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1、ICS 65.020.30 B 41:才:中华人民共和国水产行业标准SC/T 7235-2020 罗非鱼链球菌病诊断规程Code of diagnosis for tiIapia streptococcosis 2020-08-26发布2021-01-01实施?YJ中华人民共和国农业农村部发布SC/T 7235-2020 J=口SC/T 7235-2020 罗非鱼链球菌病诊断规程范围本标ii给:1:V 11 链球Fi-ij,i:;i纠JiliJ1,I,;:kc剂和材料、6N材和设备、II(r冰川状，规定了采样、纠1州分，l.j 纯化脑养、也JII!-I化鉴j二、PCR检测与纺、含户Ij);j二
2、匀lTIk。本标IfHii)1I F V!H(I f4f 1拘捕的2 规范性引用文件下列文fl刘r水x11儿是不注I!J(巾IJ I川GI主4789.9食，ltGB 1789.28 SC/T 701 SC/丁7201.3 缩略语dNTP,EDTA:/-1，0，过PCR,*SDS,1 Nf:i，JU-I棚热lTris:一Jf11 Ji氨基1J1V.p，伏-lt反应(Vogcs 4 试剂和材料问II!圳的版本远)IJF4:xfl。4.1 除二11另有说IYI，标时I:t使)1J(I(j;j();占i111水、去72子水或与其中rI均纯1立的水。4.2 16S rRNA iU王1J-o列打tf吁，m
3、如27F，5-ACACTTTCATCM丁CCCTCAC-3,H921，5 TACC CYTACCTT(川、JACCAC1T3.-20C且.(7-.4.3 dNTP，(各10mmol/U，合dATP,c/J 丁P、dCTP、dCTP轩10mmol/I.的混合物，-20C似存.4.4 10 X PCR级叫I!li.无Mg芮子，一20C保存。4.5 二FDN八综合同f(5U/J.)，-20C似存。4.6 纠11llE!:化将j二价或生化鉴定札商品化i剂。4.7 11由心以前支队J1m jJ;(JHJ lli养i.hl附及八1的A.I，4.8 1(1l琼脂、l饭IJI.八2，SC/T 7235-202
4、0 4.9 Tt:缓冲液(pH8.0)见A.304.10 10%SDS浴液见八七4.11 蛋白内J1(20 mg/ml.l见A.5.，4.12 CTAI:l/NaCJ附液见A.604.13 50X丁At:电泳缓冲液见A.70 4.14:l%.1氧化氢(H2(2)在被见A.84.15 半|舌|体lJiOj旨胁利合G1:l1789.28-2013 rl 2.8的规定。5 器材和设备5.1)也斤.，工作台705.2 生物显1)投镜。5.3 PCR扩增仪。5.4 rl:l泳仪及水平11:泳梢。5.5 凝胶成像仪。5.6 微量移扫支持。5.7 涡旋振荡器。5.8 tN j1U养箱。5.9/1.心机。5.
