《NY∕T 3233-2018 鸭坦布苏病毒病诊断技术(农业).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《NY∕T 3233-2018 鸭坦布苏病毒病诊断技术(农业).pdf（26页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3233一2018鸭坦布苏病毒病诊断技术Diagnostic techniques for duck Tembusu viral disease 2018-05-07发布2018-09-01实施附中华人民共和国农业农村部发布NY/T 3233-2018 目次前言.II 引言.田l 范围12 规范性引用文件.1 3 缩略语.l4 临床诊断.1 5 病毒分离鉴定.26 病毒特异性抗体检测.7 鸭坦布苏病毒病综合判定.9 附录A(规范性附录)溶液试剂配制.11 附录B(资料性附录)免疫荧光检测方法中所用坦布苏病毒的单抗.13
2、附录C(资料性附录)阳性对照病毒(FX2010).14 附录职资料性附录)样品的采集、处理、运输及保存1 5附录E(资料性附录)坦布苏病毒特异反转录引物、RT-PCR、荧光RT-PCR的引物和探针17附录F(资料性附录)ELISA抗原和血清标准.四附录G(资料性附录)鸭坦布苏病毒血凝抑制试验抗原四附录H(资料性附录)HI抗体检测的鸭血清处理方法m附录I(资料性附录)检测过程防止交叉污染的措施.21 I NY/T 3233-2018 剧吕本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由农业农村部兽医局提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位
3、:中国农业科学院上海兽医研究所、北京市农林科学院畜牧兽医研究所、中国动物疫病预防控制中心、中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人:李泽君、杨健美、李雪松、林健、滕巧泱、闰丽萍、刘玉良、王小蕾、闰大为、顾小雪、王宾宾、杨志远、朱启运、段会娟、刘立新。E 自2010年春季以来，我国主要养鸭地区相继暴发一种引起鸭生长迟缓、高热、食欲不振、蛋鸭产蛋下降乃至死亡的新发传染病。研究证实，引起该病的病原为坦布苏病毒CTembusuvirus,TMUV)，属于恩塔亚病毒群CNtayavirus group)、黄病毒属CFlavivirusgenus)。该病发病率高达100%，死亡率在5%30%，其传播
4、速度快、感染性强，可引起%S幽h高热和部分死亡，导致雏鸭生长迟缓、蛋鸭产蛋下降或停产，对养鸭业的监业数以亿计的经济损失，是近年来危害养鸭业最严重的疾病回归iJ，全国主亘z)(禽事喔隘盖到该病的威胁。本标准根据临床症状、细植33再起虫病药死岳IJJ划酬监王军感染，后续进行病毒鉴定和血清抗体检测进o每蹦蹦蹦蜒咿用性针对坦布苏病毒E蛋白的单克隆抗俑F癖菌均可细疆军圃自噩噩漏璐踵疆理耻对却在五咽M蛋白的基因特异序列设计引物，建到.每咱这ra盟理跚臂帮运胃喃筐黯擅酶眩搏E蛋.医因特异序列设计了引物和荧光探-l病毒锺噩噩嚣品斗远届检视l屈;总噩噩噩验测撞立检测方法，包括运用针对坦布温.J垂长遏磊疆蕴酶鳝斟
5、Jj磊疆踏锺疆.就段:特性建立了血凝抑制CHD本文件的6.2;7.2)与坦布使用。本文件的发该专利持有就专利授权许可联系方式获得:专利持有人1.地址1:上海市请注意除上述的责任。NY/T 3233-2018 引利的以下田NY/T 3233-2018 鸭坦布苏病毒病诊断技术范围本标准规定了鸭坦布苏病毒病诊断技术的要求。本标准所规定的临床症状和病理变化适用于鸭坦布苏病毒病的初步诊断;免疫荧光检测方法适用EZZ品iitZ盟矗在;2221;222抗体水平的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本件。凡是不注日期的寻GB/T 6682 GB 19489 NY/T 541 SN/T 1193 WS/T 3
6、缩畸语下列BSA:牛血清DEPC:D扣1EM:E.囊膜糖蛋白FBS:胎牛血清(HA:血凝试验(HI:血凝抑制(PBS:磷酸盐缓冲液PBST:吐温PCR:聚合酶链式反应PrM:膜蛋白前体CPre-Mem RT-PCR:反转录-聚合酶链式反应TAE:Tris-乙酸电泳缓冲液CTrisAcetate-EDT A Buffer)4 临床诊断4.1 流行病学一年四季均可发生，潜伏期3d5 d。不同日龄的麻鸭、北京鸭、樱桃谷鸭和鹅均易感，发病鸭群的感染率高达100%，死亡率1%15%不等。4.2 临床症状雏鸭感染后出现生长迟缓，产蛋鸭感染出现群体性采食量和产蛋量下降、甚至绝产。病鸭精神沉NY/T 3233
7、-2018 郁、扎堆，羽毛逆立，拉绿色稀便;少量病鸭出现站立不稳、震颤、行走困难和姿势异常。继发感染、不当的药物治疗或饲养管理不当等因素可使发病鸭的死亡率高达15%。4.3 病理变化卵巢变性、坏死，卵泡变形、充血、出血和破裂，出现卵黄性腹膜炎，输精管萎缩。脾脏肿大。4.4 临床诊断结果判定同时符合4.1、4.2、4.3判定为疑似鸭坦布苏病毒病。5 病毒分离鉴定5.1 病毒分离5.1.1 细胞分离5.1.1.1 仪器设备与耗材5.1.1.1.1 可调移液器:20L、200L、1000L。5.1.1.1.2 高压蒸汽灭菌器。5.1.1.1.3 元菌离心管:1.5 mL、15mL、50mL。5.1.
