射性显影或荧光显像技术，对病利用放射性显影或荧光显像技术，对病源微生物或其激发子等配体的特异受体进源微生物或其激发子等配体的特异受体进行组织、细胞
17、或分子水平的定位。方法是行组织、细胞或分子水平的定位。方法是对配体进行放射性或荧光标记，经体内引对配体进行放射性或荧光标记，经体内引入或体外组织或细胞孵育，利用显影技术，入或体外组织或细胞孵育，利用显影技术，显示受体类型及分布情况，也可以利用免显示受体类型及分布情况，也可以利用免疫化学方法显示，即非标记配体疫化学方法显示，即非标记配体-受体作用受体作用后，利用标记抗配体抗体进行显示。后，利用标记抗配体抗体进行显示。标记配体（放射性，荧光）标记配体（放射性，荧光）体内（引入）体内（引入）器官、组织显像器官、组织显像 体外体外 组织孵育组织孵育 显微显微 单细胞孵育单细胞孵育 显微、电镜显微、电镜
18、参考文献参考文献1)常常青青，用用配配体体结结合合放放射射性性自自显显影影定定位位分分析析过过敏敏性性哮哮喘喘豚豚鼠鼠肺肺M胆胆碱碱能能受受体体的的变变化化,中中国国病病理理生生理理杂杂志志，1995，11（1）：）：11142)曾曾伸伸奎奎,棉棉花花凝凝集集素素对对枯枯萎萎病病的的抑抑制制作作用用与与受受体体的的研研究究，四川大学学报四川大学学报,1995，32（3）：）：3283413)楼楼定定安安，用用非非放放射射性性标标记记法法研研究究低低密密度度脂脂蛋蛋白白受受体体，科科技通报，技通报，1994.10（3）：）：1311414）李李前前伟伟，肿肿瘤瘤VIPVIP受受体体显显影影的的实
19、实验验研研究究 ,核核技技术术 19981998，2121（1111）：）：6416446416444 4.2.2配体配体受体结合分析受体结合分析原理：原理：相互识别在植物与病原物相互作用中具有重要相互识别在植物与病原物相互作用中具有重要意义。识别中的信号交流及次级反应的启动与受体意义。识别中的信号交流及次级反应的启动与受体的亲合力密切相关，现已鉴定了许多病原物的激发的亲合力密切相关，现已鉴定了许多病原物的激发子，大体分为寡糖，糖肽，糖蛋白，多肽子，大体分为寡糖，糖肽，糖蛋白，多肽 和蛋白和蛋白五大类。研究病原激发子的受体五大类。研究病原激发子的受体,对于了解致病过对于了解致病过程或植物的抗性
20、机制程或植物的抗性机制 ，以及搞清寄主抗病基因编，以及搞清寄主抗病基因编码的产物是否是病原菌无毒基因编码产物的专化受码的产物是否是病原菌无毒基因编码产物的专化受体等重要研究领域具有重要意义。受体的亲合力和体等重要研究领域具有重要意义。受体的亲合力和数目，由定量受体数目，由定量受体ReRe0 0与一系列不同稀释浓度的与一系列不同稀释浓度的标记配体反应，相关数据标记配体反应，相关数据stcatchardstcatchard作图解析确定。作图解析确定。即：即：则则因此，因此，作图，斜率为作图，斜率为K(l/mol),XK(l/mol),X截距截距(B/F (B/F 0),B=0),B=ReRe 0
21、0。当受体有不同亲和力的位点时，当受体有不同亲和力的位点时，Stcachard Stcachard 作图不作图不是直线，可通过最小二乘法或剥谱法求得各相应位点的亲是直线，可通过最小二乘法或剥谱法求得各相应位点的亲和力常数。和力常数。操作程序操作程序 制备受体材料（组织、单细胞液）制备受体材料（组织、单细胞液）配基配基 孵育孵育 分离分离B B 与与F F 测定测定 作作StcatchardStcatchard图图(B/F(B/FB)B)参考文献参考文献1)张张 良良,放放射射性性配配基基结结合合分分析析对对不不同同细细胞胞uPAR表表达达的的比比较较研究研究,上海第二医科大学学报上海第二医科大
22、学学报,2000，20（2)：1021042)崔崔毓毓桂桂 ,红红细细胞胞胰胰岛岛素素受受体体分分析析法法的的改改良良及及其其初初步步应应用用,，标记免役分析与临床标记免役分析与临床,1996，3（4）：）：1851883)王王雨雨田田,消消化化系系肿肿瘤瘤细细胞胞EGF受受体体放放射射分分析析 与与 EGF的的生生长调节研究长调节研究,第四军医大学学报第四军医大学学报,1996,17（5）：）：3363394)匡匡安安仁仁,125I-G018 动动物物体体内内受受体体结结合合研研究究,华华西西医医大大学学报，报，1994，25（2）：131133 4.3mRNA4.3mRNA差示显示技术差示