5、10 微生物检测其他辅助设备和部械应俨j合SCj、7201.-2006 1第4 1益的要求。6 临床症状丛，rj罗非鱼缺乏而力，行动缓恨，食欲减退，Tl附11游于水而，死1ij出现间断性和加了、翻滚或转闹。fi病鱼l丰色发了l去，单侧或双侧11tH求突出，IIRJ，R充1(11.，角膜肖11，JD门幻)JI0 m也荒J:kJ伽l和l下缘、胸路基i耶和体表其他部位有:1:1(11现象。有lI.j急性忠病鱼无IYllID.外部症状。!再削可见肝脏淤1(11.，严重11才有坏死灶;JW)JI:)jl 大，里H拍幻包;)I!l我)JI大，肠道积水。岁二11工鱼链.f3Rl拙病的流行特点参见Ilf;I二
6、i13 1的13.1 0 7 采样7.1 采样对象罗非鱼及其坐、和l(参见日2l。7.2 采样数量j豆:r合SC/丁7014-2006中6.1的规定。7.3 个体要求应:r:J合SC/丁7014-2006.1 6.2的规定。B 细菌分离与纯化培养以无fij操作为-式，分刀11从)J由、肾脏、月1川、)Jq!)JIi气;mf=:组织中取少TIf组织;如l线接种于Ifr琼脂平板(见八2l，280C:lOC倒jl珩养21h18 h。待l主:J:在i#tJ舌，用无I基it正利:11、挑J1j(lyl个声H在接利l二fJ拙i心设l肉汤培养il;平板(见A.l)仁，28C30Cf:且IJ111:!ff养2
7、1.1h，可Z复划线至少3次，直至困落完全纯化。9 生理生化鉴定9.1 革兰氏染色应:n合SC/T7011-2006 1 9.3的规定。9.2 运动性试验2 SC/T 7235-2020 f午检E自iiilJ.t主种f、1!1;lfH;(JJrr.28.Clf1Jf48 h.9 3 糖类醇类发酵试验川拔和l到;挑收ly个I洛少F.分jjlft正事l邱胖、I11梨胖、刷子圳、平L圳、生1抑、7).杨-，、Mj览:tm、re:l圳、似有d圳、淀粉10中I:&fi手试!J母28C J口Jf24 h J可观察。9 4 七叶青水解试验lS检:rl株战种l七I叶利JiJJ，l(见八日)，:l5C将Jf21
8、 h J百现然。9.5 过氧化氢酶(接触酶)试验挑l仅衍检Iit品r7MMI(j我破J:-L.向JJliill坡的3%jJr化氢11于Il(见A.8).观察14平HJ气j包产1士。9.6 CAMP试验:i(1I琼1Ji甲板仁，先将金111:rlf.闲钱不得利|拔.lll同39.7 V.P 试验应钓台叹!丁709.8 精氨酸水挑战，y个1;f;99马J).f斗合9.10 表型和9.10.1 分离反1也项I结=*，两Y该线iPdUTI古l核非j.ji)llj、拍f.(j、k;乳化f内If:i7声，反).ii.fji11 f，i-!.+反j也项11fJ，耳;9.10.3 分离背l例，(EIJ心泣被.
9、J3;OH:;li白养-1;1;L 28C 30.C1);J 18 h J污.形成lkLI包、汹汹、材乳化的l梢部!f;叫小币兰氏染包为|斗111:.生;哩!生化试验结果与-ld利!衍，可和J!bf1j1J向J陈俊球ilii。注向豚链球的(IJ:PI!生化鉴定II采川川等雄主il放架的商品3 SC/T 7235-2020 表3每豚链球茵的生1里生化特征!豆l、iiJ虫11结果反Ili.J1l1-1 M那i豆功怕;K杨H斗11部醉if.h始1tlI，11主!;(D核，句 tlTtm),.tV.i 才军L相甜甜扭，li才纳布j片淀粉+注.t!示二!)O%I4株Jlmt，表示90%lj株为川仙。10
10、 PCR检测10.1 DNA提取1旧O.1 1 i将每分1离立与i纯化的销检I菌2药H饺真事利种l干l主剑1-11液体t珩击养基中以2犯8C1拯吊I床末士柏;410.1 2)垠议2m叫1让1.1衍古i检I囱执如士捎市养f液1 拉坦，120)r/min 月心1mill 收集在i休。反!叫咱I-1祟七Ij-fi+I氧化氧配jCAMP试验十v.p试验f氨限7/W!+n，尿般水W(，10.1.3拍休悬浮于500f.L门二缓冲液(11-18.0)(见A.3)，振荡玉兰、浮，1111人50f.L 10%的SDSj和液(见A川，101.20 mg/m L 1(Jlfil1附K(见A.日，混匀，37CII，1
11、j1 h.10.1.4川人l1JL5 0101/1.的NaCI济液(见人10)，充分iI匀，而)111人10011.CTA/NaCI m液(见A.6)，1昆匀，65ocn1U可20min。10.1.5 力加加n入号匀;f体牛i积1 只斗 f阳的H均j曲盼企钊A削仿J异j戊戈醉盹!，刊(2历5:2纠4;1门)(见A.II)，1浏i屁4匀，1山2000，旷/min7离王骂5心5 mi门川n1旧O.1.6 以坦七1，占与液j力川川j川川11人之斗穹?斗H休本J积j只u的i向甘氯鼠打仿7异异1.戊丸醉(24;l)(见A.12幻)，1说|陀4匀，:1山2000r旷Imi川n离心5 mino 10.1 7
