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1、韩韩 雪雪 蕾蕾哺乳动物胚胎干细胞技术哺乳动物胚胎干细胞技术主要内容主要内容一、胚胎干一、胚胎干细细胞的生物学特点胞的生物学特点二、胚胎干二、胚胎干细细胞研究的意胞研究的意义义三、胚胎干三、胚胎干细细胞研究的胞研究的历历史与史与进进展展四四.胚胎干胚胎干细细胞的分离培养基本程序胞的分离培养基本程序五五.ES细细胞的保存胞的保存六六.ES细细胞的胞的鉴鉴定定七七.ES细细胞技胞技术术目前存在的目前存在的问题问题八八.ES细细胞技胞技术术的的发发展方向展方向干细胞功功 能能 组织发生组织发生 全能干细胞全能干细胞 多能干细胞多能干细胞 专能干细胞专能干细胞 胚胎干细胞胚胎干细胞 组织干细胞组织干细
2、胞 干细胞分类干细胞分类 全能干细胞Totipotent stem cells 具有无限分化潜能的细胞。可以分化成人体的各具有无限分化潜能的细胞。可以分化成人体的各种细胞，这些细胞构成人体的各种组织器官，如种细胞，这些细胞构成人体的各种组织器官，如胚胎胚胎干细胞干细胞。八细胞阶段八细胞阶段八细胞阶段八细胞阶段多能干细胞Multipotent stem cells 具有可分化出一种器官的多种组织潜能的干细胞，具有可分化出一种器官的多种组织潜能的干细胞，即能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。具有自即能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。具有自我增殖和分化两种功能。我增殖和分化两种功能。骨髓造
3、血干细胞骨髓造血干细胞就是典型的多能干细胞，移植造血就是典型的多能干细胞，移植造血干细胞治疗白血病、再生障碍性贫血等血液疾病。干细胞治疗白血病、再生障碍性贫血等血液疾病。专能干细胞 多能干细胞进一步分化成专能干细胞，只能分化多能干细胞进一步分化成专能干细胞，只能分化成某一类型的细胞。又称单能干细胞。成某一类型的细胞。又称单能干细胞。如如表皮干细胞表皮干细胞只能分化产生角化表皮细胞。只能分化产生角化表皮细胞。胚胎性干细胞Embryonic stem(ES)Cells 来自早期胚胎、原始生殖细胞或畸胎瘤组织等源于来自早期胚胎、原始生殖细胞或畸胎瘤组织等源于胚胎的干细胞，其基本特性是具有稳定地在体外
4、自我更胚胎的干细胞，其基本特性是具有稳定地在体外自我更新、并稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能分新、并稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能分化为属于外胚层、中胚层和内胚层范畴的各种类型分化化为属于外胚层、中胚层和内胚层范畴的各种类型分化细胞，甚至参与个体发育，又称为万能细胞细胞，甚至参与个体发育，又称为万能细胞(Multipotent stem cells)。组织干细胞 Tissue-specific stem cell 指分布在成年生物体组织中负有构建和补充某种指分布在成年生物体组织中负有构建和补充某种组织细胞功能的干细胞。又称为成体干细胞组织细胞功能的干细胞。又称为成体干细胞(A
5、dult stem cells)。一、胚胎干一、胚胎干细胞的生物学特点胞的生物学特点1.定定义义哺乳哺乳动动物胚胎干物胚胎干细细胞（胞（Embryo Derived Stem Cells）又称）又称ES或或EK细细胞胞，是从早期胚，是从早期胚胎或胎儿中分离出来的具有胎或胎儿中分离出来的具有发发育全能性的育全能性的细细胞系。一方面具有自我更新能力，另一方面胞系。一方面具有自我更新能力，另一方面具有分化潜能。具有分化潜能。2.来源：来源：囊胚的内囊胚的内细细胞胞团团（ICM）早期胚胎的种早期胚胎的种细细胞或胎儿的原始生殖胞或胎儿的原始生殖细细胞。胞。ICM在胚胎着床前：分化出原始内胚在胚胎着床前：
6、分化出原始内胚层层，紧贴紧贴着囊胚着囊胚腔的内腔的内层层生生长长，最后，最后发发育育为为卵黄膜；卵黄膜；ICM在胚胎着床后：分化在胚胎着床后：分化为为原始外胚原始外胚层层，进进一步分化一步分化为为胚胎的胚胎的3个种个种细细胞胞层层，进进一步一步发发育育为为胎儿。胎儿。内消呼肝胰内消呼肝胰（内胚（内胚层发层发育育为为消化系消化系统统，呼吸系，呼吸系统统，肝，肝脏脏，胰，胰脏脏）外表感神仙外表感神仙（外胚（外胚层发层发育育为为表皮，感表皮，感觉觉，神，神经经系）系）其余的是中胚其余的是中胚层层3.细细胞学特点胞学特点具有胚胎具有胚胎细细胞的特性：形胞的特性：形态态上上细细胞体胞体积较积较小，但小，
