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1、ICS 65.020.30 B 41:才叫中华人民共和国水产行业标准SC/T 7237一2020虾虹彩病毒病诊断规程Code of diagnosis for infection with Decapod iridescent virus 1 2020-08-26发布2021-01-01实施/巳气中华人民共和国农业农村部发布本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所。本标准主要起草人邱亮、梁艳、黄债、陈蒙蒙、杨冰、万晓援、张庆利。SC/T 7237-2020 I SC/T 7237-2020 虾虹彩病毒病诊断规程范围本标准给出了
2、虾虹彩病毒病(infectionwith Decapod iridescent virus 1)诊断所需试剂和材料、器材和1设备、临床症状，规定了采样、组织病理学检测、套式PCR检测和综合判定的要求。本标准适用工阳忻扭叫2 规范性引用文件下列1千元凡是不注日期的引GB/T 28630 3 缩赂语下列bp:DIV1:DNA:dNTPs:EDTA PCR:SOS:Taq酶Tris:TE:Tris 4 试剂和材料4.1 除非另有说明，4.2 二甲苯:分析纯。4.3 石蜡(熔点520C544.4 中性树胶。4.5戴维森氏AFA(Oavidsons4.6苏木精染色液见A.204.7 1%伊红储存液，见A
3、.30 4.8 1%焰红储存液见A.404.9 伊红-焰红染色液:见A.50 4 10 粘片剂:见A.6。4 11 元水乙醇分析纯。4 12 95%乙醇分析纯。4 13 85%乙蹲.见A.70 4.14 80%乙醇:见A.8。SC/T 7237-2020 4.15 75%乙薛见A.90 4.16 50%乙醇见A.100 4.17 组织病理学检测阳性对照为感染DIV1且有明显病理变化的对虾头胸部组织切片。4 18 组织病理学检测阴性对照为未感染DIV1的正常对虾头胸部组织切片。4.19 TE缓冲液见A.ll。4.20 抽提缓冲液:见A.1204.21 蛋白酶K见A.1304.22 10 mol/
4、L乙酸钱见A.140 4.23 Tris饱和盼(pH7.8)，分析纯。4.24 盼/氯仿/异戊蹲(25 24 1)分析纯。4.25 氯仿/异戊蹲(24 1)分析纯。4.26 dNTPs(各2.5 mmol/U，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物，一200C保存。4.27 10XPCR缓冲液，无Mg2+，随T叫酶提供，一200C保存。4.28 MgCl,(25 mmol/U，一200C保存。4.29 T，q酶(5U/U，-200C保存。4.30 套式PCR使用2对引物，引物浓度为10mol/L。其中，外侧引物F1和Rl，扩增457bp片段;内侧引物F2和R2，扩
5、增129bp片段。引物序列如下引物F1,5-GGG-CGG-GAG-ATG-GTG-TTA-GAT-3;引物R1,5-TCG-TTT-CGG-TAC-GAA-GAT-GTA-3;引物F2，5-CGG-GAA-ACG-ATT-CGT-ATT-GGG-3;引物R2，5-TTG-CTT-GAT-CGG-CAT-CCT-TGA-3 0 4.31 以十足目生物DNA中的848bp片段为内参。引物浓度为10mol/L，序列如下.引物F3，5-TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-T寸G-TAG-3;引物R3，5仁TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC扩。注N表示G、A、T
6、或C。4.32套式PCR检测阳性对照为已知感染DIV1且套式PCR结果显示阳性的对虾组织样品，-800C 保存。4.33 套式PCR检测阴性对照为已知未感染DIV1的对虾组织样品，-800C保存。434 套式PCR检测空白对照为水。4.35 50X电泳缓冲液:见A.15。4.36 1X电泳缓冲液:见A.16。4.37 琼脂糖:生化试剂。4.38 DNA分子量标准:生化试lfiL4.39 6X载样缓冲液生化试剂。4.40 电泳核酸染料.生化和J剂。5 器材和设备5.1 切片机。5.2 组织脱水机。5 3 包埋机。54 染色机。5.5 展片机。2 SC/T 7237-2020 5 6 平板烘片机。
7、5.7 光学显微镜。5.8 恒温箱5.9 PCR1义。5 10 电泳仪。5.11 水平电泳梢。5.12 紫外观察仪或凝胶成像仪。5.13 高速冷冻离心机。5.14 水浴锅或金属浴。5 15 普通冰箱。5.16-80.C超低温冰箱。5.17 电炉或微波炉。5.18 微量移液器。6 I恼床症状濒死的虾失去游动能力，沉入池底。发病个体的肝膜腺萎缩、颜色变浅，空肠空胃。患病罗氏沼虾的额剑基部组织呈典型的白色病变。部分患病凡纳滨对虾出现红体症状。随着病程的发展，表现出高死亡率。参见附录B。7 采样7.1 采样对象凡纳滨对虾(Lito户enaeusvanamei)、罗氏沼虾(Macrobrachiumro
8、senbergii)和克氏原整虾(Procambrus clarkii)等易感宿主。参见附录B中的B.3.7.2 采样数量、方法和保存运输应符合GB/T28630.4-2012中附录B的要求。7.3 样品的采集7.3.1 组织病理学检测时，采集造血组织、怨和肝腕腺。7.3.2 套式PCR检测时，仔虾采集除II球和H柄外的完整个体;幼虾至成虾阶段采集头胸部(虫草、肝JFn腺、造血组织)、附肢或血淋巴。亲虾的非致死检测采集血淋巴、附肢或粪便。仔虾可以合并样本检测，个体稍大的虾可按个体进行检测。所取样品分别置于1.5 mL离心笛中，立即进行DNA提取操作或暂时保存于一20.C。B 组织病理学检测8.