12、 JljU 1，1液，川人l俯体41!异丙醉，颠倒混合，窒11t下的iJJ:10 min,10 000 r/min离心10min;沉淀川70%酒和洗涤2次，室温lUi(干。10.1.8 川人50fJ.L的11:缓冲前支持￥仰，-20C保存，备用。洼纬l凶I闪组DNA(IJjJJ可以采用附品化的lIiii基网盐1DNA挺Jri式剂企，J:iiJ!H且IYI二I方法ill1丁挝取。10.2 PCR tn曾10.2 1百|物16S rRNA基怀1DNA序列PCR扩均引物分j:IJ为27F;f11 1492R，引物)11元ili去fti子水稀释后于20C保存备用。10.2.2 PCR反应体系按照表4的
13、求，在PCRIi 1)111人相应的试剂，混匀后3000 r/min Ti心l0s.Jtll使川j元热盖的PCI，扩增仪，tlt;有反应l合物上11112淌矿物llli.设附性对!m，f11l;1性XOj!白，阳性对!R的f:Q;板)兀乳悦球TiW参二号j;株基|附IIDNA.I阴9归H山f性V表4PCR反应预i混昆物所需试f知剂p刊l与组成试剂50 I-.d体试开1终浓l且IOX PCR缓冲烛(亢Mg+)5.0 I 1 X PCR r:n ll1液MgCl(25 I11mol/l.)5.0 vL 2.5 mmol/L dNTPs(各10mmol/U 1.0,uL 800/lll101/1,I
14、物1(20 p.T11ol/1.)l.0 p.L o.!1111101/1.,I物2(20fJ-llloljU 1.01.o.,/llllol/L 灭凶且Y.?/*32.51.!aqDNA聚合附(5U/1.)0.51.2.5 U 注DNA悦jji(浓l盐JJJO ng/1.-100 ng/t,I.)J 1.01.。10.2.3 PCR反应条件i守反旦J;:IY:F PCR扩增仪，按下列程序且t行PCR扩增95Ci变性5min;94 oc变tl:1 min,55Cill 4 火1min，72C延fql2min，30个循环，72C延伸10min;4C保泪。10.2 4 琼脂糖凝胶电泳SC/T 72
15、35-2020 用1XTAE Il.缓冲液(见八7)阳市I1%rlJ);OI旨1乱rKC liJi列的某肉片:列l仁对，lnli1!，性99%，或者与Ge nl3,1I1 k数据库中已登足的无乳悦f;jJ:i1于列相|叶，可基本判定分同菌株为无孔ii球菌。10.3.3 在实扮结果有效的条例下，测定的16SrRNA基|大IDNA 1(Y1j(去除两揣引物后的lylj)与附隶。所列的基冈序列比)(;1同源性二三99%，或者与Genank数据库 1已按法的海)你i1球囱序列相同，可基本判定分f主i菌株为海!际iif非商。11 综合判定11.1 分离凶株价合9.10，2和10.3.2的规定，f:11定
16、为兀乳链球凶。11.2 分离hl株钊合9.10.3利110.3.3的规定，可判定为海豚ii球l捕。11.3 临床症状1:1合316771的规定流行料，且价合附录，分离i呈i株f.J合11.1 TI;i:1 1.2的要求，可归lJi:为罗非:.链球I捎病。r J SC/T 7235-2020 A.1 脑心浸液肉iw(IlHI)琼脂培养基11内心;(IH液粉末J)iUJrr 24tfijk 将上述成分浴IWfJ百l叫备平板。，CA2 蛋白JIIi、牛肉;11(K化俐:!;UI旨f.l节1*4号上述羊rtl或兔(l，A3 A.4 将0gl一保存。A.5 将蛋白阳p;:浴lfiif于双必7j(A 6
17、CrAIl/NaC溶液附录A(规范性附录)培养基和试JlJ配制方法无iJl且纤封i)加l入80mL 4.g N爪J浴存蚓1仰仰于8创oIn叫飞叶L双蒸/水k叶中，级悦j力加川Jf川n入lOgC 口rAll，.j罚吓刑刊1力加川J川1双7茨占y水k定丰容FE夺E巨100 m】L，室#站圳;tA 7 5OXT、AE电i泳示缓j冲申1液夜在400时，双蒸水中浴仰121g丁J1S碱，Jm人28.55mL冰乙险1150 m L O.5 mol/L ED丁A，再加IXX2提水定辛辛写5mL，室iI，1t保存。A.8 3%过氧化氢溶液6 30%过氧化氢浴液1.fi:m 7 K 100 mL 900 mL S
18、C/T 7235-2020 l吸取lOOmL 30%过氧化氢的液，括号子蒸ti水中，iJi匀，分装备用。A.9 七叶音培养基蛋IIJ陈七I叶利瞬间主氢二仰和J傲自主铁蒸mf水将L述jJ，5r泊仰后，121C:，rk;X:Th;i20 min,A.10 5 mol/L NaCI溶液将29.22 g NaCI(相对分子最58.44)浴fW!于80mL双茶水中，:PI川l双茄71.定容至100mL，i;il，il保存。5.0 g 3.0 g 1.0g 0.5 g m nu 泊A.11酣氯仿异戊醇(25:24:1)1号25休职的盼、24体积的氯仿和1体积的异戊醉混合日1I可，室1111储存于不透光。(
