《SN∕T 1460-2015 输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法(出入境检验检疫).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SN∕T 1460-2015 输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法(出入境检验检疫).pdf（9页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 代替 输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犿犲 狋 犺 狅 犱 狊犳 狅 狉狑犲 狊 狋狀 犻 犾 犲狏 犻 狉 狌 狊犪 狀 犱犛 狋 犔狅 狌 犻 狊犲 狀 犮 犲 狆 犺 犪 犾 犻 狋 犻 狊狏 犻 狉 狌 狊犮 犪 狉 狉 犻 犲 犱犫 狔犻 犿狆 狅 狉 狋 犲 犱犿狅 狊 狇 狌 犻 狋 狅 犲 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准代替 输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法。本标准与 相比，主要变化
2、如下：增加了规范性引用文件；对生物安全要求进行了修订，删除了在生物安全级实验室的操作要求，增加了生物安全实验室设计原则、病毒核酸分子检测操作要求、实验室设施和设备，检测工作的安全防护和实验室废弃物处理的要求；对病毒核酸分子检测方法进行了修订，增加了实时荧光 方法；删除了附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郑剑宁、胡群、李红、裘炯良。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：。犛犖犜 输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法范围本标准规定了国境口岸输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒检测的生物安全要求
3、、检测对象、检测方法、结果的报告。本标准适用于检验检疫机构对输入性蚊类体内携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒检测和报告，对口岸发现的蚊类检测西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒也可参照执行。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法 实验室生物安全通用要求 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则术语和定义下列术语和定义适用于本文件。输入性蚊类犻 犿狆 狅 狉 狋 犲 犱犿狅 狊 狇 狌 犻 狋 狅 犲 狊通过入境交通工具、集装箱、货物及行李带入境内的库蚊
4、、伊蚊属蚊类。西尼罗病毒狑 犲 狊 狋狀 犻 犾 犲狏 犻 狉 狌 狊；犠犖犞西尼罗热的病原体，属黄病毒科黄病毒属，为单链病毒。西尼罗病毒分两个基因型，导致人类感染西尼罗病毒的分离株主要为型。主要分布于非洲、中东、西亚和北美。圣路易脑炎病毒犛 狋 犔狌 犻 狊犲 狀 犮 犲 狆 犺 犪 犾 犻 狋 犻 狊狏 犻 狉 狌 狊；犛犔犈犞圣路易脑炎的病原体，属黄病毒科黄病毒属，为单链病毒。主要分布于北美洲。缩略语下列缩略语适用于本文件。值：循环阈值（）：焦碳酸二乙酯（）：羧基荧光素（）犛犖犜 ：逆转录聚合酶链式反应（）：四甲基罗丹明（）检测对象输入性蚊类。生物安全要求实验室及检验应遵照以下生物安全要
5、求：）生物安全实验室设计原则应遵照 的规定。）实验室设施和设备应遵照 规定的 实验室要求。）实验室废弃物处理应遵照 对废物处置的要求。）检测工作的安全防护应遵照 型规定的二级生物安全个体防护要求。）病毒核酸分子检测检测操作要求应遵照相关国家标准的规定。病毒核酸分子检测 普通犚犜 犘犆犚方法和实时荧光犚犜 犘犆犚方法 仪器和设备需要如下仪器设备：）荧光定量仪；）仪；）二级生物安全柜；）普通冰箱；）超低温冰箱；）普通台式离心机；）高速冷冻离心机（离心力可达 犵）；）微量可调移液器（、）；）涡旋器；）电泳仪；）凝胶成像分析系统；）高压灭菌锅。主要试剂 除另有规定外，所有化学试剂均采用分析纯。实验用水
6、应符合 中一级水的规格。用于（包括核酸抽提）时所用的水应是无酶的水。核酸提取试剂为 总提取试剂或商品化的病毒提取试剂盒。引物和探针为根据表和表的序列进行合成引物和探针，加无酶的超纯水配制成 的储存液。犛犖犜 表普通犚犜 犘犆犚检测的引物病毒种类引物扩增片段大小 上游引物 ：下游引物 ：上游引物 ：下游引物 ：表实时荧光犚犜 犘犆犚检测的引物和探针病毒种类引物扩增片段大小 上游引物 ：下游引物 ：探针：上游引物 ：下游引物 ：探针：一步法普通 试剂盒采用德国 公司 ）。一步法荧光 试剂盒采用宝生物工程（大连）有限公司 （）。操作方法 样品预处理将采集的蚊虫样本，按只只或适量（不超过 只）为一组，