7、但是是细细胞核胞核较较大，核大，核质质比高，核仁比高，核仁较较大，培育大，培育时时呈呈克隆状生克隆状生长长，在功能上具有，在功能上具有发发育全能型，能育全能型，能进进行行 人人为为定向分化。定向分化。普通普通细细胞系的特性：在体外培养胞系的特性：在体外培养传传代而不代而不发发生分生分化，能化，能进进行冷行冷冻冻保存和保存和遗传遗传改造。改造。发发育全能性：育全能性：1）形形成成畸畸胎胎瘤瘤：将将ES细细胞胞接接种种同同源源动动物物皮皮下下可形成内、中、外三种胚可形成内、中、外三种胚层细层细胞。胞。2）形形成成类类胚胚体体：将将ES细细胞胞在在非非黏黏附附底底物物中中悬悬浮浮培培养养生生长长，或
8、或控控制制增增殖殖细细胞胞数数目目，形形成成多多种种系混系混杂杂的集合体的集合体ES 细胞全能性体现在：细胞全能性体现在：3）直直系系分分化化：通通过过控控制制ES细细胞胞生生长长环环境境或或遗遗传传操操纵纵特特定定基基因因表表达达，ES细细胞胞可可直直接接分分化化为为某某特特定定种种系系细细胞胞。新新的的ES细细胞胞建建系系后后在在体体外外生生长长时间越短，产生所有类型组织的可能性就越大。时间越短，产生所有类型组织的可能性就越大。4）形形成成嵌嵌合合体体：组组织织和和器器官官的的细细胞胞含含有有两两个个或或两两个个以以上上基基因因型型构构建建而而成成的的完完整整个个体体，称称为为基基因因嵌嵌
9、合合体体或或嵌嵌合合体体动动物物。将将ES细细胞胞注注射射到到同同种种动动物物囊囊胚胚腔腔中中，可可形形成成嵌嵌合合体体。ES细细胞胞或或EG细细胞胞一一旦旦分分化化即即丧丧失失全全能能性性，难难以以参参与与胚胚胎发育，形成嵌合体。胎发育，形成嵌合体。4.功能功能在滋养在滋养层细层细胞上或在含有分化移植因子的胞上或在含有分化移植因子的介介质质中，能中，能维维持未分化状持未分化状态态，并，并实现实现自我自我更新，因此可以无限增殖；更新，因此可以无限增殖；在体外，在在体外，在诱导诱导因子的作用下，可以定向因子的作用下，可以定向分化；泌乳小鼠胚胎干分化；泌乳小鼠胚胎干细细胞已胞已经经在体外在体外诱诱
10、导导分化分化为为神神经经元元细细胞、肝胞、肝细细胞、脂肪胞、脂肪细细胞、胞、骨骼肌骨骼肌细细胞黑色素胞黑色素细细胞等。胞等。ES细细 胞胞 具具 有有 种种 系系 传传 递递（germline transmission）能能力力，能能够够形形成成嵌嵌合合体体动动物物（chimeric animal）。若若在在体体外外把把ES细细胞胞注注射射至至另另一一胚胚泡泡内内，使使之之与与受受体体胚胚胎胎细细胞胞混混合合，再再移移植植入入假假孕孕受受体体子子宫宫，可可发发育育获获得得嵌嵌合合体体（chimeric）。）。ES细细胞胞可可参参与与嵌嵌合合体体各各个个器器官官包包括括生生殖殖腺腺的的发发育育。
11、通通过过交交配配可可以以分分离离出出带带有有ES细细胞胞遗遗传传性性状状的的个个体体，这这是是ES细细胞胞具具有有种种系系传传递递能能力力的的一一种种证证明。明。5、ES细细胞自我更新的分胞自我更新的分子机理子机理1、LIF（白血病抑制因（白血病抑制因子）子）:ES细细胞表面的有一胞表面的有一复合受体，由低复合受体，由低亲亲和性和性的的LIF受体和普通受体和普通亚亚基基gp130构成异源二聚体，构成异源二聚体，LIF与受体与受体结结合后激活合后激活Jak酶酶，通，通过对过对STAT3的的磷酸化激活磷酸化激活维维持持细细胞自胞自我更新的基因。我更新的基因。（2）转录调转录调控因子控因子oct-4
12、：oct-4是是ES细细胞胞维维持多能性和持多能性和进进入分化的开关，是入分化的开关，是DNA特异特异结结合蛋白，通合蛋白，通过过激活或者移植激活或者移植靶基因的靶基因的转录转录活性，活性，维维持持ES细细胞的自我胞的自我更新。在更新。在ES细细胞中始胞中始终终保持一定的水平，保持一定的水平，表达量在表达量在50150%，才能，才能实现实现自我更新自我更新和和维维持多能性。持多能性。Ni Wa等（等（2000）研究表明：）研究表明：STAT3和和oct-4可能作用于相同的靶基因而相互可能作用于相同的靶基因而相互协协调维调维持持ES细细胞的功能。胞的功能。（3）通）通过过移植酪氨酸磷酸移植酪氨酸