19、JNil，上f(ij)JIU TE 绥 l液，也4C保存。A.12氯仿异戊醇(24:1)将24休职的;j!仿和IH牛拟的异戊i，混合口Ilof，室前ll储存于不透光fl(JN1,A.13 澳盼蓝指示剂溶液(6X上样缓冲i在)1央四J)jv.100 mg，)1II双蒸水5mL，在Jmt下过夜，衔的解后fJj fiJ14j(胶树f25 g,1J11双蒸7K院f(f!后移入棋时疏的液中1m匀后定容至50mL，)m人NaOH持f液1淌，训至蓝色。7 SC/T 7235-2020.1 罗非鱼链球菌病的发生与流行:I I一鱼61球出i病是1 11l:J I起的封111平Uj;病。i虫病在我M9月:jnrl
20、季节，流行水瓶发病鱼的比亡卒百Ti主.2 宿主&!1;1 桑比克罗I鱼8 附录B(资料性附录)罗非鱼链球茵病流行特征l拙CSlrelOc(JCCUS川tiw:)感染，c.:Jj峰Wli函l;1J1fi:q的5)1 lil，发病率达20%30%，(/ureus)、英SC/T 7235-2020 附录C(资料性附录)无乳链球菌16SrRNA基因DNA的参考序列(Gcnanl毛登录号:A02357-1)gacgaacgct ggcggcgtgc ctrtalacatg clagtagaac gClgaggttt gglgtllaca 61 clagactgal gagltgcgaa cggglgag
21、tl acgcgtaggt m.lcctgcctc atagcggggg 121 aHlactat tg gaaacgatag ctaallccgc alaagagtaa I taac(lcatg ttagttiHl t 81 laaaggagca al tgct tcac tgtgag1lgg acctgcgt tg tat lagclag t tgglgaggl 241 aaa日gctcaccaaggcgacg atacalagcc gacctgagag gglgatcggc cacactggga 30 ctgag1cacg gcccagaclc clacgggagg cagcagt日gg
22、gaillcllcgg caatggacgg 36 1 aaglctgacc gagcaacgcc gcglgagtga agaaggtttl cggatcglaa agctclgtlg 121 I t agngaaga acgt 199t ag gaglggaaaa 1 ClaCCaagt gacgg1Jact aaccagaaag 48 1 ggacggctal clacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag glcccgagcg ttglccggal 541 ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtl ctt1aagl口gaagtlaaaggcag
23、tggctt 60 1 lccat tgta cgctt tggaa actggaggflc t tgagtgcag aaggggagag tgglat tcca 661 Iglgtagcgg Igtgcgl ag川atat.ggaggaacaccg gtggcgaaag cggctclct日721 gtctg1H1Ct gacgctgagg ctcgaagcg tggggagcaa acaggatlag ataccctggt 781 agtccacgcc glaaacgatg agtgctaggt gt raggccct ltccggggct tagtgccgca 84 1 gctaacgc
24、Ht laagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggltgaaac tcaaaggaat 90 1 tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggt ttaat lcgaagcaac gcgaagaacc 961 ttaccaggtc ttgaci-ltcct tctgaccggc ctagagatag gct t tctct t.cggagcagaa I 021 gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taaglcccgc 1 081 aacgagcgcl acccct
25、al tg t tagu gcca tClttaagll gggC.CtCta gcgagaclgc I 141 cggtaataaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaat.ca t.calgcccct tatgacctgg 1 20 I gctacacacg tgctacaatg gtlggtacaa cgagrcgcaa gccggtgacg gcaagclaat 1 261 clct lamlgc caatclcagt tcggat tgta ggctgcaacl cgcclacalg aagtcggaat 1 32 1 cgclgl日(1cgcggatcag c