8、1.1.4 涡旋振荡器。5.1.1.1.5 冰箱:2.C8.C、-20.C、-80.C。5.1.1.1.6 细胞培养箱。5.1.1.1.7 细胞培养瓶、12孔细胞培养板。5.1.1.2 试剂5.1.1.2.1 磷酸盐缓冲液(PBS)，见附录A中的A.1。5.1.1.2.2 DMEM细胞培养液。5.1.1.2.3 胎牛血清(FBS)5.1.1.2.4 L-谷氨酷股。5.1.1.3 细胞的准备将生长良好的DF-1等敏感细胞用无菌PBS洗涤2次，弃去PBS，加人0.25%膜酶消化为单个细胞，加人少量细胞培养液，用吸管轻轻吹散细胞;再加人适量细胞培养液，用吸管轻轻吹打使细胞分散均匀后，按每孔1mL加人
9、到12孔细胞培养板;在37C、含5%COz的细胞培养箱中培养24h36 h，密度达到80%时用于病毒分离。5.1.1.4 样品接种和培养将上述细胞培养液弃掉，用无菌PBS洗涤3次后，将处理好的样品加人到细胞上，每孔O.3 mL 0.5 mL。放人细胞培养箱吸附1h2 h，每隔15min轻轻摇动一次，吸附后弃掉液体，用无菌PBS洗涤3次5次，加人病毒培养维持液，每孔1mL。在细胞培养箱中培养36h48 h，收集出现病变的细胞上清液。5.1.1.5 病毒分离结果判定显微镜下观察，出现细胞变圆、不融合、不崩解的典型病变，判定为鸭坦布苏病毒疑似样品。5.1.2 鸡胚(或鸭胚)分离5.1.2.1 仪器设
10、备与耗材5.1.2.1.1 可调移液器:200L、1000L。5.1.2.1.2 高压蒸汽灭菌器。5.1.2.1.3 元菌注射器:1mL、5mL。5.1.2.1.4 高压灭菌的剪刀、慑子。5.1.2.1.5 元菌离心管:1.5 mL、15mL、50mL。5.1.2.1.6 冰箱:2.C8.C、-20.C、-80.C。5.1.2.1.7 胚孵化箱。5.1.2.1.8 种蛋。5.1.2.2 种蛋准备NY/T 3233-2018 将鸡胚(或鸭胚)置于孵化器中37.C下孵育9dC鸭胚孵育10dl1 d)，用于病毒分离。5.1.2.3 鸡胚(或鸭胚)接种将待检样品以0.1mL/胚的剂量事G.思37.C孵
11、育，培养144h，弃去24 h内死亡胚，收集24h144 h 5.1.2.4 鸡胚(或鸭胚)分离24 h144 h引起鸡胚病毒疑似样品。5.2 病毒检测方法5.2.1 免疫荧5.2.1.1 仪器设5.2.1.1.1 可调5.2.1.1.2高5.2.l.l.3无5.2.1.1.4 5.2.1.l.5 5.2.1.1.6 5.2.1.l.7 5.2.1.1.8 5.2.1.1.9 荧光显5.2.1.2 试剂5.2.1.2.1 DMEM细5.2.1.2.2 胎牛血清(5.2.1.2.3 牛血清白蛋白(5.2.1.2.4 L谷氨酷肢。5.2.1.2.5 4%多聚甲醒。5.2.1.2.6 O.5%Tri
12、ton X-100。5.2.1.2.7 青霉素链霉素双抗溶液。5.2.1.2.8 磷酸盐缓冲液CPBS)，见A.1。5.2.1.2.9 吐温磷酸盐缓冲液CPBST)，见A.2。5.2.l.2.10 10倍青霉素链霉素双抗PBS，见A.3。5.2.1.2.细胞培养液，见A.4.5.2.1.2.12 病毒感染维持液，见A.5。5.2.1.2.13 坦布苏病毒的单抗1町，参见附录B。3 NY/T 3233-2018 5.2.l.2.14 FITC-羊抗鼠IgG抗体。5.2.1.3样晶5.2.l.3.1 阴性对照使用正常细胞上清液作为阴性对照。5.2.l.3.2 阳性对照使用坦布苏病毒FX2010株(