13、磷酸酶酶SHP-2和和细细胞外胞外调节调节激激酶酶ERK，维维持持ES的正常功能：的正常功能：SHP-2能除去酪氨酸上磷酸基能除去酪氨酸上磷酸基团团，作用，作用于于gp130受体的胞内区，使受体的胞内区，使gp130和其他和其他的膜受体收到刺激后的膜受体收到刺激后ERK被激活。被激活。SHP-2和和ERK对对STAT3功能有功能有负调负调控作控作用，抑制其信号用，抑制其信号传导传导。二、胚胎干二、胚胎干细胞研究的意胞研究的意义1.ES细细胞是研究哺乳胞是研究哺乳动动物个体物个体发发生生发发育育规规律极有价律极有价值值的工具的工具2.是研究是研究细细胞分化的理想手段胞分化的理想手段ES细细胞胞仅
14、仅在在饲饲养养层层细细胞胞上上或或添添加加白白血血病病抑抑制制因因子子或或白白细细胞胞介介素素-6家家族族的的培培养养液液中中维维持持不不分分化化状状态态，当当培培养养液液中中添添加加分分化化诱诱导导剂剂时时可可以以出出现现定定向向分分化化，如如视视黄黄酸酸诱诱导导分分化化为为神神经经元元和和神神经经胶胶质质细细胞胞，DMSO诱诱导导分化分化为为平滑肌平滑肌细细胞等。胞等。通通过过研研究究ES细细胞胞的的分分化化特特点点，可可揭揭示示细细胞胞内内信信号号转转导导的的路路径径，发发现现新新的的信信号号受受体体，揭示揭示细细胞分化和胞分化和调调亡的机理。亡的机理。3.研究基因功能的首研究基因功能的
15、首选细选细胞胞由于由于ES细细胞具有胞具有稳稳定的核型，并易于定的核型，并易于诱诱捕外源基因，因此捕外源基因，因此进进行基因敲除或定向插行基因敲除或定向插入外源基因的理想入外源基因的理想细细胞。胞。用用遗传遗传修修饰饰的的ES细细胞生胞生产产嵌合体或用嵌合体或用细细胞核移植技胞核移植技术获术获得的克隆后代，通得的克隆后代，通过观过观察察后代的表型后代的表型变变化，可探明未知基因的生物化，可探明未知基因的生物学功能和表达学功能和表达调调控控规规律。律。4.是生是生产转产转基因基因动动物的主要方法之一物的主要方法之一用外源基因用外源基因转转染后，染后，筛选筛选阳性阳性细细胞，然后胞，然后注入到囊胚
16、腔或其他卵裂球聚合注入到囊胚腔或其他卵裂球聚合获获得嵌合得嵌合体后代，用体后代，用转转染的染的ES细细胞分化胞分化为为生殖干生殖干细细胞，生胞，生产转产转基因阳性基因阳性动动物。物。也可把也可把转转化后的化后的ES细细胞作胞作为为供体核，用供体核，用细细胞核移植技胞核移植技术术直接直接获获得得转转基因基因动动物。物。5.ES细细胞治胞治疗疗技技术术将引起一将引起一场场医学革命医学革命人类面临的大多数医学难题人类面临的大多数医学难题,如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨质疏松、如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨质疏松、癌症、老年性痴呆、帕金森病、严重烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等疾病癌症
17、、老年性痴呆、帕金森病、严重烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等疾病组织工程学、功能基因组学和组织工程学、功能基因组学和蛋白质组学、发育生物学蛋白质组学、发育生物学新药开发与药效、毒性评估等新药开发与药效、毒性评估等6.可用于研究可用于研究细细胞癌胞癌变变机理和新机理和新药药物的物的筛选筛选细细胞癌胞癌变变主要是由于正常的主要是由于正常的细细胞周期胞周期发发生紊生紊乱，乱，细细胞无序增殖所致。胞无序增殖所致。ES细细胞在正常的胞在正常的培养培养环环境中能境中能维维持持稳稳定的核型，是研究致癌定的核型，是研究致癌物物质诱发细质诱发细胞癌胞癌变变机理的理想材料；机理的理想材料；在研究新在研究新药过药过程中
18、，需要程中，需要对药对药物的作用机理物的作用机理和和药药效效进进行研究，行研究，ES细细胞在体外能分化多胞在体外能分化多种体种体细细胞，可以直接作胞，可以直接作为实验为实验材料来材料来筛选筛选新新药药，可，可缩缩短新短新药药开开发发周期，且治周期，且治疗疗的的针对针对性性强强。三、胚胎干三、胚胎干细胞研究的胞研究的历史与史与进展展干干细细胞胞研研究究成成为为继继人人类类基基因因组组大大规规模模测测序序之之后后最最具具活活力力、最最有有影影响响和和最最有有应应用用前前景景的的生生命命科科学科研究领域；学科研究领域；1999年年干干细细胞胞研研究究被被美美国国SCIENCE杂杂志志评评为为1999