23、显示技术 病原微生物侵染寄主病原微生物侵染寄主,将启动寄主基因选择性将启动寄主基因选择性表达表达,利用利用mRNAmRNA差示显示技术，可以鉴别出与对照差示显示技术，可以鉴别出与对照表达有差异的基因，进而在分子水平上研究植物致表达有差异的基因，进而在分子水平上研究植物致病的病理或生理变化过程。病的病理或生理变化过程。mRNAmRNA差示显示原理如下：差示显示原理如下：所有所有mRNAmRNA的的3 3端都有一个端都有一个PolyPoly（A A）尾，因此，利）尾，因此，利用用 3 3端端 引物引物 T T1212MNMN，即在，即在OligodTOligodT后接后接2 2个选择个选择碱基，碱
24、基，M M可能为（可能为（G G、C C 或或T T）三种，）三种，N N可以为（可以为（G G、或）四种，共十二种组合，每种覆盖、或）四种，共十二种组合，每种覆盖1/12mRNA,1/12mRNA,通过反转录将把通过反转录将把mRANmRAN群体反转录为群体反转录为个个别的个个别的c c亚群。然后用一个亚群。然后用一个 5 5端任意引端任意引物对每个物对每个c c亚群进行扩增亚群进行扩增。在扩增时，可以掺入在扩增时，可以掺入S S标标d d或或d d或其它标记，经测序胶电泳或其它标记，经测序胶电泳(分辨分辨500bp)500bp)，对，对 光片暴光，可以鉴别出对比材料中有光片暴光，可以鉴别出
25、对比材料中有差异的差异的DNADNA片段，将其从胶上切下，再扩增片段，将其从胶上切下，再扩增进行克隆分析，就能从进行克隆分析，就能从c c文库或基组文库或基组DNADNA文库筛选到全长文库筛选到全长c c或基因克隆或基因克隆.。该方法较传统差异法有巨大的优势该方法较传统差异法有巨大的优势,但要使但要使1500015000种种m m均可扩增，考虑测序胶能均可扩增，考虑测序胶能显示显示5050多个带，则需至少多个带，则需至少2020个引物，进行个引物，进行12201220次组合次组合PCRPCR，工作量很大，通过对，工作量很大，通过对.简并和提高测序胶的容量简并和提高测序胶的容量 ,该法已该法已有
26、实用的试剂盒。有实用的试剂盒。对照组织/细胞 处理组织/细胞 总RNA(少量）总RNA(少量）Oligo dT12MN cDNA cDNA PCR扩增 5端随机引物，35S PCR产物 PCR产物 变性测序胶 电泳 对照 处理 取下差异带 再次PCR 制备探针 Sorthern,检索 cDNA文库，基因 4.4 4.4 病理代谢研究病理代谢研究 试验证实，植株感病部位代谢活动较正常部位试验证实，植株感病部位代谢活动较正常部位更为活跃更为活跃,通过离体培养并饲喂放射性核素或标通过离体培养并饲喂放射性核素或标记前体记前体,检查其惨入代谢物的过程检查其惨入代谢物的过程,可进行病理代可进行病理代谢研究
27、。谢研究。Darokher(1983)Darokher(1983)将患病将患病TMVTMV烟草叶片下烟草叶片下表皮表皮,在含在含3.7MBq/ml 3.7MBq/ml 3 3H-H-尿苷中温育尿苷中温育3h 3h，下，下表皮经磨碎、抽提、表皮经磨碎、抽提、过滤、离心等纯化过滤、离心等纯化,发现患发现患TMVTMV叶片有叶片有3 3H H标记核蛋白标记核蛋白,其浮力密度为其浮力密度为1.231.231.45g/cm1.45g/cm3 3,放射性出现一至数个峰值放射性出现一至数个峰值,这说明这说明TMVTMV专专 化性核蛋白很高，推断化性核蛋白很高，推断TMVTMV作用在寄主的作用在寄主的核蛋白上
28、核蛋白上。5.5.分子标记在植病研究的应用分子标记在植病研究的应用5.15.1分子标记类型分子标记类型 分子标记是以分子标记是以DNADNA多态性为基础，以相应的多态性为基础，以相应的DNADNA顺序片段为测度的遗传标记顺序片段为测度的遗传标记,是继形态标记、胞是继形态标记、胞标记和生化标记后的一种新的标记标记和生化标记后的一种新的标记,是联系遗传是联系遗传图谱和和物理图谱的桥梁，也是继分子杂交，图谱和和物理图谱的桥梁，也是继分子杂交，PCRPCR之后迅速兴起并广泛应用的重要生物学实验之后迅速兴起并广泛应用的重要生物学实验技术。技术。生物多样性生物多样性 DNADNA多态性多态性 顺序片段顺序