13、CCTCCNO.V201032，参见附录C)，或其他背景清楚的鸭坦布苏病毒株作为阳性对照。5.2.1.3.3 待检测样品待检测的样品采集、处理、运输及保存，参见附录D。5.2.l.4 试验步骤5.2.1.4.1 DF-1细胞的准备同5.1.1.30 5.2.1.4.2 样品接种和培养同5.1.1.4。5.2.1.4.3 免瘟荧光鉴定5.2.1.4.3.1 将细胞培养上清液弃去，用4%多聚甲醒固定液于室温固定细胞15min，每孔0.5mL。5.2.1.4.3.2 轻轻吸弃固定液，用元菌PBS洗涤3次，每孔0.5mL，每次5mino 5.2.1.4.3.3 加入0.5%Triton X-100通透
14、15min，每孔0.5mL;轻轻吸弃通透液，用PBS洗涤3次，每次5min。5.2.1.4.3.4 加人含1%BSA的PBS溶液，每孔0.5mL，370C封闭1h;轻轻吸弃封闭液，用无菌PBS洗涤3次，每孔0.5mL，每次5min。5.2.1.4.3.5 加入1:200稀释的坦布苏病毒特异性单克隆抗体1F5，每孔0.5mL，370C孵育1h;用PBST洗涤3次，每孔0.5mL，每次5min。5.2.1.4.3.6 加入1:500稀释的FITC-羊抗鼠荧光IgG抗体(按所购商品说明书稀释)，每孔O.5 mL，3 7C孵育1ho 5.2.1.4.3.7 用PBST洗涤3次，每次5min;用PBS洗
15、涤1次后，加入PBS，每孔0.5mL，在荧光显微镜下观察特异性绿色荧光。5.2.1.5 免疫荧光技术结果判定5.2.1.5.1 试验成立的条件在荧光显微镜下观察，以阳性对照出现特异性绿色荧光，而阴性对照无特异性绿色荧光为试验结果成立。5.2.1.5.2 试验结果的判定5.2.1.5.2.1 在试验成立的前提下，细胞内有特异性的绿色荧光，判定样品中坦布苏病毒为阳性。5.2.1.5.2.2 在试验成立的前提下，在荧光显微镜下观察，若细胞内无特异性绿色荧光，判定样品中坦布苏病毒为阴性。5.2.2 RT-PCR技术5.2.2.1 仪器设备与耗材5.2.2.1.1 可调移液器:2L、20L、200L，l
16、000 L。5.2.2.1.2 台式高速冷冻离心机。5.2.2.1.3无RNA酶的1.5 mL管。5.2.2.1.4元RNA酶的PCR管。5.2.2.1.5 无RNA酶的带滤芯枪头。5.2.2.1.6 PCR基因扩增仪。5.2.2.1.7 核酸电泳仪。5.2.2.1.8 核酸电泳槽。5.2.2.1.9 凝胶成像分析系统。5.2.2.2 试剂5.2.2.2.1 商品化RNA提取试剂盒。5.2.2.2.2 DEPC处理水。5.2.2.2.3 反转录试剂盒，5.2.2.2.4 PCR Mix(2X)。5.2.2.2.5 dNTPs(2.5 5.2.2.2.6 DNA 5.2.2.2.7 5.2.2.
17、2.8 5.2.2.2.9 1%5.2.2.3 引物5.2.2.3.1 5.2.2.4样晶5.2.2.4.1阴阴性对照宜为5.2.2.4.2 阳性对使用坦布苏病毒株作为阳性对照。待检测的样品采集、5.2.2.5 试验步骤5.2.2.5.1 病毒RNA的提取按照RNA提取试剂盒操作说明书，度，并立即用于反转录，否则应于一800C冰箱冻存。5.2.2.5.2 病毒cDNA的合成NY/T 3233-2018 将5LRNA提取液与2LRandom9反转录引物混匀，700C保温10min后迅速冰浴2min;然后，分别加人4L5XM-MLV Buffer,1LRNA酶抑制剂、1LM-MLV，lL dNTP
18、s、6LDEPC水，共20L，混匀后300C保温10min，420C保温1h2 h,750C 15 min。5.2.2.5.3 PCR反应体系及反应条件在试剂储存和准备区配制PCR反应液，在样品制备区进行加样。采用25L反应体系，组成如下:2X PCR孔1ix12.5L 5 NY/T 3233-2018 DTMUV-F引物00mol/L)1.0,uL DTMUV-R引物00mol/L)1.0 L 模板cDNA1.0 L 灭菌去离子水9.5L 总体积25.0 L 瞬时离心，置PCR基因扩增仪内进行扩增，反应程序为:950C预变性3min;然后进入扩增循环:950C 30 s,530C 30 s,