19、年度世界十大科学之冠；年度世界十大科学之冠；2000年年干干细细胞胞研研究究再再次次被被SCIENCE杂杂志志评评为为该年度世界十大科学成就之一。该年度世界十大科学成就之一。1981年年英英国国剑剑桥桥大大学学的的Evans和和Kaufman用用延延缓缓着着床床的的胚胚泡泡的的胚胚胎胎内内细细胞胞团团ICM（inner cells mass)获得鼠的获得鼠的ES细胞；细胞；同同年年美美国国的的Maryin用用条条件件培培养养基基获获得得鼠鼠的的ES细细胞胞。Roberston用用不不同同品品系系的的鼠鼠胚胚和和具具有有不不同同遗遗传传疾疾病病的的胚胚胎胎建建立立了了细细胞胞系系并并进进行行了了
20、多多能能性性和和嵌合特性的分析。嵌合特性的分析。1998年年11月月，美美国国威威斯斯康康星星大大学学的的科科学学家家James Thomson等等从从人人囊囊胚胚的的内内层层细细胞胞团团中中取取得胚胎干细胞。得胚胎干细胞。他他们们把把胚胚胎胎干干细细胞胞与与小小鼠鼠的的骨骨髓髓间间质质细细胞胞进进行行了了共共培培养养。结结果果表表明明胚胚胎胎干干细细胞胞可可以以进进行行长长达达5个个月月的的非非分分化化增增殖殖，同同时时还还保保持持着着分分化化为为滋滋养养层层组组织织及及三三种种胚胚层层组组织织的的能能力力。这这为为胚胚胎胎干干细细胞的临床应用奠定了基础。胞的临床应用奠定了基础。1999年年
21、12月，美国科学家在月，美国科学家在美国科学院院刊美国科学院院刊报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化横向分化”为血液细胞。随后，世界各国的科为血液细胞。随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞包括人类的成体干学家相继证实，成体干细胞包括人类的成体干细胞具有可塑性。细胞具有可塑性。2000年年5月，日本启动月，日本启动“千年世纪工程千年世纪工程”，以干，以干细胞工程为核心技术的再生医疗成为这项工程细胞工程为核心技术的再生医疗成为这项工程的四大重点之一，第一年度投资金额达的四大重点之一，第一年度投资金额达108亿日亿日元。元。2001年年1月，英国议
22、会上院通过法案，允许科学月，英国议会上院通过法案，允许科学家克隆人类早期胚胎，并利用它进行医疗研究。家克隆人类早期胚胎，并利用它进行医疗研究。2001年年4月，美国科学家发现，从病人臀部和大月，美国科学家发现，从病人臀部和大腿处抽取的脂肪中，含有大量类似干细胞的细腿处抽取的脂肪中，含有大量类似干细胞的细胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和肌肉等。胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和肌肉等。l2003年，美国卫生独立研究院（年，美国卫生独立研究院（National Institutes of Health，NIH）华裔科学家施松涛）华裔科学家施松涛等人首次发现牙齿间质存在干细胞。等人首次发现牙齿间质
23、存在干细胞。l2005年报出干细胞研究领域乃至全球学术界一年报出干细胞研究领域乃至全球学术界一大学术丑闻：大学术丑闻：2004及及2005年韩国汉城大学教授年韩国汉城大学教授黄禹锡有关干细胞研究的论文两次荣登黄禹锡有关干细胞研究的论文两次荣登Science杂志，结果经各方查证证实其论文数据存在造杂志，结果经各方查证证实其论文数据存在造假现象，假现象，2006年年Science杂志宣布撤回这两篇论杂志宣布撤回这两篇论文。文。l2006年，日本科学家山中亚弥等成功诱导出鼠年，日本科学家山中亚弥等成功诱导出鼠诱导性多能干细胞（诱导性多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cel
24、l，iPS细胞），此项研究成功将干细胞研究细胞），此项研究成功将干细胞研究扩充到一个新的领域：重编程！扩充到一个新的领域：重编程！l2007年，年，iPS研究取得巨大进展：山中亚弥等人研究取得巨大进展：山中亚弥等人和汤姆森带领下的华裔科学家俞君英等人分别和汤姆森带领下的华裔科学家俞君英等人分别在在Cell及及Science发表论文宣布成功利用人类上发表论文宣布成功利用人类上皮细胞诱导出皮细胞诱导出iPS细胞。细胞。l2008年，美国科学家解析了年，美国科学家解析了microRNAs在干细胞发在干细胞发育及分化中的调控作用，为干细胞日后的研究提供育及分化中的调控作用，为干细胞日后的研究提供了非常