26、acgccgcgg tgaatacgt 1 cccgggcctt gtacacaccg I 381 cccgtcacac cacgagagl t 19laacaccc gaagcgglg agglaacctt I taggagcca I 441 gccgccLaag gtgggataga tgal tggggt g 9 SC/T 7235-2020 附录D(资料性附录)海豚链球茵16SrRNA基因DNA的参考序列(GcnBank登录号:AF335572)gacgaacgct ggcggcgt-gc ctaatncatg caagwgaac gctgaggat 1 ggtgcllgca 61 c
27、taalccaaa gagttgcgaa cgggtgagla acgcgtaggt aacctacctc atagcggggg:1 21 ntaactat tg gaaacgatag ctlaU!Ccgc atgacaclag agt:lcacatg tact:1aall1 18 llaaggagca正lttgctlcactatgagatggIcctgcgttg ta1 tagcLag t tggtgaggt 211 aacggclcac caaggcgacg aLacatagcc gacctgagag gglgatcggc cacactggga 301 ctgagacacg gcccaga
28、cLc ctacgggagg cagcagtagg gaa tcttcgg caa tggacgg 36 aagtctgacc gagcaacgcc gcgl日agtgaagaagglttt cggatcgtaa agctcLgttg 421 ttagagaaga acgglaatgg gaglggaaaa lccat1acgt gacggtaact aaccagaaag 48 ggacggclaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatlcgtag gtctcgagcg ttgtccggat 51.1 ttatlgggcg taaagcgagc gcaggcggH clataa
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30、ccgca 811 gctaacgca t taagcact cc gccrggggag tacgaccgca aggttgaaac lcaaaggaa 1 901 tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagca t gtggt t taa t tcgaagcaac gcgaagaacc 96-1 ttaccaggtc ttgacatccc tctgaccgtc ctagagatag gattttcctt cgggacagag 021 gagacaggtg gtgcatggt I gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc J 08:
31、1 nacgagcgca acccclattg ttagltgcca lcattaagtl gggcaclcta gcgagactgc l141 cgglaataaa ccggaggaag glggggatga cgtcaaatca tcatgcccct latgacctgg 20 gctacacacg tgclacaatg gttggtacaa cgagtcgcaa gccggtgacg gcaagctaat 1 26 ctcttaaagc caatctcagt tcggattgta ggclgcaact cgcctacatg aagtcggaat 1 32 cgctagtaat cgcgg
32、atcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggccu gtacacaccg 1 38 cccgtcacac cacgagagtl tgtaacaccc gaagtcggtg aggt:aacctt ltaggagcca I 441 gccgcctaag gtgggataga tgattggggt g 10 ONON-BNh H川)SC!丁7235-20201 1可农业1.1版利rlll版Ut京市机IH归去子昕街18J，怯)x x 并网.hl:)It京印刷l一厂印刷新华IIJ,I;.!t);，发行J9i发行轩j也tJi华gJ.li1:t白(11邮政编刑100125 4民晤*.-:数20干.2020年12月JJ;tmI lX自Jjj;J自J1l J jl本880mm X1230mm 1/16 2020年12月第l版-=15号16109.8358 定价24.00元版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 SC!T