29、片段 分子特征图谱。分子特征图谱。根据测度的不同根据测度的不同 ，分子标记主要有：，分子标记主要有：1 1）RFLP RFLP(Restriction(Restriction fragment fragment length length Polymorphism Polymorphism DND DND marker,marker,限限制制性性片片段段长长度度多多态态性性)，该该法法先先用用限限制制性性内内切切酶酶消消化化基基因因组组DNA DNA,经经琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离后后，转转移移到到支支持持膜膜上上，再再用用探探针针（放放射射性性或或非非放放射射性性）进进行行杂杂交交
30、，通通过过显显示示相相应应的的酶酶切切片片段段，来来表表征征不不同同遗遗传传位位点点变变异异（多多态态性性）的的方方法法。其其具具有有高高度度多多态态，高高密密度度标标记记，标标记记共共显显性性，无无表表型型效效应应等等特特点点，适适应应构构建建 遗遗 传传 标标 记记 图图 谱谱 和和 QTL QTL（数数 量量 基基 用用 座座 Quantitative Quantitative Trait Trait loci loci）定定位位。该该法法需需一一套套一一定定数数目目的的组组合合探探针针（可可由由相相应应基基因因文文库库cDNAcDNA获获得得）才才能能覆覆盖盖整整个个基基因因组组DNA
31、DNA，并并达达到到一一定定标标记记密密度度。方方法法操操作作程程序序相相对对复复杂杂，且且耗耗时时耗耗钱钱，但但结果可靠结果可靠，准确。准确。RFLP过程：A1 A2A1 A2 A1 A2 A1 A22 2）RAPD RAPD(Random(Random amplified amplified polymorphism polymorphism DNA DNA 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA)DNA)RAPDRAPD是是在在PCRPCR技技术术基基础础上上发发展展起起来来的的DNADNA分分子子多多态态性性检检测测方方法法。基基本本方方法法是是以以基基因因组组DNADNA为为模模板板，使
32、使用用一一套套随随机机核核苷苷序序列列（通通常常1010个个碱碱基基)单单引引物物,通通过过PCRPCR扩扩增增产产生生出出的的不不连连续续DNADNA片片段段,用用以以检检测测DNADNA的的多多态态性性。RAPDRAPD分分析析步步骤骤简简单单,DNA,DNA用用量量少少,不不需需要要事事先先知知道道基基因因组组的的任任何何序序列列信信息息,一一套套引引物物可可用用于于不不同同生生物物的的基基因因组组,快快速速进进行行多多态态性性的的检检测测,常常可可用用于于标标准准DNADNA指指纹纹图图谱谱构构建建,用用以以分分类类研研究或种质鉴定研究。究或种质鉴定研究。3）AFLPAFLP（ampl
33、ification fragment length amplification fragment length polymorphism polymorphism 扩增片段长度多态性）扩增片段长度多态性）该方法的基本原理是对基因组该方法的基本原理是对基因组DNADNA的限制性的限制性内切酶的酶切片段进行选择性扩增。限制性内切内切酶的酶切片段进行选择性扩增。限制性内切片段与互补粘性末端双链通用人工接头连接，连片段与互补粘性末端双链通用人工接头连接，连接后的粘性末端顺序作为以后接后的粘性末端顺序作为以后PCRPCR引物的结合位引物的结合位点点,实践中根据需要在引物实践中根据需要在引物33端可分别加
34、入端可分别加入1 13 3个选择性核苷，以达到选择性扩增的目的。通过个选择性核苷，以达到选择性扩增的目的。通过标记引入物，标记引入物，自显影仅显视选择扩增的片段。自显影仅显视选择扩增的片段。AFLP AFLP 结合了结合了RAPDRAPD和和RFLP RFLP 的优点，具有的优点，具有RFLPRFLP技术技术的可靠和的可靠和PCRPCR技术的高效性，可在一个反应内检技术的高效性，可在一个反应内检测大量的限制片段，一次可获得测大量的限制片段，一次可获得5050100100条谱带。条谱带。AFLPAFLP对对DNADNA的纯度和内切酶质要求较高。的纯度和内切酶质要求较高。4 4）SSR SSR（m