9、1 样品准备样品固定方法和切片前的取材修整，应符合GB/T28630.4-2012中附录B的要求。8 2 脱水75%乙蹲(1h 45 min)85%乙醇(lh 45 min)85%乙醇(1h 45 min)95%乙醇(45min)95%乙醇(45min)无水乙碎(45min)无水乙醇(45min)。8.3 透明无水乙酶二甲苯(l,1)(25 min)二甲苯(20min)二甲苯(20min)。8.4 浸蜡纯石蜡(lh 20 min)纯石蜡(1h 20 min)。8.5 包埋3 SC/T 7237-2020 用包埋机进行包埋.8 6 切片用切片机切片，厚度5m。对每个石蜡包埋块至少切取2块不连续的
10、切片。8 7 展片展片机(40C)中展片，用涂有一层粘片剂的载玻片捞出，置于平板烘片机45C烘片2h.8.8 染色二甲苯(5min)二甲苯(5rnin)元水乙蹲(2min)无水乙醇(2rnin)95%乙醇(2min)95%乙醇(2 min)80%乙醇(2rnin)80%乙蹲(27./(2 min)苏木精染色液(5(1 min 20 s)95%乙蹲(2(2 min 30 s)二甲苯(28.9 封片8.10 9 9.1 DNA 9.11取f坚阳性对照、9.12 9.13 两相。9.1.4 10 000 r/min离心9.15 水相移至离心1min分离两相。9.16 水相移至一新L水乙蹲(-20C)
11、混匀，-20C9.17 用70%乙蹲洗涤沉淀2次，晾干。9.1.8 加入100L灭菌双蒸水溶解DNA，待用.min)蒸馆水(2rnin)蒸f留水(2min)蒸馆红染色液(2min)95%乙醇同时设5 min，弃上清液。DNA沉淀于室温9.19 若DNA样品需要保存，可溶解于100LTE缓冲液中并保存于20C。9.110 可以采用同等拍提效果的其他方法或使用商品化DNA抽提试剂盒。9.2 套式PCR扩增9.2 1 套式PCR反应体系按照表l的要求，加入除Taq酶以外的各项试剂，推荐配制成大体积的预温液，分装保存于20C.I陆用前，加入相应体积的Taq酶，混匀，按24L/反应分装到O.2 mL P
12、CR管中.加入样品的模板DNA(浓度250ng/L)1L，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。4 SC/T 7237-2020 表1套式PCR扩增的第一步PCR反应预混液所需试剂组成试剂25L体系试剂终浓度10XPCR缓冲液(元Mg+)2.5L 1X PCR缓冲液MgCI,(25 mmol/Ll 2L 2 mmol/L dNTPs(各2.5mmol/L)2L 200mol/L 外侧引物F100mol/UlL 0.4mol/L 外但l引物R1(lOmol/L)1L O.4mol/L 灭菌双蒸水15.25L Taq酶(5U/IL)0.25L 1.25 U 9.2.2 将上述加有DNA模板的PCR管
13、按以下程序进行第一步PCR扩增，950C预变性3min，950C变性30 5、590C退火305，720C延伸30 5.35个循环，720C延伸5min，40C保温。9.23 按照表2的要求，配制除Taq酶以外的大体积预混液，分装保存于一20oCo临用前，加入相应体积的Taq酶，混匀，按24L/反应分装iiJO.2 mL PCR宫中。将1L第一步反应产物作为第二步PCR反应模板，扩增程序为，950C预变性3min，950C变性305、590C退火305、720C延伸205.35个循环，720C延伸2min，40C保温。表2套式PCR扩增的第二步PCR反应预混液所需试剂组成试剂25L体系试剂终浓
14、度10X PCR缓冲液(元Mg+)2.5L l X PCR缓冲液MgCI,(25 mmol/L)2L 2 mmol/L dNTPs(各2.5mmol/Ll 2L 200mol/L 内侧引物F200mol/Ll1L 0.4mol/L 内侧引物R200 mol/L)lL 0.4mol/L 灭菌双蒸水15.25L Taq酶(5UILl O.25L 1.25 U 9.2 4 每份样品均设立十足目生物内参对照，扩增十足目生物组织DNA的PCR反应体系按照表3的要求。加入样品的模板DNA(浓度为50ng/fLL-100 ng/L)1Lo扩增程序为，940C预变性4min,940C 变性1min、550C退