19、720C 30 s，30个循环;最后720C延伸10min。5.2.2.5.4 产物检测在扩增产物分析区，将制备好的1.0%琼脂糖凝胶放人电泳槽(带加样孔的一端在阴极)，倒人电泳液OXTAE)浸过胶面。PCR产物各取10L加人电泳胶孔内(先加5LDNA Marker，然后依次加阴性对照产物，再加待测样品，最后加阳性对照产物)，在100V电压下电泳15min30 min;在凝胶成像分析系统下观察、拍照，并记录结果。5.2.2.6 RT-PCR结果判定5.2.2.6.1 试验成立的条件阴性对照样品无条带，阳性对照样品出现250bp大小的条带，则试验结果成立。5.2.2.6.2 试验结果的判定5.2
20、.2.6.2.1 在试验成立的前提下，待检样品出现250bp大小的条带，判定待检样品为坦布苏病毒PCR阳性。必要时，对扩增片段进行序列测定。5.2.2.6.2.2 在试验成立的前提下，待检样品元条带，则为坦布苏病毒PCR阴性。5.2.3 荧光RT-PCR技术5.2.3.1 仪器设备与耗材5.2.3.1.1 实时荧光定量PCR检测仪。5.2.3.1.2 台式高速冷冻离心机。5.2.3.1.3 涡旋振荡器。5.2.3.1.4 可调移液器:2L、20L、200L、1000L。5.2.3.1.5 元RNA 酶的1.5 mL离心管。5.2.3.1.6 元RNA酶的荧光定量PCR管。5.2.3.1.7 元
21、RNA酶的带滤芯枪头。5.2.3.2 试剂5.2.3.2.1 商品化RNA提取试剂盒。5.2.3.2.2 反转录试剂盒，包括随机引物、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂。5.2.3.2.3 实时荧光定量PCR试剂盒。5.2.3.2.4 dNTPs(2.5 mmol/L each)。5.2.3.2.5 DEPC处理水。5.2.3.3 样品5.2.3.3.1 引物5.2.3.3.1.1 特异反转录引物针对坦布苏病毒的特异反转录引物，参见附录C。5.2.3.3.1.2 荧光RT-PCR引物和探针针对坦布苏病毒E基因的荧光RT-PCR引物和探针，参见附录Eo6 NY/T 3233-2018 5.2.3
22、.3.1.3 阴性对照阴性对照为正常细胞或背景清楚的SPF鸭组织。5.2.3.3.1.4 阳性对照使用坦布苏病毒FX2010株CCCTCCNO.V201032，参见附录。，或其他背景清楚的鸭坦布苏病毒株作为阳性对照。5.2.3.4 试验步骤5.2.3.4.1 病毒RNA的提取同5.2.2.5.105.2.3.4.2 病毒cDNA的合成使用针对坦布苏病毒的特异5.2.3.4.3 荧光RT-PCR反在实验室洁净区域，人到无RNA酶的荧2X荧光定量PCRFXV probeC 无RNA酶去总体积性对照，1L/管，荧光定量PCR仪个循环。启5.2.3.5.1 阔值设定原则准。阴性对照的5.2.3.5.2
23、 试验结果5.2.3.5.2.1 5.2.3.5.2.2 5.2.3.5.2.3 阴性。6 病毒特异性抗体检测6.1 鸭坦布苏病毒ELISA抗体检测6.1.1 耗材与仪器6.1.1.1 可拆卸ELISA酶标板。6.1.1.2 单道及多道微量移液器(配有吸头)。6.1.1.3 加样槽。6.1.1.4 酶标仪。6.1.1.5 冰箱:20C80C、一20.C、-800C。下列试剂依次加和阳7 NY/T 3233-2018 6.1.2 试剂6.l.2.1 PBS，见A.1。6.1.2.2 包被液，见A.80 6.1.2.3 ELISA洗涤液，见A.2。6.1.2.4 ELISA封闭液，见A.90 6.