25、重要的参考资料。了非常重要的参考资料。l2009年年3月，美国白头研究所（月，美国白头研究所（Whitehead Institute）科学家在成功诱导科学家在成功诱导iPS细胞后，巧妙的将诱导细胞后，巧妙的将诱导iPS时带时带入细胞的基因去除，大大降低了细胞癌变风险。入细胞的基因去除，大大降低了细胞癌变风险。l2009年年3月，汤姆森和俞君英带领的研究小组在月，汤姆森和俞君英带领的研究小组在iPS研研究方面又迈进一大步，他们利用质粒作为诱导究方面又迈进一大步，他们利用质粒作为诱导iPS基基因的载体进行诱导因的载体进行诱导iPS细胞后，随着细胞分裂丢失质细胞后，随着细胞分裂丢失质粒，可以得到纯净
26、无外源粒，可以得到纯净无外源DNA的的iPS细胞，在细胞，在iPS细细胞应用安全性方面又进一步。胞应用安全性方面又进一步。四四 .胚胎干胚胎干细胞的分离培养基本程序胞的分离培养基本程序1.胚胎干胚胎干细细胞的分离胞的分离目前目前ES细细胞主要有两个来源，即胞主要有两个来源，即胚泡内胚泡内细细胞胞团团和和生殖生殖嵴嵴中的原始生殖中的原始生殖细细胞胞，前者更，前者更为为常常用。用。囊胚：尽量囊胚：尽量选择选择体内受精的胚胎分离体内受精的胚胎分离ES细细胞；胞；对对于相同来源的胚胎于相同来源的胚胎选择选择色色泽泽透亮，透亮，ICM明明显显的胚胎。的胚胎。胎儿性腺脊：胎儿性腺脊：经经酶酶消化后，可直接
27、培养在分消化后，可直接培养在分化抑制培养体系中，一般化抑制培养体系中，一般7d传传代一次，直至代一次，直至出出现细现细胞形胞形态态均一的克隆均一的克隆细细胞胞团团，挑，挑选选后后进进行行扩扩大培养。大培养。小鼠多用小鼠多用34天的胚泡或天的胚泡或23天的桑椹胚，天的桑椹胚，猪取猪取810天的胚泡，天的胚泡，绵羊取绵羊取89天的胚泡，天的胚泡，人和牛取人和牛取78天的胚泡。天的胚泡。原始生原始生殖细胞殖细胞从胚泡中分离出从胚泡中分离出细细胞胞团团的方法的方法主要免疫外主要免疫外科学方法，科学方法，显显微外科学方法微外科学方法和和组织组织培养法培养法等。等。其中其中组织组织培养法培养法是将胚泡接种
28、在是将胚泡接种在饲饲养养层层上，上，模模拟拟体内胚泡的着床，更接近自然体内胚泡的着床，更接近自然发发育育过过程，程，较较易易获获得胚胎干得胚胎干细细胞集落。胞集落。（1）免疫外科学方法）免疫外科学方法：该该法的原理是利用法的原理是利用囊胚腔囊胚腔对对抗体的不通透性，通抗体的不通透性，通过过抗体、抗体、补补体体结结合合对细对细胞的作用，去除滋养胞的作用，去除滋养层细层细胞，保留胞，保留ICM细细胞胞进进行培养。行培养。以小鼠以小鼠为为例，将体外培养的小鼠胚泡去除透例，将体外培养的小鼠胚泡去除透明明带带后，后，经经抗小鼠脾抗小鼠脾细细胞抗血清作用一定胞抗血清作用一定时时间间后再移入含新后再移入含新
29、鲜鲜豚鼠血清的培养液中豚鼠血清的培养液中处处理，理，这样这样滋养滋养层细层细胞即被破坏，去除死去的滋养胞即被破坏，去除死去的滋养层细层细胞即得胞即得ICM，将，将ICM离散成卵裂球即可离散成卵裂球即可接种培养。接种培养。此法此法较为简单较为简单，且去除滋养，且去除滋养层细层细胞胞较彻较彻底，底，最最为为常用。常用。（2）显显微外科学方法：微外科学方法：小鼠受精后小鼠受精后3-4天，天，由子由子宫宫冲取胚泡，利用冲取胚泡，利用显显微操作系微操作系统统直接直接从胚泡中吸出从胚泡中吸出ICM细细胞胞进进行培养行培养.（3）组织组织培养法培养法:在小鼠受精在小鼠受精2.5天天后切后切除卵巢，除卵巢，给
30、给予外源激素，使胚胎予外源激素，使胚胎继续发继续发育，育，但延但延缓缓着床，着床，4-6天后，从子天后，从子宫宫中取胚泡中取胚泡进进行培养。滋养行培养。滋养层细层细胞生胞生长长并在培养皿底并在培养皿底壁上壁上铺铺展，而展，而ICM细细胞增殖，垂直向上胞增殖，垂直向上生生长长，形成卵，形成卵圆圆柱状柱状结结构，在构，在显显微微镜镜下用下用玻璃玻璃针针挑出挑出这这种柱状种柱状结结构，消化构，消化传传代。代。2.选择选择抑制抑制细细胞分化的培养体系胞分化的培养体系由于由于ES细细胞在体外培养胞在体外培养过过程中极易分化和失去正程中极易分化和失去正常二倍体核型，常二倍体核型，进进而失去全能性或多能性和