15、火1min、720C延伸1min.35个循环，720C延伸5min，40C保温。表3扩增十足目生物组织DNA的PCR反应体系试剂组成试剂25L体系试剂终浓度10XPCR缓冲液(无Mg+)2.5L l X PCR级冲液MgCI,(25 mmol/U 1.5L 1.5 mmol/L dNTPs(各2.5mmol/Ll 2L 200mol/L 内参引物F300mol/Ll2.5L Imol/L 内参引物R300mol/L)2.5L lmol/L 灭菌双蒸水12.75L Taq酶(5UIL)0.25L 1.25 U 9.3 琼脂糖凝胶电泳及自序9 3.1 使用1X电泳缓冲液配和2%-2.5%的琼脂糖凝
16、胶，待凝胶冷却至低于WC时，按比例加入电泳核酸染料，摇匀，制备琼脂糖凝胶。9.3 2 将5LPCR反应产物与lL6X载样缓冲液混匀后加入到加样孔中。同时设立DNA分子盘标准对照。9.3.3 在1X电泳缓冲液中1V/cm-5 V/cm的电压下电泳，使DNA由负极向正极移动。当载样缓冲液中澳盼ili指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的2/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照。9 3.4 如果观察到预期大小条带，对检测样品的PCR扩增产物进行测序。5 SC/T 7237-2020 9.4 结果判定9.4.1 内参对照在848bp处有特定条带，阳性对照第一步PCR后在457bp和/或
17、第二步PCR后在129bp处有特定条带、阴性对照在457bp和129bp处均无条带，且空白对照不出现任何条带，实验有效。9.4.2 检测样品第一步PCR后在457bp处有条带和/或第二步PCR后在129bp处有条带，且PCR产物测序结果符合附录D的参考序列，可判断为套式PCR结果阳性;检测样品第一步PCR后在457bp处无条带且第二步PCR后在129bp处无条带，可判为套式PCR结果阴性。10 综合判定10.1 疑似病例的判定符合以下一条及以上，判定为疑似病例a)易感虾类发病表现出典型的临床症状sb)具有典型的组织病理学特征;c)套式PCR结呆显示阳性。102 确诊病例的判定具有临床症状和组织
18、病理学特征且套式PCR结果阳性，判定为确诊病例。6 A.l A 2 A.3 A.4 95%乙醇甲it!(37%)冰醋酸水混匀焰红B(水溶性)水溶解后置于棕色瓶中，A5 伊红-焰红染色液1%伊红储存液1%焰红储存液95%乙酶冰醋酸混匀后即可使用，室温储存。A.6 精片1fiJ明胶热水溶解后，加入:附录A(规范性附录)试剂配方100 mL 10 mL 780 mL 4 mL 1 g 100 mL SC/T 7237-2020 7 SC/T 7237-2020 苯盼甘汹I昆匀，在棕色瓶中室温储存。A.7 85%乙醇95%乙醇j10水定容至?昆匀，室温储存。A.8 80%乙醇95%乙醇JJD水定容至混
19、匀，室温储存。A 9 75%乙醇95%乙醇JJD水定容至1昆匀，室温储存。A 10 50%乙醇95%乙醇加水定容至混匀，室温储存。A.11 TE缓冲液(pH8.0)1 mol/L Tris HC1(pH 8.0)0.5 mol/L EOTA(pH 8.0)JJD7l定容至高压蒸气灭菌，4C储存。A.12 抽提缓冲液1 mol/L Tris HC1(pH 8.0)0.5 mol/L EOTA(pH 8.0)1 mg/mL膜RNA酶10%SOS 加水定容至?昆匀，室温储存。A.13 20 mg/mL蛋白酶K蛋白酶K水2 g 15 mL 850 mL 950 mL 800 mL 950 mL 750
20、 mL 950 mL 500 mL 950 mL 10 mL 2 mL 1000 mL 1 mL 20 mL 2 mL 5 mL 100 mL 20 mg 1 mL 溶解后分装于无菌离心管中(0.25mL/管)，一20C下保存。A.14 10 mol/L乙酸钱乙酸钱8 77 g 71 30 mL 加水定容至100mL，经O.45m滤膜过滤除菌。4C储存。A.15 50X电泳缓冲液Tris 0.5 moi/L EDTA(pH 8.0)冰乙酸加水定容至室温储存。A.16 1 x电泳缓冲液50X电泳缓冲液加水定容至室温储存。242 g 100 mL 57.1 mL 1 000 mL 20 mL 10