24、1.2.5 ELISA终止液C2mo!/L)，见A.10。6.1.2.6 ELISA稀释液，见A.1L6.1.2.7 坦布苏病毒单抗1F5，参见附录B。6.1.3 试验步骤6.1.3.1 抗原包被将抗原(参见附录F)用包被液稀释为O.75周/0.1mL，每孔加入0.1ml,20C 80C放置15h 18 h，之后用洗涤液洗涤3次，每次3mino 6.1.3.2 封闭每孔加入新鲜配制的0.2mL封闭液，37C封闭1h，洗涤液洗涤3次，每次3min。6.1.3.3 血清稀释阴性血清、阳性血清(参见附录F)和待测血清用灭菌PBS稀释10倍。6.1.3.4 抗原与待测血清的作用将1:10稀释好(稀释液
25、见附录A)的待测血清和对照血清分别加人酶标板中，每孔0.1mL,37C 孵育1h;然后，洗涤液洗涤3次，每次3min。6.1.3.5 抗原与抗鸭坦布苏病毒单抗的作用将抗鸭坦布苏病毒单抗(参见附录B)稀释40倍，加人酶标板中，每孔0.1mL，370C孵育1h;然后，洗涤液洗涤3次，每次3min。6.l.3.6 与二抗作用用灭菌PBS将0.8mg/mL的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体稀释2000倍，稀释好的酶标羊抗鼠IgG抗体加人酶标板中，每孔0.1mL，370C孵育1h;然后，洗涤液洗涤3次，每次3min。6.l.3.7 显色反应加人TMB显色液，每孔0.1mL，室温，避光显色10min。
26、6.1.3.8 眼光度OD450测定与阻断率计算加入终止液，0.05mL/孔，终止反应，酶标仪读取吸光度OD剧。按如下方法计算阻断率:阻断率c%)=(阴性对照的吸光度一待测样品的吸光度)/阴性对照的吸光度X100。6.1.4 ELISA抗体检测结果判定6.1.4.1 试验成立的条件当阳性质控血清的阻断率二三50%，判定试验结果成立。6.1.4.2 试验结果的判定6.1.4.2.1 当血清样品的阻断率值二三18.4%时，该样品判定为鸭坦布苏病毒抗体阳性。6.1.4.2.2 当血清样品的阻断率值运12.6%时，该样品判定为鸭坦布苏病毒抗体阴性。6.l.4.2.3 当血清样品的阻断率值介于二者之间时
27、，判定为可疑，重新检测仍小于18.4%判为鸭坦布苏抗体阴性。6.2 鸭坦布苏病毒HI抗体检测6.2.1 耗材与仪器6.2.1.1 96孔U型微量板。6.2.1.2 单道及多道微量移液器(配有吸头)。6.2.1.3 加样槽。6.2.1.4 湿盒。6.2.1.5 振荡器冰箱:2.C8.C、一20.C、-80.C。6.2.2 试剂6.2.2.1 BABS，见A.12。6.2.2.2 棚酸氯化纳溶液，见A.12.6.2.2.3 O.33%鹅红细胞悬液配制，见A.13。6.2.3 HA效价测定6.2.3.1 鸭坦布苏病毒血凝抑制试验抗原，参见附录G。NY/T 3233-2018 6.2.3.2 取鸭坦布
28、苏病毒血凝抑制试验抗原样品，加人1mL BABS复原，待抗原完全融化成澄明液体后，进行HA效价测定。6.2.3.3 采用96孔U型微量板进行试验，反应总体积为100L。从第1孔至第12孔，用移液器每孔加入BABS50L，用移液器吸取被检样品50L，从第1孔起，依次作2倍系列稀释，至第11孔，弃去移液器内50L液体，第12孔为不加样的红细胞对照孔，然后每孔加人0.33%的鹅红细胞。6.2.3.4 立即在微量板振摇器上摇匀，放入湿盒，置37.C作用60min，观察凝集反应。结果判定:当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果，以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。6.2.4 HI效价测定6.2
29、.4.1 HA单位工作抗原液的制备。根据测定的血凝抑制试验抗原的HA效价，用BABS配制4个血凝单位的抗原。抗原配制完成应重新进行标定。6.2.4.2 应用96孔U型微量板进行试验，反应总体积为100L。用BABS将处理好的血清(待检血清前处理方法参见附录H)作2倍稀释。6.2.4.3 加人25L4个血凝单位的抗原工作抗原，充分振摇后，置湿盒内2.C8.C过夜。取出恢复至室温后，加人0.33%的鹅红细胞，混匀，放入湿盒，置37.C作用60min，观察凝集反应。6.2.4.4 试验设阴性血清对照、阳性血清对照、处理后的血清样品对照及红细胞对照。6.2.5 HI抗体检测结果判定6.2.5.1 试验
30、成立的条件当阳性对照血清出现明显的血凝抑制现象(红细胞于孔底呈扣状沉淀)，对照阴、阳性血清的HI效,价与已知效价相差不超过1个滴度时，试验结果成立。以使红细胞凝集被完全抑制的血清最高稀释度作为判定终点。6.2.5.2 试验结果的判定6.2.5.2.1 当出现2个孔以上血凝抑制(红细胞于孔底呈扣状沉淀)时，判为HI抗体抗性。6.2.5.2.2 当与阴性对照血清一样，没有任何血凝抑制孔出现时，判为阴性。6.2.5.2.3 当只出现1个孔有血凝抑制(红细胞于孔底呈扣状沉淀)时，判为可疑，需重复试验。如果不再有血凝抑制出现，则判为阴性;如果有2个孔以上血凝抑制，则判为阳性。7 鸭坦布苏病毒病综合判定7