7、加入灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织匀浆密闭送检，或 以下保存待检。病毒核酸提取 犜 狉 犻 狕 狅 犾法取 处理好组织匀浆上清液 ，置于 离心管中，加入 ，再加入 三氯甲烷。混匀器上振荡混匀或颠倒混匀 次；离心 ，吸取上层液体，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置 ，离心 ，轻轻倒去上清液；加入 乙醇，颠倒洗涤，离心 ，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，弃尽液体或 离心，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量吸干液体，加入 水溶解。）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。犛犖犜 试剂盒提取法按商品试剂盒说
8、明书操作。普通犚犜 犘犆犚检测方法 反应体系检测输入性蚊类中西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的普通 反应体系见表。表普通犚犜 犘犆犚反应体系组分加样量倍浓度的一步 缓冲液 混合液（）上游引物（）下游引物（）无酶水 一步 酶混合物酶抑制剂样品反应体积 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照。阳性对照为和病毒株或根据和核苷酸序列通过载体构建和体外转录合成的片段，阴性对照为无酶的水。反应参数 ，反转录结束后，、，个循环，保存。犘犆犚产物的琼脂糖凝胶电泳检测取扩增产物用 的琼脂糖凝胶电泳（含 溴化乙锭，），并加分子量标准物作对照，推荐使用 （）。电泳池约，凝胶成像系统观察结果。实时荧光犚犜 犘犆犚检测方法 反应
9、体系检测输入性蚊类中西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的实时荧光 反应体系见表。表实时荧光犚犜 犘犆犚反应体系组分加样量倍浓度的一步 混合液 犜犪 狇酶 逆转录酶 上游引物（）犛犖犜 表（续）组分加样量下游引物（）探针（）荧光校正染料 无酶水 样品 反应体积 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照。阳性对照为和病毒株或根据和核苷酸序列通过载体构建和体外转录合成的片段，阴性对照为无酶的水。反应条件将加好样的反应管分别转移到荧光定量检测仪上进行扩增反应，程序设置为以 型全自动荧光定量检测仪）为例说明，将荧光信号设置为：报告荧光通道，淬灭基团荧光通道无，校正荧光通道。对于其他型号的荧光定量仪应按实际机型进行反应
10、程序设置，没有荧光通道的荧光定量仪，不进行的设置。一步法实时荧光 反应条件：，；，个循环；选择通道于 延伸时收集荧光信号。结果判定及报告 普通犚犜 犘犆犚对样品进行 检测，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，而样品未出现预期大小的扩增条带，则可判定样品中未检测到西尼罗病毒或圣路易脑炎病毒特异性基因。报告为“西尼罗病毒核酸阴性（普通 法）”或“圣路易脑炎病毒核酸阴性（普通 法）”。如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，而样品出现预期大小的扩增条带，则可判定样品中检测到西尼罗病毒或圣路易脑炎病毒特异性基因。报告为“西尼罗病毒核酸阳性（普通
11、法）”或“圣路易脑炎病毒核酸阳性（普通 法）”。实时荧光犚犜 犘犆犚 基线设定以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点或根据仪器噪音情况调整设定基线。质量控制反应结果应同时符合以下条件，否则试验视为无效：）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。犛犖犜 ）阴性对照无扩增曲线；）阳性对照 值 并有明显扩增曲线。结果判定及报告检验结果按以下要求判定和报告：）阴性：值为未检出或大于，且无明显扩增曲线，报告为“西尼罗病毒核酸阴性（荧光 法）”或“圣路易脑炎病毒核酸阴性（荧光 法）”。）阳性：检测样品 值，并有明显扩增曲线，报告“西尼罗病毒核酸阳性（荧光 法）”或“圣路易脑炎病毒核酸阳性（荧光 法）”。）检测样品出现荧光增幅曲线的 值介于 之间，应重新进行检测。若重新检测的 值仍介于 之间，并有明显扩增曲线，则按阳性结果报告，否则为阴性。犛犖犜 书 书 书 犜犖 犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲号（）北京市西城区三里河北街 号（）总编室：（）网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元