31、而失去全能性或多能性和丧丧失失形成嵌合体形成嵌合体动动物的能力，因此需特殊的培养条件物的能力，因此需特殊的培养条件阻止其分化，以确保阻止其分化，以确保维维持其全能性或多能性。目持其全能性或多能性。目前常用的抑制前常用的抑制细细胞分化的培养体系有胞分化的培养体系有:1、饲饲养养层层培养体系：培养体系：先用常先用常规规的培养液如的培养液如DMEM对对体体细细胞胞进进行培养，等行培养，等细细胞胞铺满铺满低壁后，用低壁后，用射射线线照射，使照射，使细细胞分裂停止，形成特殊的胞分裂停止，形成特殊的细细胞胞层层，即，即饲饲养养层层。然后将囊胚或。然后将囊胚或PGCs与与饲饲养养层细层细胞共培养胞共培养就可
32、抑制就可抑制ICM细细胞或胞或PGCs的分化，并促的分化，并促进进其分裂，其分裂，进进一步分离一步分离获获得得ES细细胞。胞。此种方法效率高，此种方法效率高，结结果果稳稳定，定，较为较为常用。常用。2、条条件件培培养养体体系系：直直接接放放入入到到特特殊殊的的培培养养液液中中。这这种种培培养养液液来来源源于于某某些些细细胞胞如如豚豚鼠鼠肝肝脏脏细细胞胞，人人膀膀胱胱癌癌细细胞胞和和小小鼠鼠血血管管内内皮皮细细胞等胞等饲饲养一段养一段时间时间后回收的液体。后回收的液体。这这些些细细胞胞在在生生长长过过程程中中不不仅仅能能分分泌泌LIF，同同时时IGF-II等等生生长长因因子子，能能促促进进ES细
33、细胞胞的的生生长长。3、培培养养液液中中添添加加分分化化抑抑制制因因子子体体系系：将将分分化化抑抑制制因因子子LIF或或白白介介素素6（IL-6）家家族族按按照照一一定定浓浓度度直直接接添添加加到到囊囊胚胚或或PGCs的培养液中，分离的培养液中，分离ES细细胞。胞。方法方法简单简单，且能避免，且能避免饲饲养养层细层细胞的干胞的干扰扰。目前只在小鼠目前只在小鼠ES细细胞取得成功。胞取得成功。v小鼠采用超排卵途径收集胚胎小鼠采用超排卵途径收集胚胎 雌性成年小鼠注射雌性成年小鼠注射5U孕马血清促性腺激素（孕马血清促性腺激素（MPS），），48h后再注射后再注射5U人绒毛膜促性腺激素（人绒毛膜促性腺激
34、素（HCG）；）；与雄鼠合笼，自然交配，阳性者为与雄鼠合笼，自然交配，阳性者为0天（即天（即0.5dpc）；）；第三天至第四天中午（即第三天至第四天中午（即3.5 dpc4.5 dpc）分别剖取孕鼠子）分别剖取孕鼠子宫，冲出早期胚泡，进一步分离培养建立宫，冲出早期胚泡，进一步分离培养建立ES细胞系；细胞系；剖取发育至剖取发育至8.5 dpc10.5 dpc时的胚胎，可建立小鼠时的胚胎，可建立小鼠EG细胞系。细胞系。四、四、ES细胞和细胞和EG细胞的培养过程细胞的培养过程 vES细胞的培养过程细胞的培养过程 基本培养液DMEM液液 15%20%FCS0.1mmol/L巯基乙醇巯基乙醇50U/ml
35、青霉素、青霉素、50ug/ml链霉素链霉素-巯基乙醇是一种还原剂，其主要作用是降低氧对细胞产生的氧化损伤，体外培养必须抑制自由基的氧化，所以-巯基乙醇是保护蛋白不被自由基氧化的很好的高效的物质。将胚泡接种于预先铺有作为滋养层而无有丝分裂活性的将胚泡接种于预先铺有作为滋养层而无有丝分裂活性的单层单层MEF细胞的培养皿中细胞的培养皿中 用免疫手术法分离胚泡的用免疫手术法分离胚泡的ICM细胞，或用常规培养法分离细胞，或用常规培养法分离出出ICM细胞进一步培养。细胞进一步培养。培养培养23天天 免疫手术法免疫手术法 44.5dpc的小鼠胚泡主要由已分化的滋养外层胚层和未分的小鼠胚泡主要由已分化的滋养外
36、层胚层和未分化的化的ICM细胞组成，前者细胞表面一般已表达主要组织相容性细胞组成，前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体（复合体（MHC），能识别其相应抗体和形成免疫复合物，在），能识别其相应抗体和形成免疫复合物，在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。具体操作如下：具体操作如下：体外培养的胚泡，用酸性体外培养的胚泡，用酸性Tyrodes液（液（pH2.5）处理，去除透明带；）处理，去除透明带；Hanks洗涤，加入兔抗洗涤，加入兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清（抗小鼠脾脏细胞抗血清（抗H2b）；）；移至含新鲜豚鼠血清的培养液，移至含新鲜豚鼠血清的培养液，Hanks
37、液洗涤后，移至液洗涤后，移至96孔铺有孔铺有MEF或或STO饲养层细胞和饲养层细胞和DMEM基本培养液的板内进一步培养。基本培养液的板内进一步培养。30min胚泡的滋养外胚层细胞呈泡状，发生免疫溶解；而胚泡的滋养外胚层细胞呈泡状，发生免疫溶解；而ICM细胞不具细胞不具H2b抗原，细胞完整；抗原，细胞完整；30min常规培养法常规培养法 未去透明带的胚泡培养未去透明带的胚泡培养34天，天，ICM细胞团从贴壁胚泡内长出来；细胞团从贴壁胚泡内长出来；胰蛋白酶和胰蛋白酶和EDTA混合消化液在混合消化液在37消化消化5min；解离的细胞团移至滋养层的解离的细胞团移至滋养层的24孔培养板，继续培养孔培养板