31、.1 根据发病鸭临床症状、病理变化和病毒分离结果可以对鸭坦布苏病毒病做出初步诊断的基础上，NY/T 3233-2018 经细胞免疫荧光、RT-PCR和荧光RT一PCR3种检测方法任选其一，检测结果为阳性，即可诊断为鸭坦布苏病毒病。7.2 鸭坦布苏病毒ELISA抗体检测方法和HI抗体检测方法任选其一，检测结果为阳性，即可确定鸭群感染过鸭坦布苏病毒，或接种过疫苗。以上所有试验过程均应采取措施，防止检测过程交叉污染，参见附录I。10 附录A(规范性附录)溶液试剂配制A.1 磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01 mol/L,pH 7.4)的配制NY/T 3233-2018 称取8g NaCl、0.2g K
32、Cl、1.42 g Na2 HP04、0.27g KH2P04，加入0.8L去离子水溶解，调pH至7.4后，定容至1Lo 1210C高压灭菌后，元菌分装。A.2 PBST洗涤液(ELISA洗涤液)的配制在1000mL PBS中加人0.5mL Tween-20，混匀、分装备用。A.3 含10倍双抗PBS的配制在90mL PBS中加人10mL青霉素-链霉素溶液(1万U/mL)，混匀、分装备用。A.4 细胞培养液在DMEM培养液中加入5%FBS、1%双抗溶液(1万U/mL)和L-谷氨酷股(4.0mol/L)溶液，用于DF-1细胞培养。A.5 病毒感染维持液在DMEM培养液中加入2%FBS、1%双抗溶
33、液(1万U/mL)和L谷氨酷胶(4.0 mmol/L)溶液，用于病毒感染后的细胞维持。A.6 50XTAE储存液配制分别量取Na2EDTA.2H20 37.2 g、冰醋酸57.1mL、Tris Base 242 g，用一定量的灭菌去离子水溶解。充分混匀后，加灭菌去离子水补齐至1000mL。使用时，取20mL 50XTAE储存液，加入980mL去离子水，制成1XTAE缓冲液。A.7 1%琼脂糖称取1.0g琼脂糖，倒人耐热玻璃三角瓶内，再加入电泳缓冲液(1X T AE)100 mL，轻轻混匀后加热，使琼脂糖完全熔化。待琼脂糖胶温度降至50oC60oC，加入核酸染料5L，轻轻混匀(不要产生气泡)。将
34、其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固(30min60 min)之后，将梳子拔出，备用。A.8 包被液(50mmol/L)称取Na2C031.59 g,NaHC03 2.93 g，加人990mL去离子水溶解，调pH至9.6，用去离子水定容至1000mL。A.9 ELISA封闭液灭菌PBS100 mL，加人3g脱脂奶粉，混匀。11 NY/T 3233-2018 A.10 ELISA终止液量取去离子水800mL，向其中缓慢滴加98%浓硫酸108.7mL，用去离子水定容至1000mL，混匀。A.11 ELISA稀释液称取KH2P040.27 g,Na2HP04 1.42 g,NaCl 8 g,KC
35、l o.2 g，溶于900mL去离子水，加入100L硫柳束，调pH至7.2，用去离子水定容到1000mL。用0.22m滤器除菌，元菌分装备用。用于稀释阻断用单抗、酶标羊抗鼠IgG抗体和各种血清。A.12 珊酸氯化纳缓冲液和取棚酸4.42g，氯化铀溶液。再取牛血清白蛋A.13.3 心5min,心10min,12 H为9.0形成棚酸氯化铀4.96 g，去离子水00 r/min离制成工作NY/T 3233一2018附录B(资料性附录)免瘟荧光检测方法中所用坦布苏病毒的单抗B.1 坦布苏病毒单抗的来源鼠源单抗1F5，由中国农业科学院上海兽医研究所制备并提交中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保
36、藏号为CCTCCNO.C201220,CCTCC地址为:湖北省武汉市武昌珞咖山(武汉大学)。该单抗可由中国农业科学院上海兽医研究所提供，对100TCIDso.鸟坦布苏病毒(FX2010)的中和效价注1:10。B.2 坦布苏病毒单抗涉及的专利信息该单抗涉及以下专利:a)一种鸭黄病毒及其疫苗、试剂盒。专利号:CN 102533668A，专利公布日:2012.07.04。专利申请人:中国农业科学院上海兽医研究所。b)抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用。专利号:CN 102586193B，专利公布日:2013.06.19。专利申请人:中国农业科学院上海兽医研究所。13 NY/T 3233
37、-2018 C.1 阻2010坦布苏病毒的来源FX2010坦布苏病毒，典型培养物保藏中心(兽医研究所提供，由9日TCID50/mL。C.2 14 附录C(资料性附录)阳性对照病毒(FX2010)离并鉴定，保藏于中国可由中国农业科学院上海心所得，病毒滴度105NY/T 3233-2018 附录D(资料性附录)样品的采集、处理、运输及保存D.1 仪器设备与耗材D.1.1 生物样品均质研磨仪。D.1.2 台式高速冷冻离心机。D.1.3 低速大容量离心机。D.1.4 可调移液器:2L、20L、200L、1000L。D.1.5 高压蒸汽灭菌器。D.1.6 元菌注射器:lmL、5mL。D.1.7 高压灭菌