35、icro micro satellite satellite 微微卫卫星星）指指分分散散在在真真核核生生物物基基因因组组序序列列中中的的2-42-4个个碱碱基基组组成成的的简简单单重重复复序序列列，如如（GAGA）n n（GAAGAA）n n等等。个个体体间间简简单单重重复复序序列列数数目目的的变变化化产产生生的的多多态态性性，比比RFLPRFLP多多态态性性高高得得多多，被被认认为为是是继继RFLPRFLP的的第第二二代代分分子子标标记记，其其不不足足是是必必须须针针对对每每个个染染色色体体上上的的微微卫卫星星，发发现现其其两两端端的的单单拷拷贝贝序序列列，据据此此设设计计引引物物，这这给给
36、SSRSSR标标记记带来方便，尚需进行进一步研究。带来方便，尚需进行进一步研究。5.2 2 分子标记的分子标记的 应用应用 1 1）分子标记遗传连锁图谱的构建）分子标记遗传连锁图谱的构建 分分子子标标记记图图谱谱是是基基因因定定位位的的基基础础，标标记记密密度度达达到到0.1cm 0.1cm 时时，可可直直接接对对基基因因定定位位。图图谱谱构构建建以以同同源源染染色色体体基基因因交交换换重重组组为为测测度度，交交换换重重组组率率与与基基因因间间距距离离成成正正比比，图图谱谱单单位位距距离离厘厘摩摩（CMCM）大大致致相当于相当于1%1%重组率。重组率。作图步骤：作图步骤：建立作图群体建立作图群
37、体 要要绘绘制制分分子子的的遗遗传传连连续续图图谱谱,首首先先需需建建立立多多等等位位基基因因分分布布广广泛泛分分离离的的群群体体,且且群群体体样样本本数数符符合统计要求合统计要求,常用群体见图。常用群体见图。RFLP RFLP 分析分析 对对亲亲本本和和作作图图群群体体进进行行RFLPRFLP分分析析。先先选选择择对对亲亲本本表表现现多多态态性性的的酶酶与与探探针针组组合合（6 6种种酶酶，100100 200200个个探探针针），然然后后对对亲亲本本和和作作图图群群体体进进行行RFLPRFLP分分析析，根根据据自自显显影影谱谱带带，分分离离群群体体与与母母本本的的代代型型相相同同记记为为A
38、 A，与与父父本本相相同同记记为为B B，杂杂合合子子记记为为C C，缺失或模记为，缺失或模记为。图谱构建图谱构建 Mapmarer/exp.3.0b Mapmarer/exp.3.0b 几种作图群体的特点几种作图群体的特点特点特点F2BC1BILDHRILNIL形成形成F F1 1自交自交 个体个体F F1 1回交回交 后代后代F F2 2自回自回交交 后代后代F F1 1花培花培 F F1 1自交自交 后代后代F F1 1回交自回交自交后代交后代准确度准确度 低低高高高最高需群体需群体 大大小小小小永久群永久群体体 否否否是是是费用低低高中中高时间短短长短长长 2)QTL2)QTL定位定位
39、 数数量量遗遗传传性性状状基基因因座座位位的的定定位位。因因数数量量遗遗传传效效应应变变化化是是连连续续的的，常常迭迭加加有有环环境境效效应应，因因此此一一般般用用统统计计方方法法，通通过过检检验验某某一一标标记记基基因因型型效效应应的的差差异异是是否否显显及及其其贡贡献献来来确确定定QTL，最最常常用用的的定定位位方方法法有有方方差差分分析析法，（法，（analysis of variance）,区间作图法。区间作图法。3)3)种质资源种质资源RAPDRAPD指纹库指纹库 指指纹纹作作为为研研究究材材料料的的特特征征，可可用用于于种种质质鉴鉴定定和和分分类类。指指纹纹库库是是所所有有研研究究
40、个个体体特特异异分分子子标标记记带带的的集集合合，一一般般由由一一套套引引物物构构建建，多多态态性性带带构构成成一一个个N N维维空空间间R Rn n引引1 1，引引2 2，某某个个体体在在某某一一位位置置有有带带为为1 1，无无带带为为零零，其其在在空空间间有有确确定定的的位位置置，对对空空间间进进行行聚类可进行分类。聚类可进行分类。4 4）质量性状标记的定位）质量性状标记的定位 选择有差异的材料进行对比分析，可选择有差异的材料进行对比分析，可以用近等基因池的原理，把大匹材料按某以用近等基因池的原理，把大匹材料按某一性状有无分为二类，各类基因相混合，一性状有无分为二类，各类基因相混合，进行进行RAPDRAPD多态性分析找出特异性条带。多态性分析找出特异性条带。