38、，继续培养4天，可在天，可在一些孔内见到巢状胚胎干细胞团；一些孔内见到巢状胚胎干细胞团；胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，克隆和纯化胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，克隆和纯化ES细胞。细胞。视视ES细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。五五.ES.ES细胞的保存胞的保存1.常常规规保存：通保存：通过过不断的更不断的更换换分化抑制培分化抑制培养液，以养液，以传传代培养方式代培养方式维维持持ES的不分化的不分化状状态态。如人的。如人的ES细细胞在体外培养胞在体外培养传传代代2年年仍仍维维持不分化状持不分化状态态。2.冷冷冻冻保存：通保存：
39、通过过超低温冷超低温冷冻冻保存使保存使细细胞胞的代的代谢谢活活动动完全停止，达到完全停止，达到长长期保存的目期保存的目的。的。六六.ES.ES细胞的胞的鉴定定通通过过分离培养分离培养获获得的得的ICM或或PGCs细细胞在胞在传传到到812代代时时，需要通，需要通过过生化或生化或细细胞生物学指胞生物学指标标的的鉴鉴定最定最终终确确认为认为ES细细胞系。胞系。1.形形态态：呈克隆状生：呈克隆状生长长，即，即单单个个ES细细胞能繁胞能繁殖呈形殖呈形态态、功能和、功能和遗传遗传基基础础完全相同的一簇完全相同的一簇细细胞，并凝聚成胞，并凝聚成团团，外，外观观形似形似鸟鸟巢。巢。2.阶阶段特异性胚胎抗原段
40、特异性胚胎抗原(SSEA)：对细对细胞表面胞表面的的SSEA通通过过化学方法化学方法检测检测，先将，先将细细胞用多胞用多聚甲聚甲醛醛固定，在用生物素固定，在用生物素标记标记的二抗和辣根的二抗和辣根过过氧化物的底物氧化物的底物处处理，来理，来鉴鉴定定细细胞表面的特胞表面的特异性糖蛋白。异性糖蛋白。3.端粒端粒酶酶检测检测：通常：通常ES细细胞端粒胞端粒酶酶水平水平远远高高于其他分化的体于其他分化的体细细胞，可用正常体胞，可用正常体细细胞或癌胞或癌细细胞做胞做对对照，用照，用专专用用试剂试剂盒盒检测检测。4.Apase（碱性磷酸（碱性磷酸酶酶）：可通）：可通过组织过组织化学方化学方法法鉴鉴定，定，
41、细细胞胞经经乙醇或病痛甲乙醇或病痛甲醛醛固定后，直固定后，直接加入底物，即可接加入底物，即可鉴鉴定定Apase的表达水平，都的表达水平，都应该为应该为阳性。阳性。5.核型分析：核型分析：传传到到25代代时时需要需要进进行核型分析，行核型分析，分析分析时时先在先在细细胞培养液中加入一定胞培养液中加入一定浓浓度的秋度的秋水水酰酰胺，使胺，使细细胞同步在胞同步在M期，然后用低渗溶期，然后用低渗溶液液处处理，理，经经乙醇冰醋酸溶液固定后染色和乙醇冰醋酸溶液固定后染色和显显微照相，最后微照相，最后进进行核型分析，行核型分析，检测细检测细胞是否胞是否维维持在二倍体状持在二倍体状态态。6.发发育分化潜力：育
42、分化潜力：（1）体外）体外诱导诱导分化：是把分化：是把ES细细胞培养在胞培养在无分化抑制物的普通培养液中，如果无分化抑制物的普通培养液中，如果ES细细胞能自胞能自动动聚合并分化形成胚状体，可初聚合并分化形成胚状体，可初步确步确认认具有具有发发育多能性；育多能性；（2）畸胎瘤）畸胎瘤实验实验：把：把ES细细胞注射到有免胞注射到有免疫缺陷成年小鼠或疫缺陷成年小鼠或遗传遗传同同质动质动物的皮下或物的皮下或肾脏肾脏、睾丸的被膜下，如果能形成畸胎瘤，、睾丸的被膜下，如果能形成畸胎瘤，可初步判定可初步判定为细为细胞具有多能性。胞具有多能性。（3）嵌合体）嵌合体实验实验：把培养的：把培养的ES细细胞与早胞与
43、早期胚胎的卵裂球聚合，或直接把期胚胎的卵裂球聚合，或直接把ES细细胞胞注入囊胚腔，然后注入囊胚腔，然后让让重重组组胚在体内胚在体内继续发继续发育，通育，通过检测过检测后代的嵌合状况，分析后代的嵌合状况，分析ES细细胞的分化潜力。只有当操作后的胚胎胞的分化潜力。只有当操作后的胚胎发发育育为为嵌合体，注入的嵌合体，注入的细细胞能分化胞能分化为为内、中内、中和外三胚和外三胚层细层细胞，并参与胞，并参与细细胞生殖干胞生殖干细细胞胞形成形成时时，才能确，才能确认为认为ES细细胞。胞。目前，只有小鼠、猴和人能到达以上指目前，只有小鼠、猴和人能到达以上指标标。1 如何如何维维持体外持体外扩扩增增时时不分化？