38、的剪刀、慑子。D.1.8 元菌离心管:1.5 mL、15mL、50mL。D.1.9 一次性洁净塑料自封袋。D.1.10 一次性手套、口罩、帽子。D.1.11 涡旋振荡器。D.1.12 元菌钢珠。D.1.13 冰箱:2.C8.C、一20.C、-80.C。D.1.14 细胞培养箱。D.1.15 细胞培养瓶、12孔细胞培养板。D.1.16 荧光显微镜。D.2 样晶采集可采标NY/T541-2016.采样和样品前处理过程中应戴一次性手套、口罩、帽子，采样过程中样品不得交叉污染。a)组织样品:采集死亡禽或发病禽的肺脏、脾脏、肾脏、卵巢叹口有)等组织，采集病料时，用无菌的剪刀剪取组织样品(不同组织样品使用
39、不同的元菌剪刀)，将样品装人一次性灭菌的50mL离心管或一次性洁净塑料自封袋，密封、编号，待检。b)血清样品:用元菌注射器采血1mL后，将其注人1.5 mL灭菌的Eppendorf管中，于37.C静置2h。分离血清，将血清转入新的灭菌的1.5 mL离心管中，加盖、编号，待检。c)细胞培养上清液:直接将细胞培养上清液加入到灭菌的1.5 mL离心管中，加盖、编号，待检。d)鸡胚尿囊液:直接将鸡胚尿囊液加入到灭菌的1.5 mL离心管中，加盖、编号，待检。以上在样品制备区进行。D.3 样品处理D.3.1 组织样晶取待检组织样品1.0 g2.0 g，置于灭菌研钵中充分研磨，每克组织加人1mL含10X青霉
40、素链霉NY/T 3233-2018 素双抗PBS溶液，充分混合后转人离心管。或将组织置于特定的离心管中，按每克组织加入1mL含10X青霉素链霉素双抗PBS溶液和无菌钢珠，用高通量组织捣碎仪充分捣碎。经研磨或经组织捣碎仪捣碎的样品在4.C下10000r/min离心10min，将上清液转人灭菌的1.5 mL离心管中，依据原样品的编号相应地编号。D.3.2 血清、细胞培养上清液和鸡胚尿囊液将血清或细胞培养物在4.C下10000r/min离心10min，将上清液转人灭菌的1.5 mL离心管中，依据原样品的编号相应地编号。D.4 样晶运输与保存将上述采集的样品封，送实验室检测。经上述一80.C冰箱中，1
41、6 料袋)，于保温箱中加冰袋、密h;若需长期保存，应放在NY/T 3233-2018 附录E(资料性附录)坦布苏病毒特异反转录引物、RT-PCR、荧光RT-PCR的引物和探针E.1 坦布苏病毒的特异反转录引物FXV-RT primer:5-A TCTCTGTGA TGCYCC-3(序列中含有的简并碱基Y=T/C)。E.2 坦布苏病毒RT-PCR检测引物见表E.1。表E.l坦布苏病毒RT-PCR检测引物引物序列(53，上下两行分别引物名称为上下游引物序列)*DTMUV-F AGACTGCTGGTGCAATGARAC DTMUV-R CGTCGTTCCCARRTTCCA.序列中含有的简并碱基R=A
42、/G。E.3 坦布苏病毒荧光RT-PCR检测用引物和探针见表E.2。产物大小，bp250 表E.2荧光RT-PCR检测用引物和探针引物名称引物序列(53，上下两行分别产物大小，bp为上下游引物序列YDTMUV-EF TGTC寸ATGCAGGTACYGATG基因用途PrM RT-PCR 基因用途DTMUV-ER CGTATGGGTTGACTG1寸ATCA115 E 荧光RT-PCRFXV probe FAM-AGTTCCCATATCCATGTC-TAMRA.序列中含有的简并碱基Y=T/C。E.4 引物和探针的稀释开盖前，将新合成的引物或探针进行短暂离心02000r/min,30 s);用DEPC
43、处理的灭菌去离子水溶解，加水量为10X总纳摩尔数(例如，合成引物或探针1OD,4.5 nmol，则加水量为10X4.5=45L)，充分混匀，此时引物或探针的浓度为100mol/L，可作为储存液，一200C或200C以下保存;使用时，将100 mol/L的引物或探针储存液用DEPC处理的灭菌去离子水进行10倍稀释，配制浓度为10mol/L的引物或探针使用液，一200C或一200C以下保存。E.5 荧光RT-PCR引物及探针涉及的专利信息一种鸭黄病毒及其疫苗、试剂盒。专利号:CN 102533668A，专利公布日:2012.07.04。专利申请人:中国农业科学院上海兽医研究所。本标准中所用的荧光R
44、T-PCR引物和探针在上述专利的基础上做了简并引物的优化。17 NY/T 3233-2018 F.1 ELISA包被抗原质量标准本品系用鸭坦布苏病毒清液，用2%。甲醒灭活，检测。E性状】150C以下【元菌检验】按【效价测【作用与用F.2阳合，在370C中3TC作用1h后，5 d，观察并记录细CPE，而中和孔与【作用与用途】用E规格】0.2mL/管。E储藏与有效期】-150CF.3 阴性血清质量标准附录F(资料性附录)ELISA抗原和血清标准,36 h48 h收获感染细胞的上坦布苏病毒ELISA抗体，分离血清，50 阳性血清混0.1 mL。在培养箱中培养毒对照孔应产生本品系用SPF鸭蛋孵化的鸭，