21、00 mL SC/T 7237-2020 9 SC/T 7237-2020 B.1 虾虹彩病毒病的发生与流行虾虹彩病毒病是由命名为十足目虹彩病毒l(C Decapodiridovirus)B2 170 CQIV)有1我国主要甲DIV1 性包涵体，B.3 宿主rus clarkii 10 附录B(资料性附录)虾虹彩病毒病(infectionwith DIVl)世界病毒分类委员会将其病原足目虹彩病毒属出空l汤空胃，肝M腺萎壳下的造血组kbp的双链SC/T 7237-2020 附录C(资料性附录)虾虹彩病毒病组织病理学图例患虾虹彩病毒病的罗氏沼虾(a，b)、脊尾白虾(c，d)和凡纳滨对虾(e，O的组
22、织病理变化见图C.1，健康对虾组织切片见图C.2,注，.图a.H-E染色，标尺。20m.肝腕腺血窦内的血细胞中出现混合有嗜碱性做粒的嗜酸性包涵体(自箭头)，并伴随有细胞核的回缩(黑箭头)。注2.图b，H-E染色，标尺:50m.自思丝内血细胞中出现混合有嗜碱性微粒的嗜酸性包涵体(臼箭头)，并伴随有细胞核的固缩(黑箭头)。注3:图c，H-E染毡，标尺，50m。造血组织的细胞中出现混合有嗜碱性微糙的嗜酸性包涵体(白箭头)，并伴随有细I胞核的困缩(黑箭头).Hm示造血组织。注4图d，H-E染色，标尺。20m.角质层下的上皮细胞中出现1日合有嗜碱性微粒的嗜酸性包桶体(自箭头)，并伴随有细胞核的固缩(黑箭
23、头)，Hm示造血组织，Cn示结缔组织，Ep示上皮细胞。注5:图e和r.H-E染色，标尺，5m，白色箭头所示为混合有嗜碱性微糙的嗜般性包涵体e图C.l11 SC/T 7237-2020 12 注1.图a，H-E染色，标尺50m.HpS示肝腕腺血窦，HpT示j忏脱脱小管.注2:图b，H-E染色，标尺20m.注3.图c，H-E染色，标尺50m.Hm示造血组织，m示正在进行有丝分裂的细胞.注4:图d，H-E染色，标尺50moCn示结缔组织，Ep示上皮细胞.圈C.2SC/1 7237-2020 附录D规范性附录)DIVl套式PCR检测产物序列1 GGG:;GGAGA TGGGTIGAGGGCAGTCAG
24、GA:rGAACC AAfITGCTGAC GAAArC应CAF1 61 GT寸CGGGAACG1AAGGGTcrcAlCGGGAA ACGATTCGTf T丁GGGcrcGAGAITTGTTC汇F2 121 AA;AGGAAA GGAAA;AAAGAAATIDC士IT口CAAAITCAC厄GAITTGCAACA 181 AGCT元AGCAAlCAAGGATGC3用CAAGCAACGTGGAA刀A血CAGGGTXT汇ATR2 241 TCGAAAGTAC ATCAAACAT GAAAACGAIT GCCC囚TTGAfXITTGAAGAA CAAATGAAAC 301 AGAAAACAIT CC
25、CCATGGAT AAAAAIT丁CACAGAAAAGATCCCGAAATG GlAAAxc 361 GGCTTGGlTC口河TCAGAGATGGAAGA C国CAGGAAG丁GTGAAAITGAGAGCCAG 421 AGAGTAC GGAGC沌CACTTC刀11￥二GAAA;AR1 注:J线处为引物序歹J.13 ONON-BNh Hhv 4陪中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼(邮政编码100125 网址:呐叽N)化学工业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销*印张1.25 字数25千字2020年12月北京第l次印刷峰开本880mmX1230mm 1/16 2020年12月第1版书号16109 8360 定价32.00元4峙版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 SC/T