44、不分化？2 分化分化细细胞的增殖是一个瓶胞的增殖是一个瓶颈问题颈问题：数量和：数量和纯纯度度3 如如何何定定向向诱诱导导干干细细胞胞的的分分化化？明明确确干干细细胞胞发发育育的的调调控机制控机制4 胚胚胎胎干干细细胞胞真真正正用用于于器器官官克克隆隆与与移移植植仍仍需需要要技技术术上的突破上的突破5 如如何何克克服服移移植植排排斥斥问问题题？破破坏坏或或改改变变细细胞胞许许多多基基因因的的可可行行性性，核核移移植植是是否否激激活活卵卵细细胞胞的的沉沉默默基基因因，是否改是否改变变染色体染色体结结构？构？6 胚胎干胚胎干细细胞的安全性如何？畸胎瘤，胞的安全性如何？畸胎瘤，肿肿瘤形成？瘤形成？7
45、伦伦理之争理之争七七.ES.ES细胞技胞技术目前存在的目前存在的问题1.ES细细胞系的分裂效率低胞系的分裂效率低主要原因是缺乏理想的分离培养体系，目前主要原因是缺乏理想的分离培养体系，目前对对于于ES干干细细胞胞维维持多能性的分子机理缺乏了持多能性的分子机理缺乏了解，不能根据解，不能根据细细胞分化特点和胞分化特点和维维持不分化的持不分化的营营养要求，建立合理的培养体系，是目前存养要求，建立合理的培养体系，是目前存在的主要在的主要问题问题。2.ES细细胞定向胞定向诱导诱导分化的理分化的理论论和技和技术术水平低水平低目前的技目前的技术还术还无法无法对对ES细细胞胞实实施施专专一的一的诱导诱导分化，
46、即分化分化，即分化为为特定的特定的细细胞胞类类型，如神型，如神经经或或心肌心肌细细胞等。胞等。3.ES细细胞治胞治疗疗中面中面临临的免疫排斥和致癌的免疫排斥和致癌问问题题外源的外源的ES细细胞移入病人机体后，胞移入病人机体后，细细胞表胞表面的面的组织组织相容性抗原将激活免疫系相容性抗原将激活免疫系统统，出，出现现排斥反排斥反应应，导导致移植失致移植失败败。目前关于目前关于这这方面的机理研究方面的机理研究较较少，克服排少，克服排异反异反应应的技的技术还术还不具不具备备。4.ES细细胞目前无法培育出完整的器官胞目前无法培育出完整的器官5.人人ES细细胞分离培养面胞分离培养面临临的的伦伦理法律理法律
47、问题问题获获得得ES细细胞，必胞，必须须毁毁坏人的早期胚胎或坏人的早期胚胎或胎儿，与宗教的教胎儿，与宗教的教义义和社会和社会伦伦理相理相违违背，背，同同时还违时还违反国家法律，所以公众很反国家法律，所以公众很难难接受。接受。八八.ES.ES细胞技胞技术的的发展方向展方向1.ES细细胞胞维维持自我更新和定向分化的分持自我更新和定向分化的分子机理子机理2.ES细细胞治胞治疗疗技技术术的研究的研究用用ES细细胞修复病胞修复病变变或或创伤组织创伤组织将会引起将会引起一一场场医学革命，如何将两者医学革命，如何将两者结结合起来非常合起来非常复复杂杂。3.ES细细胞作胞作为为工具探工具探讨讨基因功能和个体基
48、因功能和个体的的发发生生发发育育随着人和其他哺乳随着人和其他哺乳动动物的基因物的基因组计组计划完成划完成后，基因的表达后，基因的表达调调控控规规律和在生命活律和在生命活动动中中的功能研究迫在眉睫。的功能研究迫在眉睫。应应用嵌合体技用嵌合体技术术，以特殊基因，以特殊基因标记标记的的ES细细胞作胞作为为探探针针，研究未知基因的功能，探，研究未知基因的功能，探讨讨器官的器官的发发生、生、发发育育规规律，将是医学、律，将是医学、动动物科学和物科学和发发育生物学研究的前沿育生物学研究的前沿领领域。域。4.ES细细胞治胞治疗疗中的免疫排斥中的免疫排斥问题问题5.治治疗疗型克隆技型克隆技术术：用病人的正常：
49、用病人的正常细细胞作胞作为为核供体，通核供体，通过细过细胞核移植方法胞核移植方法获获得囊胚，得囊胚，然后分离培养然后分离培养ES细细胞，再用胞，再用ES细细胞修复胞修复衰老或功能异常的器官、衰老或功能异常的器官、组织组织。但是人。但是人细细胞核移植技胞核移植技术术研究在很多国家是被禁止的，研究在很多国家是被禁止的，所以所以这类这类研究比研究比较较困困难难。6.用用ES细细胞生胞生产转产转基因家畜基因家畜ES细细胞易于基因打靶和基因敲除，用胞易于基因打靶和基因敲除，用遗遗传传改良后的改良后的ES细细胞，通胞，通过细过细胞核移植技胞核移植技术术，生，生产转产转基因后代，将是提高基因后代，将是提高转转基因基因动动物生物生产产效率的有效方法。效率的有效方法。The end