45、在隔离器中饲养至4周龄8周龄，采血，分离血清，一150C以下保存。用于鸭坦布苏病毒ELISA抗体检测。18【性状】-150C以下，淡黄色固体，室温下可融化。【无菌检验】按现行中国兽药典附录方法进行检验，应无菌生长。【效价测定】用中和试验测定，对100ELDso鸭坦布苏病毒FX2010株的中和效价不高于1:20【作用与用途】用于鸭坦布苏病毒ELISA抗体检测。【规格】0.2mL/管。【储藏与有效期】-150C以下保存，有效期12个月。NY/T 3233一2018附录G(资料性附录)鸭坦布苏病毒血凝抑制试验抗原G.1 血凝抑制抗原来源系用鸭坦布苏病毒CDuckTembusu Virus)HB株(简
46、称DTMUV-HB株)脑内接种乳鼠培养，收获感染脑组织，匀浆，煎糖-丙酣处理，经甲醒灭活后，加冻干保护剂，真空冷冻干燥制成。用于鸭坦布苏病毒HI抗体的检测。G.2 涉及的专利信息该血凝抑制抗原的处理方法涉及以下专利:一种鸭坦布苏病毒病血凝抑制试验抗原及其制备方法。专利号:CN 201610096524.4，专利公布日:2016.07.27。专利申请人:北京市农林科学院。19 NY/T 3233-2018 附录H(资料性附录)HI抗体检测的鸭血清处理方法H.1 待用于HI抗体检测的鸭血清处理方法H.l.1 25%白陶土配制:白陶土25g，棚酸氯化铀溶液100mL，充分摇匀。H.l.2 血清100
47、L，400L 25%白陶土。H.1.3 剧烈振荡血清-白陶土混合物，每5min振荡一次，共20mino H.1.4 1500 r/min离心，20min。H.1.5 加人100L10%鹅红细胞悬液。H.1.6 每隔5min轻轻摇动上层清液，使红细胞保持悬浮状态，共20mino H.1.7 800 g离心10min，红细胞沉积于白陶土上层。H.1.8 将上清液移入新管中，此液体视为1:5稀释的待检血清。H.2 HI抗体检测方法涉及的专利信息该HI抗体检测方法涉及以下专利:一种鸭坦布苏病毒病疫苗的效力检验方法。专利号:CN 201610169370.7，专利公布日:2017.05.24。专利申请人
48、:北京市农林科学院。20 6 NY/T 3233-2018 附录I(资料性附录)检测过程防止交叉污染的措施1.1 制样过程制样工具应清洗干净，1210C高压灭菌20min，一套洁净工具限于一份样品使用。存放样品的容器应经过清洗、高压，或为一次性灭菌容器。1.2 检测过程1.2.1 PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区和后PCR区。将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从洁净区到污染区单向进行。1.2.2 实验过程中，必须穿戴实验服和手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。1.2.3 各区所有的试剂、器材(尤其
49、是移液器)、仪器都应专用，不得带出该区。1.2.4 所有溶液、水、耗材和器具应1210C高压下蒸汽灭菌20min，避免核酸和/或核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馆的双蒸水。在200C250C储存的试剂中，可加人0.025%的叠氮铀。所有试剂应以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行储存。1.2.5 DNA模板或引物的离心管打开之前，要短暂离心。离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。1.2.6 前PCR区中，应在PCR操作台中加入PCR反应各组分。1.2.7 实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNAo1.2.8 可使用dUTP/UDG法控制污染。1.2.9 应遵循PCR操作的其他要求:WS/T230一2002，6污染的预防和控制。21 goN-SN凹HFZ噜.，ia中华人民共和国农业行业标准鸭坦布苏病毒病诊断技术NY/T 3233-2018*中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼(邮政编码100125网址)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销*头*开本880rnrnX1230rnrn 1/16 印张1.75 字数35千字2018年8月第1版2018年8月北京第1次印刷书号16109 4515 定价42.00元长9导版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 NY/T 3233-2018